葛 婷，雷程紅*，王振寶，卞賽賽，樊新麗

(1．新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052；2．伊犁出入境檢驗檢疫局，新疆伊寧 835000)

羊布魯菌快速檢測技術(shù)應(yīng)用研究

葛 婷1，雷程紅1*，王振寶2，卞賽賽1，樊新麗1

(1．新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052；2．伊犁出入境檢驗檢疫局，新疆伊寧 835000)

通過用4種方法對羊布魯菌的檢測，確立適用于基層應(yīng)用的羊布魯菌快速檢測技術(shù)。http://www.mdxycn.com/采用濁度儀LAMP、金屬浴LAMP、熒光目視檢測試劑盒LAMP和普通PCR共4種方法對羊血液中的布魯菌進(jìn)行檢測，比較其檢測結(jié)果。結(jié)果表明，共檢測162份羊血液，布魯菌檢出率分別為濁度儀LAMP為8.6%、金屬浴LAMP為8.6%、熒光目視檢測試劑盒為8.6%、普通PCR為6.2%。LAMP較普通PCR方法特異性強(qiáng)且靈敏度高；金屬浴LAMP方法操作簡便，無需特殊設(shè)備，更適用于基層應(yīng)用。

羊；布魯菌；環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)；檢測

布魯菌病(Brucellosis)是由布魯菌(Brucella)引起的以發(fā)熱和流產(chǎn)為主要特征的人畜共患傳染病。近年來，布魯菌病頻頻發(fā)生，直接威脅到了人和動物的健康，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失和嚴(yán)重的公共衛(wèi)生危害[1]。布魯菌病防控的關(guān)鍵是對病原及早、快速、準(zhǔn)確的檢測并確診。目前，用于布魯菌病的診斷技術(shù)有細(xì)菌分離培養(yǎng)、凝集試驗、補(bǔ)體結(jié)合試驗、酶聯(lián)免疫吸附試驗及PCR檢測等方法[2]，但上述方法耗時長，操作較復(fù)雜，有些尚需借助精密儀器設(shè)備方能判定結(jié)果，致使這些方法在基層應(yīng)用中較難普及推廣。因此，建立一種適用于基層的、簡便快速準(zhǔn)確的病原診斷方法十分必要。

環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技術(shù)是一種能對核酸進(jìn)行高效擴(kuò)增，并廣泛用于基因快速檢測的新型檢測方法[3]。LAMP方法與普通PCR方法相比，其靈敏度高，特異性強(qiáng)，對實驗室儀器設(shè)備要求較低，操作簡便。在恒溫條件下(60℃～65℃)1 h內(nèi)即可擴(kuò)增出109～1010靶序列拷貝[4-5]，其結(jié)果可用肉眼直接判定[6-7]。目前， LAMP方法已應(yīng)用于微生物基因檢測[8]。本研究采用3種LAMP方法和PCR方法對羊布魯菌進(jìn)行檢測比較，以期篩選出最適合于基層應(yīng)用的羊布魯菌病快速診斷技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 檢測樣品 在伊犁州部分地區(qū)隨機(jī)采集綿羊血液162份。

1.1.2 菌株及DNA 布魯菌活疫苗(M5株)，購自新疆天康畜牧生物技術(shù)股份有限公司；大腸埃希菌DNA、綠膿桿菌DNA及沙門菌DNA由新疆伊犁出入境檢驗檢疫局實驗室饋贈。

1.1.3 引物 布魯菌IS711基因PCR引物參照SN/T1088-2010、布魯菌Omp25蛋白基因LAMP引物參照文獻(xiàn)[9]，由北京華大科技有限公司合成。

1.1.4 主要試劑 10×Buffer(Mg2+free)緩沖液、TaqDNA聚合酶、dNTP、MgCl2、DNA Marker DL 2 000，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；血液基因組提取試劑盒，天根生物公司產(chǎn)品；BstDNA聚合酶(NEB)、SYBR Green-I核酸染料，北京鼎國生物有限公司產(chǎn)品；熒光目視檢測試劑盒，榮研生物科技(中國)有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 羊血液基因組的提取 按照血液基因組提取試劑盒的操作說明進(jìn)行。

1.2.2 羊布魯菌活疫苗(M5株)DNA的提取 參照SN/T2701-2010方法進(jìn)行。

1.2.3 布魯菌Omp25基因的金屬浴LAMP擴(kuò)增 反應(yīng)體系為25 μL：2×反應(yīng)緩沖液12.5 μL，引物混合物3.0 μL，Bst DNA聚合酶1.0 μL，模板2.0 μL，去離子水6.5 μL。反應(yīng)條件：金屬干浴鍋設(shè)置63℃ 50 min，90℃ 10 min。反應(yīng)管渦旋混勻后置于金屬干浴鍋中進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后，觀察反應(yīng)管是否有白色渾濁生成，經(jīng)過6 000 r/min、5 min離心觀察是否產(chǎn)生白色沉淀。反應(yīng)體系中的模板分別為布魯菌活疫苗(M5株)DNA(陽性對照)、雙蒸水(陰性對照)及待檢樣品DNA。

1.2.4 布魯菌Omp25基因的實時濁度儀LAMP擴(kuò)增 反應(yīng)體系為25 μL：2×反應(yīng)緩沖液12.5 μL，引物混合物3.0 μL，Bst DNA聚合酶1.0 μL，模板2.0 μL，去離子水6.5 μL。反應(yīng)條件：LAMP實時濁度儀設(shè)置63℃ 45 min，80℃ 10 min。反應(yīng)管渦旋混勻后置于LAMP實時濁度儀中擴(kuò)增。反應(yīng)結(jié)束后，查看柱狀圖底部的顏色變化，紅色為陽性，綠色為陰性。反應(yīng)體系中的模板分別為雙蒸水、布魯菌活疫苗(M5株)DNA(陽性對照)、大腸埃希菌DNA(陰性對照)、綠膿桿菌DNA(陰性對照)、沙門菌DNA(陰性對照)及待檢樣品DNA。

1.2.5 布魯菌Omp25基因的LAMP擴(kuò)增(熒光目視檢測試劑盒法) 反應(yīng)體系為25 μL：2×反應(yīng)緩沖液12.5 μL，引物混合物3.0 μL，Bst DNA聚合酶1.0 μL，模板2.0 μL，去離子水5.5 μL，鈣黃綠素染料1 μL。反應(yīng)條件：金屬干浴鍋設(shè)置63℃ 50min，90℃ 10 min。反應(yīng)管渦旋混勻后置于金屬干浴鍋中擴(kuò)增。反應(yīng)結(jié)束后，肉眼直接觀察反應(yīng)管顏色變化，并用紫外線照射裝置觀察反應(yīng)管有無熒光出現(xiàn)。反應(yīng)體系中的模板分別為布魯菌活疫苗(M5株)DNA(陽性對照)、雙蒸水(陰性對照)及待檢樣品DNA。1.2.6 布魯菌IS711基因的PCR擴(kuò)增 反應(yīng)體系為25 μL：模板1.5 μL，引物混合物2 μL，10×buffer(Mg2+free)緩沖液3 μL、TaqDNA聚合酶0.25 μL、dNTP Mixture2.5 μL、MgCl22 μL、去離子水13.75 μL。反應(yīng)條件為：95℃ 5 min；95℃ 15 s，52℃ 30 s，72℃ 90 s，40個循環(huán)；72℃ 5 min。反應(yīng)管渦旋混勻后置于PCR儀中，反應(yīng)結(jié)束后，取PCR產(chǎn)物5 μL，15 g/L瓊脂糖凝膠電泳后，置于凝膠成像儀中觀察拍照。反應(yīng)體系中的模板分別為布魯菌活疫苗(M5株)DNA(陽性對照)、雙蒸水(陰性對照)及待檢樣品DNA。

2 結(jié)果

2.1 布魯菌Omp25基因的金屬浴LAMP擴(kuò)增結(jié)果

經(jīng)63℃ 50 min，90℃ 10 min擴(kuò)增后，陽性對照管1號和待檢樣品管3號出現(xiàn)白色渾濁，經(jīng)6 000 r/min，5 mim離心后沉淀明顯，結(jié)果說明布魯菌核酸在擴(kuò)增過程中產(chǎn)生大量焦磷酸鎂白色渾濁，離心后白色沉淀明顯。而陰性對照管2號和待檢樣品管4號未發(fā)生變化說明沒有擴(kuò)增出布魯菌核酸。具體結(jié)果見圖1。用該方法檢測羊血液162份，檢出布魯菌14份，布魯菌檢出率為8.6%。

A.離心前;B離心后;1.陽性對照；2.陰性對照；3、4.待檢樣品

2.2 布魯菌Omp25基因的實時濁度儀LAMP擴(kuò)增結(jié)果

經(jīng)63℃ 45 min，80℃ 10 min 在LAMP 實時濁度儀擴(kuò)增后，2號通道出現(xiàn)藍(lán)色柱狀圖且柱狀圖底部為紅色，說明2號陽性對照管擴(kuò)增出布魯菌核酸。其他通道未出現(xiàn)藍(lán)色柱狀圖且柱狀圖底部為綠色，說明陰性對照管未擴(kuò)增出布魯菌核酸(圖2)。待檢樣品管3號所對應(yīng)的3號通道出現(xiàn)藍(lán)色柱狀圖且柱狀圖底部為紅色，說明待檢樣品管3號擴(kuò)增出布魯菌核酸(圖3)。

用該方法檢測羊血液162份，檢出布魯菌14份，布魯菌檢出率為8.6%。

2.3 布魯菌Omp25基因的LAMP擴(kuò)增結(jié)果(熒光目視檢測試劑盒法)

經(jīng)金屬干浴鍋設(shè)置63℃ 50 min，90℃ 10 min擴(kuò)增后，陽性反應(yīng)管1號顏色由橙紅色變?yōu)榫G色，說明陽性反應(yīng)管1號中擴(kuò)增出布魯菌陽性核酸。陰性反應(yīng)管2號橙紅色不變，說明未擴(kuò)增出布魯菌核酸。待檢樣品3號反應(yīng)管出現(xiàn)綠色說明擴(kuò)增出布魯菌核酸(圖4A)。使用紫外線照射裝置觀察結(jié)果，擴(kuò)增出布魯菌核酸的反應(yīng)管出現(xiàn)熒光，未擴(kuò)增出布魯菌核酸的反應(yīng)管無熒光出現(xiàn)(圖4B)。

用該方法檢測羊血液162份，檢出布魯菌14份，布魯菌檢出率為8.6%。

1.雙蒸水；2.布魯菌疫苗(M5株型)陽性DNA；3.大腸埃希菌DNA；4.綠膿桿菌DNA；5.沙門菌DNA

1.Double-distilled water；2.Brucella(M5)DNA; 3.E.coliDNA;4.P.aeruginosaDNA；5.SalmonellaDNA

圖2 布魯菌Omp25基因的實時濁度儀LAMP擴(kuò)增結(jié)果

Fig.2 Amplification results ofBrucellaOmp25 gene by real-time LAMP

1.陽性對照；2.陰性對照；3、4.待檢樣品

1.Positive control; 2.Negative control; 3，4.Samples

圖3 布魯菌Omp25基因?qū)崟r濁度儀 LAMP擴(kuò)增結(jié)果

Fig.3 Amplification results ofBrucellaOmp25 gene by real-time LAMP

A.可見光;B.紫外燈;1.陽性對照；2.陰性對照；3、4.待檢樣品

2.4 布魯菌IS711基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

分析電泳結(jié)果可得布魯菌病疫苗(M5株)陽性DNA(2號泳道)及待檢樣品(4號泳道)在800 bp和180 bp有條帶，說明擴(kuò)增出布魯菌核酸。陰性樣品(3號泳道)及待檢樣品(5號泳道)只在800 bp有條帶，說明未擴(kuò)增出布魯菌核酸(圖5) 。此結(jié)果符合SN/T1088-2010判定方法。

用普通PCR方法檢測羊血液162份，檢出布魯菌10份，布魯菌檢出率為6.2%。

3 討論

布魯菌病給許多國家和地區(qū)的畜牧業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失，同時也給畜牧從業(yè)者帶來嚴(yán)重危害[10]。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的發(fā)展，PCR 及核酸探針等檢測基因水平的方法逐漸被人們開發(fā)利用，由于檢測過程復(fù)雜且對實驗室儀器設(shè)備要求苛刻，致使這些方法難以滿足基層檢測需要。而LAMP反應(yīng)所用引物是針對目標(biāo)DNA鏈上的6個區(qū)段設(shè)計4個不同的引物，比PCR反應(yīng)針對2個區(qū)段設(shè)計2條引物顯著提高了特異性，反應(yīng)時所用的鏈置換型Bst DNA合成酶可在恒溫(60℃～65℃)進(jìn)行DNA擴(kuò)增，這大大縮短了以往檢測所需時間，并且LAMP反應(yīng)不需復(fù)雜儀器設(shè)備，這些優(yōu)點說明LAMP反應(yīng)更適用于基層檢測需要。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn) DL 2 000；1.雙蒸水；2.陽性對照；3.陰性對照；4、5.待檢樣品

M.DNA Marker DL 2 000；1.Double-distilled water；2.Negative control; 3.Positive control; 4，5.Samples

圖5 布魯菌PCR擴(kuò)增結(jié)果

Fig.5 Amplification results ofBrucellaby PCR

在DNA合成時，從脫氧核糖核酸三磷酸底物(dNTPs)中析出的焦磷酸離子與反應(yīng)溶液中的鎂離子反應(yīng)，會產(chǎn)生大量焦磷酸鎂白色沉淀。本次試驗根據(jù)這一原理將LAMP反應(yīng)在金屬浴中進(jìn)行，結(jié)果顯示陽性對照反應(yīng)管會出現(xiàn)白色渾濁現(xiàn)象且肉眼可見，這說明該方法能擴(kuò)增出布魯菌核酸，結(jié)果與原理保持一致。該方法過程操作簡便，實驗設(shè)備要求較低，結(jié)果判定清楚直接。同時這種LAMP反應(yīng)開始至結(jié)果判讀均不需要打開反應(yīng)管，這避免了因形成氣溶膠而導(dǎo)致的DNA污染及假陽性的產(chǎn)生[11]。該種LAMP法完全適合基層條件檢測的優(yōu)點是其他方法所不及的。

本研究選擇的Omp25基因在布魯菌屬種間有很高的同源性，并且Omp25基因是布魯菌重要的毒力基因，根據(jù)該基因設(shè)計的引物具有較強(qiáng)的特異性。本次試驗同時使用了LAMP 實時濁度儀，該方法可對反應(yīng)過程中產(chǎn)生的焦磷酸鎂白色沉淀的混濁度進(jìn)行實時監(jiān)測，并以圖示形式反映出目的基因是否擴(kuò)增。反應(yīng)結(jié)束后可觀察通道的變化，若通道有藍(lán)色柱狀出現(xiàn)且底部顯示為紅色時說明擴(kuò)增出目的基因，表示為陽性；反之為陰性。結(jié)果表明,LAMP 實時濁度儀可以直觀的通過圖示反映出目的基因擴(kuò)增量的變化及結(jié)果，但由于濁度儀價格昂貴這就表明該種LAMP方法并不適合基層的工作條件。

LAMP反應(yīng)出現(xiàn)的大量擴(kuò)增產(chǎn)物在結(jié)合鈣黃綠素染料的情況下，會出現(xiàn)肉眼可見的顏色變化[12]。根據(jù)這一原理，試驗中也利用了熒光目視檢測試劑盒進(jìn)行檢測。結(jié)果表明,在加入該檢測試劑經(jīng)LAMP反應(yīng)后，反應(yīng)液由橙紅色變?yōu)榫G色的為陽性，反應(yīng)液無變色(仍為橙紅色)為陰性；在紫外照射下觀察陽性發(fā)生熒光，陰性未發(fā)生熒光。這種可視化的顏色變化使LAMP反應(yīng)的結(jié)果判定更明顯清晰，但有資料顯示該反應(yīng)在預(yù)設(shè)反應(yīng)時間達(dá)到之后應(yīng)停止反應(yīng)，若將反應(yīng)時間延長至1 h以上，可能會出現(xiàn)假陽性[13]，并且試劑盒價格高昂，且需要紫外照射裝置這種特殊設(shè)備，由此可得該法不利于基層檢測。

PCR方法是實驗室核酸檢測常用的方法，也是基層使用靈敏性最高的檢測方法。本次試驗通過3種不同條件下的LAMP反應(yīng)與PCR結(jié)果的比對，得出3種不同條件下的LAMP檢出布魯菌陽性率均高于PCR方法。而這3種不同條件的LAMP檢出布魯菌陽性率相同，重復(fù)率相同。綜上所述，經(jīng)不同條件下的LAMP反應(yīng)得出在金屬浴中進(jìn)行LAMP方法可行，而金屬浴LAMP具有無需昂貴設(shè)備及試劑的優(yōu)勢更適合基層檢測條件，建議推廣。

本次調(diào)查共檢測伊犁部分地區(qū)162只羊，檢出布魯菌陽性14只，布魯菌病感染率為8.6%；用4種方法檢測的結(jié)果表明，在金屬浴中進(jìn)行的LAMP反應(yīng)，更適合在基層推廣應(yīng)用。

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Study on Applification of Rapid Detection Technology ofBrucellain Sheep

GE Ting1，LEI Cheng-hong1，WANG Zhen-bao2，BIAN Sai-sai1，F(xiàn)AN Xin-li1

(1．CollegeofVeterinaryMedicine，XinjiangAgriculturalUniversity，Urumqi，Xinjiang，830052，China； 2.YiliEntry-ExitInspectionandQuarantineBureau，Yining，Xinjiang，835000，China)

The study used four detection methods aimed to confirm methods for sheepBrucellarapid detection and applied to grass-roots unit in Yili,Xinjiang.Brucellain sheep blood were detected using Turbidity LAMP,Metal bath LAMP,Fluorescent Detection Reagent LAMP and PCR method.Then the four detection results were compared.162 sheep blood samples were used to detectBrucella,and the respective detection rates were 8.6%,8.6%,8.6%,6.2%.According to the results,LAMP were better than PCR method on sensitivity and specificity.Metal bath LAMP method was easy to operate without special equipment,and it is more applicable to grass-roots unit.

sheep;Brucella; loop-mediated isothermal nucleic acid technique; detection

2016-06-13

新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)研究生產(chǎn)學(xué)研項目(xjaucxy-yjs-20151014);國家級大學(xué)生創(chuàng)新項目(201610758015)

葛 婷(1989-)，女，新疆石河子人，碩士研究生，主要從事動物疫病防控研究。*通訊作者

S852.614

A

1007-5038(2017)01-0011-05