徐 寧 辛嘉英 王 艷 竇博鑫 夏春谷

(1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 哈爾濱 150076； 2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院， 哈爾濱 150030；3.中國(guó)科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究院羰基合成與選擇氧化國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 蘭州 730030)

基于生物催化法的食品熏蒸劑環(huán)氧乙烷制備

徐 寧1,2辛嘉英1王 艷1竇博鑫1夏春谷3

(1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 哈爾濱 150076； 2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院， 哈爾濱 150030；3.中國(guó)科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究院羰基合成與選擇氧化國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 蘭州 730030)

為了探索一種反應(yīng)條件溫和、方法簡(jiǎn)單的食品熏蒸劑環(huán)氧乙烷制備方法，采用甲基彎菌IMV 3011(MethylosinustrichosporiumIMV 3011)細(xì)胞作為生物催化劑，催化乙烯的環(huán)氧化反應(yīng)生成環(huán)氧乙烷，確定了反應(yīng)條件。結(jié)果表明：反應(yīng)器中氣相的組成為氧氣50%、乙烯20%、氮?dú)?0%(體積分?jǐn)?shù))，30℃、150 r/min 振蕩反應(yīng)8 h，采用固定化形式催化劑，環(huán)氧乙烷生成量為34 μmol/mg，利用甲烷培養(yǎng)對(duì)其循環(huán)再生，再生8次催化劑中甲烷單加氧酶(MMO)活力仍保留89%，環(huán)氧乙烷物質(zhì)的量為3.4 nmol。

食品熏蒸劑； 環(huán)氧乙烷； 甲烷氧化菌； 生物催化劑； 環(huán)氧化反應(yīng)

引言

環(huán)氧乙烷可用作熏蒸劑使用[1]，環(huán)氧乙烷熏蒸無(wú)氣體殘留且不對(duì)金屬產(chǎn)生腐蝕，可殺滅內(nèi)孢子類細(xì)菌和大多數(shù)真菌[2]，現(xiàn)在被廣泛用于不能進(jìn)行高溫處理的食品滅菌[3]。

目前，環(huán)氧乙烷的制備采用過(guò)渡金屬或納米金為催化劑將乙烯直接氧化，為了將乙烯和環(huán)氧乙烷的易燃性降到最低，制備過(guò)程中需要控制原料乙烯的濃度以及充入甲烷、氬氣、氮?dú)獾榷栊詺怏w，這導(dǎo)致產(chǎn)物不易分離[4]。此外，由于反應(yīng)溫度高達(dá)200℃以上，乙烯易被徹底氧化生成二氧化碳，會(huì)對(duì)環(huán)境造成危害，而且原料乙烯向二氧化碳的轉(zhuǎn)化也會(huì)造成經(jīng)濟(jì)損失[5]。生物催化劑參與的反應(yīng)條件溫和、專一性強(qiáng)、方法簡(jiǎn)單[6]，為解決化學(xué)催化法制備環(huán)氧乙烷產(chǎn)生的問(wèn)題提供了一種新思路。

甲烷單加氧酶(MMO)是甲烷氧化菌代謝途徑中最重要的一種酶，可以催化烯烴環(huán)氧化，且具有較高的產(chǎn)物專一性和光學(xué)立體選擇性[7-8]。由于純MMO酶穩(wěn)定性差、催化反應(yīng)時(shí)還需要輔酶參與，因此，甲烷氧化菌細(xì)胞能更好、更有效地催化烯烴的環(huán)氧化反應(yīng)。以前的研究工作一般以催化丙烯環(huán)氧化反應(yīng)為主[9-17]，同時(shí)借助固定化、半連續(xù)化、連續(xù)化等手段，確定其在實(shí)際生產(chǎn)上應(yīng)用的可能性。然而，未見(jiàn)利用生物催化劑催化乙烯環(huán)氧化制備環(huán)氧乙烷的研究報(bào)道。不過(guò)，生物催化劑催化乙烯環(huán)氧化與催化丙烯環(huán)氧化具有相同的化學(xué)機(jī)制。為此，在課題組前期研究的基礎(chǔ)上，本文以甲基彎菌IMV 3011(MethylosinustrichosporiumIMV 3011)細(xì)胞為生物催化劑，催化乙烯環(huán)氧化制備環(huán)氧乙烷，探索生物法制備環(huán)氧乙烷的新途徑。

1 制備原理

圖1 生物法制備環(huán)氧乙烷的原理Fig.1 Schematic of biocatalytic method for producing epoxyethane

2 材料與方法

2.1 材料與儀器

甲基彎菌IMV 3011(MethylosinustrichosporiumIMV 3011)由俄羅斯科學(xué)院催化研究所提供；發(fā)酵培養(yǎng)基采用NMS培養(yǎng)基，按文獻(xiàn)[18]配制。

甲烷、乙烯、丙烯氣體(純度99.99%，哈爾濱卿華氣體有限公司)；環(huán)氧乙烷標(biāo)樣(色譜純，AccuStandard公司)；40目活性炭，哈爾濱天賜活性炭有限公司；實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純。

LDZX-50KB型立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械公司；恒溫振蕩器，哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)公司；GC7890型氣相色譜儀，上海天美有限公司。

2.2 生物催化劑的制備

2.2.1 游離形式

將100 mL的NMS液體培養(yǎng)基置于250 mL三角瓶中，滅菌冷卻后接入甲基彎菌IMV 3011，接種量為10%(體積分?jǐn)?shù))，密封后抽真空，置換甲烷與空氣的混合氣體(體積比例1∶1)，間隔24 h換一次氣。30℃、180 r/min 搖床培養(yǎng)96 h后，8 000 r離心15 min收集細(xì)胞。用4℃、20 mmol/L、pH值7.0的磷酸鹽緩沖液(含5 mmol/L MgCl2)洗滌2次，再懸浮于同樣的緩沖液中，4℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2 固定化形式

采用1 mol/L HCl溶液浸泡活性炭顆粒，于50℃攪拌1 h，取出后再用去離子水反復(fù)洗滌，直至洗液的pH值為7.0，加熱干燥備用。

將活性炭置于活性炭甲基彎菌IMV 3011細(xì)胞懸液中，二者的體積比例為1∶10，室溫(20 ℃)下間歇攪拌20 h，濾出活性炭，用4℃、20 mmol/L、pH值7.0的磷酸鹽緩沖液(含5 mmol/L MgCl2)洗滌2次，自然晾干得到固定化形式的生物催化劑。

2.3 環(huán)氧乙烷的制備

乙烯的環(huán)氧化反應(yīng)在密封的反應(yīng)器中進(jìn)行(圖2)，用250 mL磷酸鹽緩沖液(20 mmol/L、pH值7.0，含5 mmol/L MgCl2)將一定量的生物催化劑(固定化形式5 g，吸附的干重細(xì)胞共12.5 mg；游離形式12.5 mL，其干重細(xì)胞為12.5 mg)懸浮于3 L反應(yīng)器中，反應(yīng)器密封后抽真空，置換一定比例的乙烯與氧氣的混合氣體，30℃、150 r/min 振蕩反應(yīng)，反應(yīng)一段時(shí)間取樣，測(cè)定樣品中環(huán)氧乙烷的含量。

圖2 乙烯環(huán)氧化的反應(yīng)器示意圖Fig.2 Schematic diagram of lab-scale ethylene-epoxidizing reactor

2.4 生物催化劑循環(huán)再生

環(huán)氧化反應(yīng)結(jié)束，將生物催化劑取出(固定化形式采用濾出；游離形式采用離心)，加入100 mL的NMS液體培養(yǎng)基置于250 mL三角瓶中，抽真空后置換甲烷與空氣的混合氣體(體積比例1∶1),30℃、180 r/min 振蕩8 h，進(jìn)行再生。再生后的催化劑重新制備環(huán)氧乙烷，反應(yīng)結(jié)束后再生，如此循環(huán)。

2.5 測(cè)定指標(biāo)與方法

2.5.1 環(huán)氧乙烷含量

采用氣相色譜法。測(cè)定條件為：SE-54型毛細(xì)管柱(Φ0.23 mm×30 m)，F(xiàn)ID檢測(cè)器，載氣(氮?dú)?流速為75 mL/min，檢測(cè)器、進(jìn)樣室、色譜柱的溫度分別為180、180、60℃，進(jìn)樣量為1 μL。

2.5.2 催化劑活力

催化劑活力即MMO活力，MMO活力用每1 mg干重細(xì)胞、每1 min催化丙烯環(huán)氧化產(chǎn)生的環(huán)氧丙烷物質(zhì)的量表示。將1 mL細(xì)胞懸液置于10 mL密封的玻璃瓶中，抽真空后充入丙烯和氧氣(體積比例1∶1)，30℃、180 r/min搖床振蕩30 min后，8 000 r離心15 min，迅速冷卻至4℃，進(jìn)樣量1 μL進(jìn)行氣相色譜分析，分析條件同2.5.1節(jié)。

2.6 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值，數(shù)據(jù)處理和分析采用SPSS 13.0軟件，統(tǒng)計(jì)顯著性P<0.05。

3 結(jié)果與分析

3.1 時(shí)間對(duì)環(huán)氧乙烷生成量的影響

采用游離形式和固定化形式的催化劑制備環(huán)氧乙烷，環(huán)氧乙烷的生成量與時(shí)間的關(guān)系如圖3所示。

圖3 環(huán)氧乙烷生成量隨時(shí)間的變化Fig.3 Time course of epoxyethane formation

反應(yīng)初期(0～4.5 h)環(huán)氧乙烷生成量不斷增加，采用游離形式催化劑時(shí)環(huán)氧乙烷生成量大于固定化形式；4.5～6 h采用2種形式催化劑時(shí)環(huán)氧乙烷生成量接近；6～9 h采用游離形式催化劑時(shí)環(huán)氧乙烷生成量不再增加，采用固定化形式催化劑時(shí)環(huán)氧乙烷生成量繼續(xù)增加直至9 h達(dá)到穩(wěn)定。

游離形式催化劑直接與反應(yīng)器液相中的乙烯接觸，反應(yīng)初期(0～4.5 h)環(huán)氧乙烷生成量大，可能是由于輔酶NADH的耗盡和產(chǎn)物的抑制作用[19]，導(dǎo)致6 h后環(huán)氧乙烷生成量不再增加；反應(yīng)器液相中的乙烯先擴(kuò)散至固定化催化劑周圍的液膜，再擴(kuò)散至固定化形式催化劑上的細(xì)胞表面[20]，因此，反應(yīng)初期(0～4.5 h)環(huán)氧乙烷生成量小于采用游離形式催化劑，固定化催化劑以活性炭為載體，活性炭對(duì)非極性的乙烯有良好的吸附作用[21]，使得活性炭吸附的細(xì)胞周圍微環(huán)境中聚集乙烯氣體，因而4.5 h后環(huán)氧乙烷生成量繼續(xù)增加。

從圖3可以看出，采用游離形式和固定化形式催化劑制備環(huán)氧乙烷，適宜反應(yīng)時(shí)間分別為6 h和8 h，環(huán)氧乙烷生成量分別為23 μmol/mg和27 μmol/mg。

3.2 乙烯初始體積分?jǐn)?shù)對(duì)環(huán)氧乙烷生成量的影響

為研究乙烯初始體積分?jǐn)?shù)對(duì)環(huán)氧乙烷生成量的影響，環(huán)氧乙烷反應(yīng)器中充入的氣體成分為氧氣、乙烯、氮?dú)猓渲醒鯕怏w積分?jǐn)?shù)50%，通過(guò)氮?dú)庹{(diào)整乙烯的初始體積分?jǐn)?shù)為0～30%，反應(yīng)8 h后測(cè)定樣品中的環(huán)氧乙烷生成量，結(jié)果如圖4所示。

圖4 乙烯體積分?jǐn)?shù)對(duì)環(huán)氧乙烷生成量的影響Fig.4 Effect of ethylene concentration on formation of epoxyethane

環(huán)氧乙烷生成量與乙烯在液相的溶解度有關(guān)，乙烯初始體積分?jǐn)?shù)增加，產(chǎn)生的環(huán)氧乙烷量也增加，當(dāng)液相中溶解的乙烯達(dá)到飽和，氣相中乙烯的體積分?jǐn)?shù)增加，環(huán)氧乙烷生成量也不會(huì)增加。由于活性炭對(duì)非極性氣體乙烯有良好的吸附能力[21]，且氣體易擴(kuò)散至細(xì)胞周圍的微環(huán)境中，因此，固定化形式催化劑所在的液相能聚集更多的乙烯。

從圖4可以看出，制備環(huán)氧乙烷，采用游離形式和固定化催化劑，乙烯適宜的初始體積分?jǐn)?shù)為20%，環(huán)氧乙烷生成量為29 μmol/mg和34 μmol/mg。

3.3 生物催化劑的再生

提供還原能量的輔酶NADH再生可以推動(dòng)乙烯環(huán)氧化反應(yīng)的持續(xù)進(jìn)行[22]。直接加入外源物質(zhì)可以再生輔酶NADH。向反應(yīng)器中加入甲烷(氧氣50%、乙烯20%、甲烷10%、氮?dú)?0%)、3 mmol/L甲醇、20 mmol/L甲酸鈉，2種形式催化劑的MMO活力如表1所示。

表1 輔因子對(duì)生物催化劑MMO活力的影響Tab.1 Effect of cofactors on MMO activity of free and immobilized biocatalysts nmol/(min·mg)

注：不同字母表示差異顯著。

不同的輔因子與酶的親和能力不同，導(dǎo)致再生輔酶的能力不同[23]。甲烷、甲醇和甲酸鈉的加入提高了游離形式催化劑的MMO活力，分別為空白組的1.4倍、1.6倍、6.4倍。

甲醇和甲酸鈉的水溶性好，能克服活性炭所產(chǎn)生的傳質(zhì)限制，固定化形式催化劑的MMO活力分別為空白組的1.5倍和5.8倍。物理吸附的吸附力主要是范德華力，氣體的相對(duì)分子量越大，則范德華力越大，吸附能力越強(qiáng)，反應(yīng)器中活性炭對(duì)乙烯的吸附力大于甲烷，因此，甲烷對(duì)固定化形式催化劑的再生效果不明顯。

外源物質(zhì)的一次性加入不能滿足日后連續(xù)化工業(yè)生產(chǎn)的需要。因此，循環(huán)再生是有益的嘗試。每次循環(huán)再生后生物催化劑的MMO活力結(jié)果如圖5所示。

圖5 循環(huán)再生催化劑的MMO活力保留率Fig.5 Percent of initial MMO activity retained of free and immobilized biocatalysts in repeated regeneration

MMO在再生的過(guò)程中產(chǎn)生輔酶NADH，為制備環(huán)氧乙烷提供了還原能量，由于其自身的不穩(wěn)定性，游離形式催化劑循環(huán)再生4次后其MMO活力不斷降低，循環(huán)再生到第8次，其活力基本為零。

對(duì)固定化形式催化劑的再生，由于其上吸附不牢固的細(xì)胞部分脫落[10]，導(dǎo)致前2次再生MMO活力下降，但下降程度較小，之后的循環(huán)再生MMO活力基本不變，再生8次后MMO活力仍保留89%，這體現(xiàn)了再生處理的作用以及固定化形式催化劑良好的操作穩(wěn)定性。

CHEN等[11]采用硅酸鈉溶膠包埋甲基單胞菌GYJ3催化丙烯環(huán)氧化反應(yīng)，25批次再生-催化實(shí)驗(yàn)中，MMO的活力基本不變，而游離細(xì)胞在第4次再生-催化實(shí)驗(yàn)中，MMO活力保留率小于30%；KOVALENKO等[10]研究了甲基彎菌IMV 3011游離細(xì)胞催化丙烯環(huán)氧化反應(yīng)的操作穩(wěn)定性，結(jié)果表明連續(xù)催化7次后MMO的酶活力接近初始酶活力的10%。

3.4 不同形式催化劑對(duì)環(huán)氧乙烷生成量的影響

甲烷氧化菌細(xì)胞作為催化劑制備環(huán)氧乙烷，其參與反應(yīng)有2種形式：游離形式、固定化形式。按照2.3節(jié)的方法，反應(yīng)器中氣相的組成為氧氣50%、乙烯20%、氮?dú)?0%，采用游離形式和固定化催化劑，循環(huán)再生8次后，環(huán)氧乙烷物質(zhì)的量為2.2 nmol和3.4 nmol。

圖6反映了環(huán)氧乙烷對(duì)不同形式生物催化劑的產(chǎn)物抑制作用。

圖6 環(huán)氧乙烷對(duì)MMO活力的影響Fig.6 Effect of epoxyethane on MMO activity of free and immobilized biocatalysts

1.0 nmol/L環(huán)氧乙烷直接作用游離形式和固定化形式催化劑120 min，MMO活力保留率分別為2%、67%，可以看出，環(huán)氧乙烷對(duì)MMO活力有抑制作用。之前的研究證明：環(huán)氧丙烷對(duì)MMO活力有抑制作用，它可以結(jié)合MMO的催化位點(diǎn)，特別是MMOH[24]。環(huán)氧乙烷與環(huán)氧丙烷的結(jié)構(gòu)相似，環(huán)氧乙烷環(huán)狀結(jié)構(gòu)中氧的拉伸使碳原子更具有親電性，更易與MMO活性部位中的親核氨基酸殘基結(jié)合，這可能是環(huán)氧乙烷對(duì)MMO活力有抑制作用的原因。

固定化形式催化劑的載體活性炭對(duì)環(huán)氧乙烷的吸附能力較弱，環(huán)氧乙烷可以遠(yuǎn)離固定化細(xì)胞周圍的微環(huán)境，能降低環(huán)氧乙烷對(duì)細(xì)胞MMO活力的抑制作用，同時(shí)結(jié)合環(huán)氧乙烷生成量，確定制備環(huán)氧乙烷的生物催化劑采用固定化形式。

4 結(jié)論

以MethylosinustrichosporiumIMV 3011細(xì)胞為生物催化劑，催化乙烯環(huán)氧化反應(yīng)制備環(huán)氧乙烷。

(1)反應(yīng)條件為：反應(yīng)器中氣相的組成為氧氣50%、乙烯20%、氮?dú)?0%，30℃、150 r/min振蕩反應(yīng)8 h，采用游離形式和固定化形式催化劑，環(huán)氧乙烷生成量分別為29 μmol/mg和34 μmol/mg。

(2)生物催化劑的MMO活力需要再生，可采用甲烷培養(yǎng)實(shí)現(xiàn)循環(huán)再生，固定化形式催化劑再生8次MMO活力仍保留89%，環(huán)氧乙烷物質(zhì)的量為3.4 nmol。

(3)生物催化劑采用固定化形式，以活性炭為載體，通過(guò)對(duì)乙烯的吸附作用提高細(xì)胞周圍的底物濃度，再生后可以持續(xù)催化環(huán)氧化反應(yīng)，細(xì)胞的MMO活力穩(wěn)定，具有良好的操作穩(wěn)定性，不易吸附環(huán)氧乙烷，使環(huán)氧乙烷遠(yuǎn)離細(xì)胞進(jìn)而降低產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞活性的抑制作用。與傳統(tǒng)的化學(xué)催化方法相比，本方法在常溫常壓下進(jìn)行且反應(yīng)條件溫和，一步生成環(huán)氧乙烷，反應(yīng)工序少，副產(chǎn)物僅有水，無(wú)污染，腐蝕性小，具有工業(yè)上實(shí)際應(yīng)用的潛力。

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Producing Epoxyethane as Food Fumigant Based on Biocatalysis

XU Ning1,2XIN Jiaying1WANG Yan1DOU Boxin1XIA Chungu3

(1.KeyLaboratoryforFoodScienceandEngineering,HarbinUniversityofCommerce,Harbin150076,China2.CollegeofFoodScience，NortheastAgriculturalUniversity,Harbin150030,China3.StateKeyLaboratoryforOxoSynthesisandSelectiveOxidation,LanzhouInstituteofChemicalPhysics,ChineseAcademyofSciences,Lanzhou730030,China)

In addition to application in chemical manufacturing processes, epoxyethane is widely used in processes of food fumigating sterilization, particularly of grains and dried fruits. During the last decades, many research works have been focused on epoxidation reactions of ethylene by supported catalysts such as transition metal complexes and metal nanoparticles. In contrast with chemical synthetic methods, the biocatalytic reaction appears to be a mild and simple method. One biocatalytic method for producing epoxyethane is using methane monooxygenase (MMO) to insert oxygen across the carbon double bonds of ethylene. Epoxyethane synthesis byMethylosinustrichosporiumIMV 3011 whole cells which contains the MMO has significant application potential as it is performed at normal temperature and pressure and causes no pollution. The process for producing epoxyethane was described. The effect of initial ethylene concentration on production of epoxyethane was studied. Initial concentrations of oxygen, ethylene and nitrogen were 50%, 20% and 30%, respectively. The amount of epoxyethane formed by free biocatalyst was 29 μmol/mg in approximately 6 h. Moreover, the amount of epoxyethane formed by immobilized biocatalyst was 34 μmol/mg in approximately 8 h. In a batch reaction system, the regenerated immobilized biocatalyst can be repeatedly used for 8 times and 89% of initial MMO activity was retained, and the amount of epoxyethane formed was 3.4 nmol.

food fumigant; epoxyethane; methanotrophic bacteria; biocatalyst; epoxidation

10.6041/j.issn.1000-1298.2017.02.043

2016-09-29

2016-11-22

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(21073050、21573055)

徐寧(1981—)，女，博士生，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)講師，主要從事食品生物技術(shù)研究,E-mail: xuningneau@163.com

辛嘉英(1966—)，男，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事生物催化研究，E-mail: xinjiayingvip@163.com

TS255.1

A

1000-1298(2017)02-0322-05