李婷婷，劉 莉，曾 楨，孔衛(wèi)東，李 良,劉 芬，劉文劍

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定紅花中非法染色物新品紅、金胺O和蘇丹紅Ⅳ含量的研究

李婷婷1，劉 莉1，曾 楨1，孔衛(wèi)東1，李 良2,劉 芬3，劉文劍2

目的 建立液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)法同時測定紅花中非法染色物新品紅、金胺O和蘇丹紅Ⅳ的含量。方法 采用安捷倫EC-C18(2.1 mm ×50 mm，1.8 μm)色譜柱，流動相為20 mmol/L甲酸銨+0.1%甲酸(A)和乙腈(B)，梯度洗脫，流速為0.2 ml/min，柱溫為 40 ℃，離子化方式為ESI，檢測模式為MRM，選擇離子對：(1)新品紅m/z 330.3→223.2，m/z 330.3→300.2；(2)金胺O m/z 268.2→147.2，m/z 268.2→252.2；(3)蘇丹紅Ⅳ m/z 381.2→224.1，m/z 381.2→91.1。結(jié)果 該方法新品紅、金胺O和蘇丹紅Ⅳ的線性范圍分別為0.1086～271.50 ng/ml、0.1392～348.00 ng/ml和0.1352～338.00 ng/ml，回收率(n=6)分別為97.45%、96.44%和97.58%，RSD分別為0.70%、1.12%和0.89%，精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性的RSD均小于3%。結(jié)論 該方法提取簡單，測定方法定量準(zhǔn)確，靈敏度高，適用于紅花中非法染色物新品紅、金胺O和蘇丹紅Ⅳ的含量測定。

LC-MS/MS；紅花；新品紅；金胺O；蘇丹紅Ⅳ

紅花為菊科紅花屬植物紅花的干燥花,是一種傳統(tǒng)的活血化瘀類中藥[1]，臨床常用于預(yù)防和治療冠心病、腦血栓等心腦血管疾病。近年來，由于紅花應(yīng)用廣泛，但是來源有限，因此存在造假、摻假的情況， 嚴(yán)重影響了藥品質(zhì)量，并損害消費者健康[2-5]。筆者采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，對從中藥材市場、醫(yī)院、藥店等流通環(huán)節(jié)收集的紅花藥材進行了摻偽染色檢測方法的研究。通過查閱文獻，摸索多種實驗條件，最終確立了紅花中非法染色物新品紅、金胺O和蘇丹紅Ⅳ的檢測方法。該方法簡便，靈敏度高，具有創(chuàng)新性，可為紅花的質(zhì)量檢查工作提供可靠的技術(shù)保障。

1 儀器與試藥

Agilent 1290 G6460CMS/MS 三重四級桿液質(zhì)聯(lián)用儀(美國安捷倫公司)；AE-240電子天平，AEG220電子天平(日本島津公司)；Millipore-Q Gradient 超純水裝置(美國Millipore公司)。新品紅對照品(中國食品藥品檢定研究院，100%，111955-201301)，蘇丹紅Ⅳ對照品(中國食品藥品檢定研究院，100%，111950-201301)，金胺O對照品(中國食品藥品檢定研究院，100%，111950-201301)，甲酸銨(Agilent G1946-85021)；乙腈(Amethyst Chemicals L990O07)；水為Millipore裝置制備的超純水；其他試劑均為分析純。藥材：紅花藥材為市售樣品，經(jīng)成都市食品藥品檢驗研究院中藥室鑒定來源為紅花CarthamiFlos。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱EC-C18(2.1 mm ×50 mm，1.8 μm) ；柱溫40 ℃；流動相20 mmol/L甲酸銨+0.1%甲酸(A)-乙腈(B)，梯度洗脫(0～5 min，60%A→40%A；5～8 min，40%A→5%A，保持4 min；12～13 min，5%A→60%A)，流速0.2 ml/min；進樣量2 μl。

2.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源( ESI)，進行正離子掃描，檢測方式為正離子多離子反應(yīng)監(jiān)測(MRM)，離子噴霧電壓3500 V，干燥氣溫度 350 ℃，干燥氣流速10 L/min，碰撞氣為高純氮氣。(1)新品紅m/z 330.3→223.2， 300.2，Dell 時間均為0.4 s，裂解電壓215 V，碰撞能分別為36 eV和40 eV；(2)金胺O m/z 268.2→147.2， 252.2，Dell時間均為0.4 s，裂解電壓155 V，碰撞能分別為30 eV和34 eV；(3)蘇丹紅Ⅳ m/z 381.2→224.1，381.2→91.1，Dell時間均為0.8 s，裂解電壓120 V，碰撞能分別為20 eV和28 eV。

2.3 溶液的制備 對照品儲備液的制備：精密稱取對照品各5 mg，分別置100 ml容量瓶，加50%乙腈至刻度，搖勻，再精密量取各1 ml置100 ml容量瓶中，加50%乙腈至刻度，搖勻，作為儲備液。供試品溶液的制備：取樣品0.2 g，精密稱定，精密加入70%乙醇20 ml，超聲(功率250 W，頻率25 kHz)20 min，放冷，稱定，補失重，用0.22 μm的微孔濾膜濾過，作為供試品溶液。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密量取混合對照儲備液適量，用50%乙腈制成質(zhì)量濃度分別為0.10、0.50、5.00、10.00、50.00、100.00、250.00 ng/ml的系列混合對照品溶液。在擬定的LC-MS/MS條件下測定，各化合物定量離子對的峰面積(Y)對各組分濃度(X)經(jīng)回歸處理，得標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，新品紅、金胺O和蘇丹紅Ⅳ濃度分別在0.1086～271.50 ng/ml、0.1392～348.00 ng/ml和0.1352～338.00 ng/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好?；貧w方程、相關(guān)系數(shù)見表1。圖1、圖2、圖3分別為3種染色物的選擇離子色譜圖。

2.5 檢出限和定量限的測定 根據(jù)3種染色物對照品在S/N=3時的濃度，計算出測定方法的檢出限(LOD)；根據(jù)對照品在S/N=10時的濃度，計算出測定方法的檢出限(LOQ)，結(jié)果見表1。

表1 新品紅、金胺O及蘇丹Ⅳ的線性定量系數(shù)及最低檢測限

圖1 新品紅對照品化合物MRM監(jiān)測

圖2 金胺O對照品化合物MRM監(jiān)測

圖3 蘇丹紅Ⅳ對照品化合物MRM監(jiān)測

2.6 精密度試驗 取3種染色物質(zhì)量濃度為100 ng/ml的混合對照品溶液在擬定的LC-MS/MS條件下連續(xù)測定6次，由定量離子對的峰面積計算精密度。新品紅、金胺O和蘇丹紅Ⅳ的RSD(n=6)分別為1.1%、1.2%、1.8%，表明方法的精密度良好。

2.7 回收率和重復(fù)性試驗 精密吸取3種染色物混合對照溶液，加入不含染色物的紅花樣品中，按樣品溶液制備，按擬定的LC-MS/MS條件測定，結(jié)果見表2。

表2 新品紅、金胺O及蘇丹IV加樣回收率實驗結(jié)果

2.8 穩(wěn)定性試驗 取3種染色物質(zhì)量濃度為100 ng/ml的混合對照溶液，分別在之后的0、3、6、12、18、24 h時測定，根據(jù)3種染色物定量離子對的峰面積計算精密度。新品紅、金胺O和蘇丹紅Ⅳ的RSD(n=6)分別為1.5%、1.2%、1.9%，結(jié)果表明3種染色物的混合對照溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

利用建立的LC/MS-MS檢測方法，對經(jīng)上述方法處理的紅花，按以上試驗條件進行檢測，測定峰面積，用外標(biāo)法計算17批次紅花中的新品紅、金胺O和蘇丹紅Ⅳ的含量，有三批次紅花檢出金胺O，其中批號為20150009的紅花含量為345.6 ng/g，批號為20150039的紅花含量為706.3 ng/g，批號為20150047的紅花含量為178.0 ng/g；新品紅和蘇丹紅Ⅳ均未檢出。

3 討 論

在方法學(xué)建立過程中，筆者對色譜柱、流動相組成、質(zhì)譜條件確立進行了系統(tǒng)全面的優(yōu)化。結(jié)果表明：(1)采用安捷倫EC-C18(2.1 mm ×50 mm，1.8 μm)色譜柱分離效果和峰形最優(yōu)；(2)流動相中加入濃度為20 mmol/L甲酸銨可提高色譜峰響應(yīng)強度，梯度洗脫，流速為0.2 ml/min，可以得到較好的分離效果；(3)離子模式的確立，本方法測定的3種目標(biāo)物均為紅花藥材中常用的染色劑，根據(jù)其性質(zhì)和分子結(jié)果，在正離子掃描模式下靈敏度最高。選擇ESI+為電離模式，對質(zhì)譜條件進行優(yōu)化，確定分子離子峰，在此基礎(chǔ)上，選擇出豐度最大的兩個子離子作為定量和定性離子，確定最佳碰撞能量，以獲得最大靈敏度。

根據(jù)檢驗結(jié)果，目前紅花藥材中確實存在非法染色問題。有3批次紅花檢出金胺O，存在染料染色，可見紅花染色問題相當(dāng)突出，且染料種類繁多，呈現(xiàn)多樣化、復(fù)雜化趨勢。目前中藥材及飲片、制劑中非法染色物的檢測多采用液相色譜法[6,7]，陽性樣品經(jīng)液質(zhì)聯(lián)用確認(rèn)的方法。筆者建立的LC-MS/MS檢測紅花中3種非法染色物的方法，采用MRM模式，選擇性強，靈敏度高，可用于藥材中非法染色物的快速檢測，保障用藥安全。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[M].一部.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2015：151-152.

[2] 肖海龍,屠海云,王紅青,等.反相高效液相色譜法快速測定食品中18種水溶性合成著色劑[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志，2011，21(2):264-266.

[3] 田 華，賈繼民，阿布力米提.紅花等三種中藥中砷、汞、鉛含量的分析研究[J].中國衛(wèi)生檢測雜志，2012,22(8):1746-1747.

[4] LUAN Jie,NI Yanna,DING Qing.Detection of dyed saffron adulteration products[J].Anhui Med Pharm J，2012,16(7):917-919.

[5] Hu Xiaowei.Qualitative and quantitative determination of illegally added acid orange II in Croci Stigma by UPLC[J].China Pharm,2011,20(14):40-41.

[6] 楊建龍,曲艷麗,徐彤彤，等.HPLC-MS/MS法測定風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎片中松香酸的含量[J].中國藥房，2015，30(25)：3.

[7] JIANG Lei,MENG Xiangsong,JI Fengjuan.Detection of orangeII in nvbao capsule by HPLC-DAD method[J].Anhui Med Pharm J,2011,15:437-438.

(2016-09-20收稿 2016-11-10修回)

(責(zé)任編輯 岳建華)

Simultaneous determination of illegal dyes of New fuchsin,Auramine O and Sudan Ⅳ inCarthamiFlosby LC-MS/MS

LI Tingting1,LIU Li1,ZENG Zhen1,KONG Weidong1,LI Liang2，LIU Fen3, and LIU Wenjian2.

1.Department of Traditional Chinese Medicine, Chengdu Institute for Food and Drug Control, Chengdu 610045, China; 2. Medical Affairs Office, Hospital of Jiangxi Corps of Chinese Armed Police Force, Nanchang 330006, China; 3. College of Pharmacy, Nanchang University, Nanchang 330006, China

Objective To develop an LC-MS/MS method for simultaneous determination of illegal dyes of New fuchsin, Auramine O and Sudan ⅣinCarthamiFlos.Methods Using Agilent EC-C18(2.1 mm×50 mm，1.8 μm)column, the mobile phase consisted of 20 mmol/L ammonium formate+0.1% methane acid-acetonitrile using gradient elution. The column temperature was 40 ℃, ionization mode was ESI, and detection mode was MRM. The ion pair selected was: ①New fuchsin m/z 330.3→223.2，m/z 330.3→300.2; ②Auramine O m/z 268.2→147.2，m/z 268.2→252.2; ③Sudan Ⅳ m/z 381.2→224.1，m/z 381.2→91.1.Results The linear range of New fuchsin, Auramine O and Sudan Ⅳ was 0.1086-271.50 ng/ml, 0.1392-348.00 ng/ml and 0.1352-338.00 ng/ml, respectively, the recoveries were 97.45%, 96.44% and 97.58%, respectively, and RSD was 0.70%,1.12% and 0.89%, respectively. RSD of precision, stability and repeatability was less than 3%.Conclusions This method of extraction is simple to use, accurate for determination and highly sensitive. This method can be applied to the determination of illegal dyes of New fuchsin, Auramine O and Sudan Ⅳ in Carthami Flos.

LC-MS/MS;CarthamiFlos; New fuchsin;Auramine O;Sudan Ⅳ

李婷婷，碩士，主管藥師。

1.610045，成都市食品藥品檢驗研究院中藥室；2.330006 南昌，武警江西總隊醫(yī)院醫(yī)務(wù)處；3.330006，南昌大學(xué)藥學(xué)院

李 良，E-mail:liliang06f@sogou.com

R917