李晨歌

(隴東學院農(nóng)林科技學院，甘肅慶陽745000)

漆酶及其應用研究進展

李晨歌

(隴東學院農(nóng)林科技學院，甘肅慶陽745000)

漆酶是一種含銅的多酚氧化酶，在造紙、食品、環(huán)境治理以及生物能源等方面有廣泛的應用。介紹了漆酶的結構特征、催化機制、活性影響等因素，討論了其工業(yè)化生產(chǎn)應用狀況，并展望了漆酶的應用前景。

微生物漆酶；異源表達；工業(yè)化生產(chǎn)；細菌漆酶

漆酶(laccase，ECl．10．3．2)是一種含銅的多酚氧化酶(polyphenol oxidases，PPO)，被抗壞血酸、胺類、O2催化酚類等物質氧化后，最終生成相應的產(chǎn)物與水。過氧化物酶、酪氨酸酶等與漆酶協(xié)同組成了酚類氧化酶群體，廣泛存在于自然界中。同時，血漿銅藍蛋白(ceruloplasmin)、抗壞血酸氧化酶(ascorbate oxidase，AAO)、漆酶(Laccase)等多種類型的酶，均是藍色多銅氧化酶家族的成員之一[1]。

人們在研究中發(fā)現(xiàn)漆酶不僅存在于高等植物中[2]，同時在微生物中也廣泛地存在?？茖W家發(fā)現(xiàn)擔子菌中的白腐菌[3]是最重要的生產(chǎn)者。Alexandre[4]等人對細菌基因組和蛋白質的數(shù)據(jù)庫進行同質性研究分析，發(fā)現(xiàn)原核生物中也有漆酶的存在。

1 微生物漆酶的分布及其生理功能

微生物漆酶在自然界中大量存在，大量落葉覆蓋的林區(qū)土壤中，污水處理廠周圍的活性泥污中，河流及葡萄酒酒廠中的污水，水稻等作物的根部，被有機物垃圾、有機染料、石油污染的土壤、海洋，紡織廠的工業(yè)廢水和造紙廠的木質纖維廢水等等。

目前，真菌漆酶中的擔子菌和子囊菌是人們集中研究的熱點，而擔子菌中的白腐菌是目前原核和真核微生物中所知的唯一能夠自身利用氧化酶系統(tǒng)將纖維木質素降解為二氧化碳的一種真菌。此外，真菌漆酶也是部分致病真菌的毒性成分之一，在真菌的分化、色素的形成中發(fā)揮著重要的作用。與真菌漆酶相比，細菌漆酶反應條件及動力學特征截然不同，其反應速度相比會變得很慢，銅離子被認為是一個必要因素，因此細菌漆酶通常被稱為“多銅氧化酶”或“多酚氧化酶”，時常也被定義為漆酶類似物(1accase-like)。

2 漆酶的結構特征和催化機制

大量的研究表明，真菌漆酶和細菌漆酶均是以單蛋白體形式存在的糖蛋白，通常情況下這些蛋白的分子量相差較大，而且糖基化的程度也存在差異，可是真菌漆酶與細菌漆酶的蛋白結構大體相似，均為球狀結構，分別由三個杯狀(cupredoxin-like)結構域構成，且每個結構域中都含有β的圓桶狀結構。

鈔亞鵬，錢世鈞[5]等人依據(jù)對漆酶晶體衍射、動力學和光譜學的研究中發(fā)現(xiàn)，一般漆酶蛋白結構中含有4個銅原子(圖1)，這4個Cu2+共同構成了漆酶催化反應中的活性中心。這4個銅離子有三種形式存在，即T1Cu銅原子，T2Cu銅原子和T3Cu銅原子。T1Cu銅原子的周圍由一個半胱氨酸和組氨酸構成，T1Cu銅電子在順磁共振光譜(Electronic Paramagnet Resonance，EPR)的可見光區(qū)顯示4條電子轉移條帶，其中由Cys→T1Cu出現(xiàn)的條帶亮度最大，這是漆酶顯示藍色的主要原因。T2Cu是由兩分子的咪唑和一分子的水配位形成的一種四面體幾何構型。人們發(fā)現(xiàn)EPR光譜中含有極寬的超精細裂分。TCu3a，TCu3b與一個氫氧化物分子和三個組氨酸分子一起共同構成一種受阻的四面體幾何構型，氫氧化物做為橋將兩個Cu2+連在一起。由于Cu-Cu共價體可以產(chǎn)生強烈的反鐵磁性的特性，因此很難檢測到EPR光譜信號。

圖1 漆酶13H9的結構

漆酶催化各種底物的反應方式可能如下：首先，反應底物與處于酶活性中心的T1Cu銅原子位點相結合，且經(jīng)過Cys-His途徑將底物-T1Cu銅原子傳遞到由T2Cu和T3Cu結合構成的三核位點上，該三核位點接著將電子傳遞給已結合在活性中心的第二底物氧分子上，最終還原產(chǎn)生水。在整個反應過程中，漆酶的充分還原需要有連續(xù)不斷的單電子氧化作用來滿足。此時，處于還原態(tài)的酶分子再通過將四個電子轉移傳遞給分子氧，最終氧化反應生成水。因此漆酶又被稱為分子電池。

3 微生物漆酶活性的影響因素

3.1 pH值

一般情況下，每種漆酶氧化底物的時侯，都會有一個特定的pH值區(qū)間。且不同的氧化底物則所測到的pH值區(qū)間也不同，這可能是不同的底物參與了改變漆酶活性中心周圍酸堿基團離解狀態(tài)的原因。同時，發(fā)現(xiàn)一定范圍內(nèi)pH值的浮動變化會不同程度地影響漆酶的可逆變性，一旦超過一定的pH值區(qū)間范圍，漆酶則會不可逆地失活，使漆酶的催化活性受到影響。一般情況，真菌漆酶與細菌漆酶的pH值范圍存在差異，且真菌漆酶的pH值范圍偏向酸性，細菌漆酶則偏向中性和堿性，從而細菌漆酶更偏向應用于工業(yè)化的生產(chǎn)。同時，人們發(fā)現(xiàn)不同種屬的漆酶其pH值范圍也不同，且漆酶反應中，作用底物不同其最適pH值也不同。Chunjuan Gu[6]等人從Coprinuscomatus中克隆到Lac3和Lac4，通過不同的底物ABTS，愈創(chuàng)木酚，2，6-二甲氧基苯酚，丁香醛連氮，分別測得最適反應pH值分別為3.0、5.0、5.0、6.0和3.0、5.0、5.0、6.2。

3.2 溫度

漆酶的酶促反應中，溫度是影響漆酶活性的關鍵因子之一。一般情況下，剛開始反應時，酶促反應的速率會隨溫度的升高而增大，當達到一定值后則會隨溫度升高而逐漸降低，甚至失活。通常，真菌漆酶的熱穩(wěn)定性不強，50℃下反應數(shù)分鐘后其活性喪失。學者Jordan等人從嗜熱白腐菌菌株中獲得一株在60℃的條件下反應9h仍保持完整酶活的耐高溫漆酶菌株。然而，細菌漆酶的熱穩(wěn)定性則顯著高于真菌漆酶，中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術研究所的余小霞[7]等人發(fā)現(xiàn)漆酶CotA在60℃保溫90min后仍有71.70%的剩余酶活。

3.3 金屬離子

大多數(shù)金屬離子(Cu2+、Ca2+、Fe2+、Mn2+、K+、Na+、Hg+、Zn2+、Pd2+、Pb2+、Co2+、Ba2+、Ni2+、Cd2+、AI3+、Fe3+、Pt4+)不同程度地影響漆酶的活性。大量報道稱，一定濃度的Cu2+可以促進漆酶的活性，而裴佐蒂[8]通過對灰蓋鬼傘漆酶在畢赤酵母中的異源表達分析發(fā)現(xiàn)，Cu2+不能促進重組漆酶，反而在10mM時抑制重組漆酶的活性。我們在研究漆酶Lac13H9的酶學性質時發(fā)現(xiàn)，不同終濃度的銅離子(0.05mM、0.1mM、0.25mM、0.5mM、1mM、5mM、10mM)，對漆酶的剩余酶活分別為110%、200%、100%、42%、38%、35%、30%，即低濃度促進，高濃度抑制。這也可能是因為不同的漆酶結構所需要Cu2+的濃度閾值有關。Matthias Gunne[9]等人研究不同的漆酶自身所含有的銅離子個數(shù)不一樣，從1～9不等，當外源銅離子在一定的閾值范圍內(nèi)，則促進酶的活力，超過一定的范圍則對漆酶的反應不敏感，甚至起抑制作用。

也有報道發(fā)現(xiàn)，由于漆酶自身構造上的差異，同一種金屬離子對不同的漆酶表現(xiàn)不同的作用，如K+對大多數(shù)漆酶有激活作用，但對漆酶CotA有較強的抑制作用；Cu2+是大多數(shù)漆酶的激活劑，但對灰蓋傘菌漆酶(Coprinopsiscinerea)則表現(xiàn)出了一定的抑制作用。

4 微生物漆酶基因的克隆

目前，報道克隆得到的漆酶基因有60余種，同時發(fā)現(xiàn)一些漆酶得到了表達，部分已經(jīng)克隆到的漆酶基因如表1所示。

5 漆酶基因的重組表達

由于漆酶的本身性質，很難實現(xiàn)表達，且表達量很低。近年來，漆酶在不同的宿主菌中通過異源表達來提高表達量，部分有關原菌株和表達宿主的相關數(shù)據(jù)如表2所示。

表1 已克隆到的漆酶基因

表2 漆酶基因的重組表達

6 漆酶的工業(yè)化應用

6.1 環(huán)境保護

目前，有機農(nóng)藥的使用和大量印刷廠的廢水已成為當前工業(yè)領域最重要的水體污染之一。有報道稱漆酶可以在一定程度上對染料進行脫色降解。北京大學陳輝[10]等人在對漆酶催化氯酚類有機物的降解研究結果表明，漆酶可以不同程度地對三種氯酚類有機物(2，4-二氯酚、4-氯酚和2-氯酚)進行降解，降解率分別為94%、75%和69%，由此可見漆酶的確對氯酚類有機物有不同程度的降解作用。武漢科技大學任大軍等人對漆酶在共基質體系下吲哚的去除進行了大量研究后發(fā)現(xiàn)，在含有苯酚的反應體系中，漆酶去除吲哚的效果更加顯著，并且發(fā)現(xiàn)漆酶在去除共基質中的吲哚和苯酚的同時，苯酚的存在也進一步促進漆酶對吲哚的去除，兩者相互協(xié)調共同作用。Chunjuan Gu[11]等人從Coprinuscomatus中克隆到Lac3和Lac4，發(fā)現(xiàn)對13種不同的有機染料均有不同程度的降解，且Lac3的降解率均略高于Lac4。同時，我們又在降解體系中加入中介體HBT與未加中介體的對照，發(fā)現(xiàn)加入中介體HBT的降解率均明顯高于未加中介體的，甚至有些降解率提高到了98%；將細菌漆酶Lac13H9和真菌漆酶Lac 3協(xié)同作用一起研究對染料孔雀石綠(MG)的降解作用時發(fā)現(xiàn)，當僅有細菌漆酶Lac13H9參與降解染料12h后，降解率幾乎僅有5%左右；而在細菌漆酶Lac13H9的基礎上加入中介體HBT時，降解率為40%；將細菌漆酶Lac13H9和真菌漆酶Lac3混合不加中介體，12 h的染料降解率為70%，而在兩種漆酶混合的基礎上加入中介體HBT時，其降解率在12h后為94%，因此將細菌漆酶和真菌漆酶一起協(xié)同作用的基礎上，添加中介體是高效降解染料的一種新的研究趨勢。

6.2 造紙工業(yè)

通過漆酶參與的生物制漿工藝與傳統(tǒng)的化學方法相比，在降低能耗大和節(jié)約設備的基礎上，進一步避免了傳統(tǒng)化學方法降解木質素時不夠徹底的問題。與此同時用漆酶進行的生物制漿也避免了傳統(tǒng)的氯法漂白產(chǎn)生廢水污染和漂白后的紙張極易反彈等一系列的弊端現(xiàn)象，顯著調高了紙張的質量和強度。

由于漆酶自身含有可以通過氧化作用降解木質素的結構域，因此在生物制漿、木質纖維素污染的環(huán)境治理等方面均有潛在的商業(yè)價值。在整個木質素的降解中，細菌和真菌相互協(xié)同作用發(fā)揮降解作用。首先，細菌介入初期的降解反應，在木質素降解早期，經(jīng)過自身初級代謝產(chǎn)物作用于木質纖維物質，從而使其發(fā)生改性，接著真菌漆酶參與后續(xù)的降解工作，通過自身的高氧化還原電勢的作用，開始高效地分解木質纖維素。由于漆酶的氧化還原電勢一般較低的原因，一方面Jausovec[12]等人通過在漆酶的結構中引入羧基和醛基基團來改善漆酶的電勢，為更好地氧化纖維素做了基礎的研究；另外，在反應體系中常常需要加入少許低分子質量的化合物作為中介體參與反應，常見的有ABTS、HBT等。這些中介體在氧化還原過程中起到傳遞電子的作用，從而使木質素聚合或降解。在當前的研究中發(fā)現(xiàn)，漆酶有效介體中除典型的HBT和ABTS外，鹽酸異丙嗪(PTC)、2-亞硝基-1-萘酚-4-磺酸(HNNS)、N-羥基乙酰苯胺(NHA)等含有-NO、-NOH基團的化合物也是漆酶的有效介體[13,14]，可是中介體的價格問題一直是困擾工業(yè)化生產(chǎn)的關鍵因素，今后還需要尋找價格低廉的中介體以利于大量的工業(yè)化生產(chǎn)。Fernandez[15]等人通過商業(yè)漆酶的治療，實現(xiàn)了漆酶在商業(yè)貼面板方面的應用。疏水化合物(沒食子酸月桂醇酯)通過一個商業(yè)漆酶酶治療，只有當漆酶存在于木材治療時可以更好地增加木材的疏水化作用，從而增加木材表面的疏水性，實現(xiàn)了與疏水化合物沒食子酸月桂醇酯更好的結合，有助于改善木材表面疏水性的永久性。

6.3 食品工業(yè)

在食品工業(yè)中，漆酶的研究涉及到各種果汁、葡萄酒、啤酒等的生產(chǎn)、釀造等多個領域。因為果汁、酒類中含有芳胺類或酚物質，因此在其儲存期通常會出現(xiàn)渾濁、沉淀的現(xiàn)象。由于漆酶具有降解酚類有機物的特性，麥芽汁經(jīng)過漆酶適當?shù)奶幚砗螅渲械姆颖谎趸?，則有助于提高果汁及酒類的透明度和口感質量。啤酒和葡萄酒通過經(jīng)固定化酶的處理，將酚類等物質除去，從而能夠長期地儲存并長久保持澄清狀態(tài)。同時王歲樓[16]等研究發(fā)現(xiàn)，漆酶在加速食藥用菌制種過程中的木質素的分解方面也有應用。

6.4 紡織工業(yè)

在紡織工業(yè)中，漆酶已經(jīng)顯示出強大的優(yōu)勢和發(fā)展?jié)摿?。根?jù)漆酶對染料降解的原理,在紡織染整方面主要用于染色織物上浮色的生物酶洗、牛仔服裝的仿舊整理、印染廢水的脫色和棉織物的生物漂白。固定化的漆酶酶洗工藝可以替代傳統(tǒng)的皂洗工藝,有效去除純棉針織染色后表面浮色，從而提高織物的濕處理牢度，并進一步降低后處理殘液的色度，大大減輕印染廢水處理的負擔，有利于生態(tài)環(huán)境保護[17]。

6.4 生物技術領域

在生物監(jiān)測方面，主要體現(xiàn)在免疫檢測和生物傳感器兩個方面。免疫檢測過程中，漆酶可能將替代辣根過氧化物作為新的標記酶。Ghindilis[18]等人依據(jù)漆酶在催化反應過程中能夠消耗O2轉化產(chǎn)生電信號，而該信號又容易被高靈敏檢測的機理，通過運用DEAE-纖維素固定漆酶，制成不同類型的高活力的穩(wěn)定器，用來監(jiān)測監(jiān)視茶葉中茶酚的情況，并且這種類型的高靈敏度傳感器可以被用來對來自石油、煤炭、天然氣，頁巖氣等工業(yè)中酚類等物質的監(jiān)測。Babadostu[19]等人對漆酶的固定化作用進行大量的分析研究，通過利用漆酶的固定化與納米磁石的結合實現(xiàn)了精確檢測酚類化合物的前景。

在指示劑方面，由于漆酶在催化反應的過程當中可以形成有色產(chǎn)物，如ABTS氧化時可產(chǎn)生從淺綠到深綠的不同有色產(chǎn)物，因此可以制造滲漏指示劑和保鮮指示劑。

在生物能源方面，主要利用漆酶作為催化劑，將燃料的化學能轉化為電能從而制造生物燃料電池。目前生物燃料電池仍然存在著工作壽命短的問題，還需大量細致地研究。Schubert[20]等人通過設計人工神經(jīng)網(wǎng)絡(ANN)和遺傳算法(GA)獲得更精確的的各項指標來預測和改造以漆酶為中介體的氧化還原系統(tǒng)，這種系統(tǒng)可以在氧化生成碘方面進行應用，在工業(yè)化應用方面具有潛在的價值。

漆酶還在有機物的合成，非抗體淄醇類藥物和抗癌藥物的生產(chǎn)，樹脂材料[21]等方面均有著廣闊的潛在應用前景。

7 結語

迄今為止，漆酶的發(fā)現(xiàn)歷史已有140多年，經(jīng)過各國科學家的不懈努力，漆酶的研究工作已取得重要的進展，生化研究、三維結構、催化機理等都有了進一步的研究。目前已有60余種漆酶的基因被克隆并獲得進一步分析，其中一些已實現(xiàn)了異源表達。但是依舊存在很多的難題亟待解決，一方面漆酶異源表達調控的相關機理研究還未突破，另一方面，距離漆酶的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)還需要時間?？梢灶A見，今后一段時期的工作主要集中在探索研究漆酶新的表達途徑以及選擇新的表達宿主，并且通過基因敲除、誘變等基因工程技術尋找高表達，并且能夠應用于大量工業(yè)化生產(chǎn)的漆酶菌株上。

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【責任編輯 趙建萍】

Research Progress in Laccase and Its Application

LI Chen-ge

(CollegeofAgricultureandForestry,LongdongUniversity,Qingyang745000,Gansu)

Laccase is a kind of polyphenol oxidase containing copper, which is widely used in paper making, food, environmental management, biological energy and other industries. The present paper introduces the structural characteristics, catalytic mechanism, active influence and other factors of laccase, discusses its application of industrial production and forecasts its future applications.

microbial laccase; recombinant expression; industrialized production; bacterial laccase

1674-1730(2017)01-0062-05

2016-02-23

李晨歌(1989—)，女，甘肅慶陽人，助教，碩士，主要從事植物保護及生物方向研究。

Q814

A