孫 琦, 孫慶元, 趙 悅, 李本富

(1.大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院,遼寧大連 116034; 2.大連隆鳳祥生態(tài)農(nóng)業(yè)科技有限公司,遼寧大連 116030)

桑葉的微生態(tài)發(fā)酵

孫 琦1, 孫慶元1, 趙 悅1, 李本富2

(1.大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院,遼寧大連 116034; 2.大連隆鳳祥生態(tài)農(nóng)業(yè)科技有限公司,遼寧大連 116030)

利用酵母菌、乳酸菌以及枯草芽孢桿菌按單菌和混合菌對桑葉進行微生態(tài)發(fā)酵。根據(jù)微生態(tài)桑葉發(fā)酵綜合評價指數(shù)確定發(fā)酵菌和發(fā)酵條件。將該條件下發(fā)酵的桑葉用于制作魚餌料,并觀測對魚生長的影響。結(jié)果表明,乳酸菌與酵母菌按1∶1比例混合、10%接種量、發(fā)酵溫度35℃、60 h、p H為8、60%的含水量時,發(fā)酵綜合評價指數(shù)最高。微生態(tài)桑葉發(fā)酵綜合評價指數(shù)影響由高到低順序為接菌量、含水量、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、p H。發(fā)酵桑葉可增加測試魚的體質(zhì)量和身長,同時可降低飼料系數(shù)。

微生態(tài);桑葉;發(fā)酵

0 引 言

桑葉含有黃銅、氨基酸、蛋白質(zhì)、多糖、鈣等多種營養(yǎng)成分[1]。微生態(tài)桑葉發(fā)酵實質(zhì)是利用枯草桿菌、酵母菌、乳酸菌等益生菌,以桑葉為初級營養(yǎng)物形成的營養(yǎng)共生關(guān)系。發(fā)酵可降解桑葉中的大分子物質(zhì),并可降低桑葉中的碳氮比。黃靜等[2]利用桑葉制備發(fā)酵動物飼料得到良好的效果。然而,微生態(tài)發(fā)酵產(chǎn)生CO2導(dǎo)致發(fā)酵物總量下降,蛋白和鈣的相對含量可能增加,多糖損失,難以評價微生態(tài)發(fā)酵效果。本研究利用桑葉進行微生態(tài)發(fā)酵并提出綜合評價指數(shù),以期綜合平衡并提高桑葉飼料中各項營養(yǎng)成分。

1 材料與方法

1.1 材 料

秋季桑葉,大連隆鳳祥生態(tài)農(nóng)業(yè)科技有限公司;酵母菌、乳酸菌、枯草芽孢桿菌,大連工業(yè)大學(xué)菌種保藏室提供。

1.2 方 法

1.2.1 菌液的制備

分別配制YEPD培養(yǎng)基、完全培養(yǎng)基及液體種子培養(yǎng)基后分別對酵母菌、乳酸菌以及枯草芽孢桿菌進行擴大培養(yǎng)。

1.2.2 微生態(tài)桑葉發(fā)酵條件的確定

分別取5 g干桑葉,按一定比例混合菌種接種和發(fā)酵條件進行微生態(tài)發(fā)酵,設(shè)3次重復(fù)。

乳酸菌和枯草芽孢桿菌菌數(shù)為109CFU/mL,酵母菌菌數(shù)為108CFU/m L,制成6種混合菌種。乳酸菌與酵母菌體積比1∶1(A);乳酸菌和酵母菌體積比3∶7(B);乳酸菌與枯草芽孢桿菌體積比1∶1(C);乳酸菌與枯草芽孢桿菌體積比7∶3 (D);酵母菌和枯草芽孢桿菌體積比1∶1(E);酵母菌與枯草芽孢桿菌體積比7∶3(F)。

在37℃、初始p H為7、含水量50%,分別按5%、10%、15%、20%、25%接種量接種,對桑葉進行48 h的發(fā)酵。

在初始p H為7、含水量50%,按所選接種量分別在20、25、30、35、40℃對桑葉進行48 h發(fā)酵。

在含水量50%,按所選接種量和發(fā)酵溫度,分別在初始p H為4、5、6、7、8發(fā)酵48 h。

在含水量50%,按所選接種量、溫度和初始p H,對桑葉分別進行12、24、36、48、60 h發(fā)酵。

按所選接種量、溫度、初始p H和發(fā)酵時間,分別以30%、40%、50%、60%、70%的含水量對桑葉進行發(fā)酵。

1.2.3 微生態(tài)發(fā)酵桑葉中多糖的測定

取微生態(tài)發(fā)酵干桑葉粉末1 g,利用微波提取法提取桑葉多糖,利用苯酚-硫酸法[2]測定多糖。以未發(fā)酵的等量干桑葉粉末作對照,繪制標準曲線。按公式(1)計算桑葉中多糖的質(zhì)量分數(shù):

式(1)中:w1為多糖質(zhì)量分數(shù),%;ρ為樣品溶液中葡萄糖質(zhì)量濃度,mg/m L;V為樣品的稀釋體積,m L;f為多糖換算因子;m1為樣品質(zhì)量,mg。以葡萄糖為標準品,得回歸方程:

式中:y為吸光度;x為多糖質(zhì)量,μg。

1.2.4 微生態(tài)發(fā)酵桑葉中鈣的測定

取微生態(tài)發(fā)酵干桑葉粉末0.2 g,利用高錳酸鉀標準溶液法[4]對微生態(tài)發(fā)酵桑葉中的鈣進行測定,以未發(fā)酵的等量干桑葉粉作對照。

按公式(2)計算桑葉中鈣的質(zhì)量分數(shù):式(2)中:w2為鈣的質(zhì)量分數(shù),%;c1為KMn O4摩爾濃度,mol/L;V為KMn O4的體積,m L;M為鈣的摩爾質(zhì)量,g/mol;m2為樣品質(zhì)量,g。

1.2.5 微生態(tài)發(fā)酵桑葉中蛋白質(zhì)的測定

取微生態(tài)發(fā)酵干桑葉粉末3 g,采用凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)。將硼酸液用0.01 mol/L HCl標準溶液滴定至終點即灰紫色,以未發(fā)酵的等量干桑葉粉末作對照。

按公式(3)計算桑葉中蛋白質(zhì)的質(zhì)量分數(shù):

式(3)中:w3為蛋白質(zhì)的質(zhì)量分數(shù),%;為c2為鹽酸標準溶液的濃度,mol/L;V1為空白滴定消耗標準液量,m L;V2為試劑滴定消耗標準液量, m L;m3為樣品質(zhì)量,g;F為蛋白質(zhì)系數(shù)(一般為6.25);0.014為N的摩爾質(zhì)量,g/mmol。

1.2.6 微生態(tài)發(fā)酵綜合評價指數(shù)的計算

選取微生態(tài)發(fā)酵時間為48 h的發(fā)酵干桑葉測定多糖、鈣和蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù),即確定3個評價指標。通過變異系數(shù)法[5]計算相應(yīng)的權(quán)重和微生態(tài)發(fā)酵綜合評價指數(shù),確定最佳發(fā)酵條件。

式(5)、(6)中:σi表示第i項指標的標準差;Vi表示第i項指標的變異系數(shù),即標準差系數(shù);Ti表示各指標的權(quán)重。

1.2.7 微生態(tài)桑葉的應(yīng)用

將微生態(tài)干桑葉粉末按質(zhì)量分數(shù)0、20%、40%、60%、80%、100%混合到魚食中[6],飼養(yǎng)孔雀、金球、黑瑪麗于3個魚槽中,每槽5條魚。記錄初始和處理魚的體質(zhì)量,喂食量控制在0.2 g/d,5 d為一個周期。每個周期后,通過測定魚的增重率(WGR)、生長比率(SGR)以及飼料系數(shù)(FCR)來判斷發(fā)酵桑葉的應(yīng)用效果[7],用未發(fā)酵的等量干桑葉粉末作對照,重復(fù)3次。

式中:mt為飼養(yǎng)后魚的體質(zhì)量,g;m0為魚的初始體質(zhì)量,g;mf為飼料總消耗量,g;t為飼養(yǎng)時間,d。

2 結(jié)果與分析

2.1 微生態(tài)桑葉發(fā)酵綜合評價指數(shù)分析

2.1.1 單個菌種對微生態(tài)桑葉發(fā)酵綜合評價指數(shù)的影響

桑葉在微生態(tài)發(fā)酵后,與未接菌相對比,發(fā)酵綜合評價指數(shù)明顯增加;在接種乳酸菌時,綜合評價指數(shù)為9.82,比接種酵母菌時的9.52及接種枯草芽孢桿菌時的9.35高。

2.1.2 混合菌種對微生態(tài)桑葉發(fā)酵綜合評價指數(shù)的影響

如圖1所示,桑葉在乳酸菌和酵母菌等體積混合時,綜合評價指數(shù)為10.04,比接種其他組合菌顯著增高。當(dāng)乳酸菌和酵母菌等體積混合發(fā)酵時,發(fā)酵桑葉的綜合評價指數(shù)比只接種乳酸菌時的綜合評價指數(shù)高0.22,即乳酸菌與酵母菌等體積混合時的桑葉發(fā)酵綜合評價指數(shù)最高。

2.1.3 不同發(fā)酵因素對桑葉發(fā)酵指數(shù)的影響

按“1.2.2”的方法,測定不同發(fā)酵因素對發(fā)酵指數(shù)的影響,結(jié)果如圖2所示。由圖2可以看出,在接種量為10%(圖2(a))、35℃(圖2(b))、培養(yǎng)時間為60 h(圖2(c))、p H=8(圖2(d))、含水量為60%(圖2(e))時,發(fā)酵桑葉的綜合評價指數(shù)最高,分別為10.27、9.71、9.8、9.67、9.88。

圖1 不同比例混合菌種的微生態(tài)桑葉發(fā)酵綜合評價指數(shù)Fig.1 CEI for two strains micro-ecological fermentation in different ratios of mulberry leaves

圖2 不同發(fā)酵因素對微生態(tài)桑葉發(fā)酵綜合評價指數(shù)的影響Fig.2 The effects of different fermentation factors on the CEI for micro-ecological fermentation of mulberry leaves

2.2 微生態(tài)桑葉對魚生長情況的影響

2.2.1 發(fā)酵桑葉對魚生長質(zhì)量的影響

如表1所示,隨著桑葉添加量逐漸增大,魚的體質(zhì)量均增大,當(dāng)桑葉質(zhì)量分數(shù)達到80%以上時,魚的體質(zhì)量增加量減小。

2.2.2 發(fā)酵桑葉對魚增重率的影響

從圖3中可以看出,發(fā)酵桑葉添加量為20%～60%時,3種魚的平均增重率隨桑葉添加的增加而增大,分別增加了2.27%、2.9%、3.04%;之后平均增重率逐漸減小,添加量為80%～100%時,3種魚平均增重率增加了2.69%和0.74%。

2.2.3 發(fā)酵桑葉對魚生長比率的影響

從圖4中可以看出,發(fā)酵桑葉添加量為20%～60%時,3種魚的平均生長比率隨桑葉添加的增加而增大,分別增加了0.42%、0.54%、0.57%;之后平均生長比率逐漸減小,添加量為80%～100%時,3種魚平均生長比率增加了0.52%和0.15%。

表1 發(fā)酵桑葉對魚生長質(zhì)量的影響Tab.1 The effects of the fermented mulberry leaves on the growth of fish

圖3 發(fā)酵桑葉添加量對魚增重率的影響Fig.3 The effects of the fermented mulberry leaves amount on the weight growth rates of fish

圖4 發(fā)酵桑葉添加量對魚生長比率的影響Fig.4 The effects of the fermented mulberry leaves amount on the growth ratios of fish

2.2.4 發(fā)酵桑葉對飼料系數(shù)的影響

圖5 發(fā)酵桑葉添加量對飼料系數(shù)的影響Fig.5 The effects of the fermented mulberry leaves amount on the feed coefficient index

從圖5中可以看出,3種魚的平均飼料系數(shù)隨桑葉添加量的增加而增大,添加量在20%～80%,平均飼料系數(shù)依次減少了1.88%、2.78%、2.63%、7.47%、4.49%,發(fā)酵桑葉添加量為80%時飼料系數(shù)減少最大。

3 結(jié) 論

在乳酸菌和酵母菌等量接種、接菌量10%、培養(yǎng)溫度35℃、發(fā)酵時間60 h、初始p H為8、含水量60%時,微生態(tài)發(fā)酵綜合評價指數(shù)最高。微生態(tài)發(fā)酵綜合評價指數(shù)可作為評價桑葉發(fā)酵程度的指標,對平衡發(fā)酵桑葉中多糖、鈣及蛋白質(zhì)含量有指導(dǎo)意義。將發(fā)酵桑葉應(yīng)用于魚飼料時,發(fā)酵桑葉可以加速魚體的代謝及消化作用,使得魚體對營養(yǎng)物質(zhì)更好地吸收利用。

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Micro-ecological fermentation of mulberry leaves

SUN Qi1, SUN Qingyuan1, ZHAO Yue1, LI Benfu2
(1.School of Biological Engineering,Dalian Polytechnic University,Dalian 116034,China; 2.Dalian Long Phenix Eco-agricultural Technological Company Limited,Dalian 116030,China)

Solid microbial fermentations for mulberry leaves were conducted with yeast,lactobacillus and bacillus subtilis respectively or mixtures of their two.The strains and fermentation conditions were determined according to the comprehensive evaluation indexes(CEI)for micro-ecological fermentation of mulberry leaves.The fermented mulberry leaves were used in fish feed to examine their effects on fish growth.The results showed that the optimal fermentation conditions were 10%of inoculation with the equal amount of yeast and lactobacillus,35℃,60 h,p H 8,water content of 60%.The descending order of CEI was inoculation amount,water content,time,temperature,p H.The weights and sizes of tested fish increased when the fermented mulberry leaves used in feed,while the feed coefficient index decreased.

micro-ecological;mulberry;fermentation

Q939.96

A

1674-1404(2017)01-0019-04

2015-10-15.

孫琦(1990-),女,碩士研究生;通信作者:孫慶元(1957-),男,教授.

孫琦,孫慶元,趙悅,李本富.桑葉的微生態(tài)發(fā)酵[J].大連工業(yè)大學(xué)學(xué)報,2017,36(1):19-22.

SUN Qi,SUN Qingyuan,ZHAO Yue,LI Benfu.Micro-ecological fermentation of mulberry leaves[J].Journal of Dalian Polytechnic University,2017,36(1):19-22.