顧 勇，郭 輝，笪晨星，鄭清蓮

胎腎細胞懸液對去勢大鼠骨組織不同部位ER-α表達的影響

顧 勇1，郭 輝2，笪晨星1，鄭清蓮3

目的 探討胎腎細胞懸液(fetal renal cell suspension，F(xiàn)RCS)對去勢大鼠骨組織雌激素受體(ER-α)表達的影響，為“腎主骨” 理論提供實驗依據(jù)。方法 4月齡SD雌性大鼠隨機分成假手術(shù)組、模型對照組、雌激素組、胎腎細胞懸液組，假手術(shù)組僅去除卵巢周圍脂肪，給藥組在去除卵巢后4周分別給予雌二醇及FRCS，4周后處死所有大鼠，HE染色觀察骨組織形態(tài)學(xué)變化，放免法測定血清E2水平，免疫組化檢測ER-α在股骨干骺端不同部位的陽性表達情況。結(jié)果 與假手術(shù)組相比，模型對照組骨小梁稀疏，排列紊亂，骨小梁間隙增大明顯，血清E2水平明顯下降(P<0.01)；與模型對照組比較，雌激素、胎腎細胞懸液兩組骨小梁連續(xù)，排列整齊，E2水平升高(P<0.01)。子宮指數(shù)的變化與血清E2類似。與假手術(shù)組比較，模型對照組ER-α在股骨干骺端關(guān)節(jié)軟骨、骺板軟骨、骺板下初級小梁骨、髓腔的表達均明顯下降(P均<0.05)，與模型對照組比較，雌激素與胎腎細胞懸液組各部位ER-α表達明顯升高(P均<0.05)。結(jié)論 FRCS可通過調(diào)控骨組織中 ER-α的表達發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松作用。

胎腎細胞懸液；ER-α；骨質(zhì)疏松

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis, PMOP)屬于中醫(yī)“骨痿”、“骨痹”等范疇，其發(fā)病率位居世界常見病第7位，隨著人口老齡化趨勢加大，其患病率還將進一步升高[1]。胎腎細胞懸液(fetal renal cell suspension，F(xiàn)RCS)是利用胎鼠去除腎包膜的腎臟制取懸液，意在通過血肉有情之品，補養(yǎng)受累本臟之不足。前期研究已證實FRCS能夠延緩實驗大鼠骨質(zhì)疏松的作用，但FRCS調(diào)控骨代謝的機制尚不清楚，本實驗擬觀察FRCS對去勢大鼠性激素水平及骨組織不同部位雌激素受體( ER-α) 表達的影響，明確FRCS在骨代謝中的作用，以進一步證實“腎主骨”理論的科學(xué)內(nèi)涵。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 孕19～21 d的健康普通級SD雌性大鼠100只。4月齡雌性普通級SD大鼠80只，體重200～220 g。標準大鼠飼料由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物中心提供，動物飼養(yǎng)條件一致，SD大鼠取得屏障系統(tǒng)使用許可證(合格證號：醫(yī)動字第 26021108)。

1.2 藥物

1.2.1 FRCS制備 參照文獻[2]，將孕19～21 d SD同種母鼠，脫臼處死，無菌取出胎腎，去除腎包膜、腎蒂，并將其剪碎，移入200 目尼龍網(wǎng)，用 5 ml 注射器針芯研磨，邊研磨，邊用生理鹽水沖洗，收集細胞懸液。

1.2.2 苯甲酸雌二醇 西安化學(xué)試劑廠生產(chǎn)，生理鹽水稀釋配成 0. 25 mg/ml 溶液。

1.3 試劑 E2放射免疫檢測試劑盒購自天津九鼎醫(yī)學(xué)生物工程有限公司。ER-α多克隆抗體一抗、二抗，SP 免疫組化染色試劑盒，DAB 顯色試劑盒等購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.4 方法

1.4.1 造模 參照文獻[3]。80 只大鼠隨機分成兩組，一組 18 只為假手術(shù)組，另一組62只用于造模。造模的大鼠行雙側(cè)卵巢切除術(shù)，假手術(shù)組僅切除卵巢周圍少量脂肪組織。術(shù)后 1 周將存活的造模組健康大鼠 57 只稱重后，隨機分為模型對照組19只，雌激素組19只，胎腎組19只，術(shù)后4周開始給藥，雌激素組大鼠尾靜脈注射苯甲酸雌二醇 0.1 mg/kg，假手術(shù)組及模型對照組均注射生理鹽水 2 ml/kg，每周2次，連續(xù)干預(yù)處理4周后處死大鼠。造模后至用藥前大鼠死亡2只，原因考慮系傷口感染或失血過多，用藥過程中死亡1只，可能為靜脈注射操作失當(dāng)，導(dǎo)致空氣栓塞死亡。其中雌激素組死亡2只，模型對照組死亡1只。

1.4.2 E2血清學(xué)指標 采用放免法檢測測定。

1.4.3 骨組織、子宮形態(tài)學(xué)測定 各組大鼠中隨機取8只，采用左心室灌注固定，取出子宮及大鼠左側(cè)股骨，剝離附著的肌肉筋膜，用咬骨鉗截取遠端 1/3干骺端，經(jīng)固定、脫水、透明、石蠟包埋，切冠狀面連續(xù)5 μm切片用作免疫組化及 HE 染色。

1.4.4 ER-α骨組織免疫組織化學(xué)染色和半定量分析 采用SP法，每張免疫組化染色切片在所指定觀察部位隨機選取5個視野，應(yīng)用倒置顯微鏡高倍鏡(×400) 觀察并拍照，利用 MotiMed 6.0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)進行陽性目標積分光密度分析。

2 結(jié) 果

2.1 FRCS對去勢大鼠血清E2、子宮指數(shù)的影響 與假手術(shù)組比較，模型對照組血清E2表達水平、子宮指數(shù)明顯降低(P<0.01)； 與模型對照組比較，雌激素組、胎腎細胞懸液兩組血清E2水平、子宮指數(shù)升高(P<0.01，P<0.05，表1) 。

表1 各組大鼠血清E2水平及子宮指數(shù) (±s)

注：與假手術(shù)組比較，①P<0.01；與模型對照組比較，②P<0.05，③P<0.01

2.2 FRCS對去勢大鼠骨組織形態(tài)學(xué)的影響 模型對照組骨小梁拱橋形結(jié)構(gòu)改變，小梁壁表面不平整，平均寬度明顯變細，間距變寬，髓腔明顯擴大，被脂肪組織和造血組織填充；雌激素和胎腎兩組骨小梁基本連接呈網(wǎng)，排列相對整齊，密度、厚度明顯增加，但較假手術(shù)組骨小梁間隙仍較大(圖 1)。

圖1 各組大鼠骨組織形態(tài)學(xué)變化(HE，×100)

2.3 FRCS對去勢大鼠子宮內(nèi)膜形態(tài)學(xué)影響 假手術(shù)組子宮內(nèi)膜較厚，間質(zhì)疏松，血管豐富，腺體粗大，腺上皮為單層柱狀細胞。模型對照組子宮內(nèi)膜薄，間質(zhì)致密，血管少，腺體萎縮，腺上皮為單層扁平細胞。雌激素組子宮內(nèi)膜厚，間質(zhì)疏松，血管豐富，腺體粗大，數(shù)目較多，腺上皮為高柱狀，部分腺體有復(fù)層上皮。胎腎組子宮內(nèi)膜較厚，間質(zhì)疏松，血管豐富，腺體粗大，腺上皮為單層柱狀上皮(圖2)。

圖2 各組大鼠子宮內(nèi)膜形態(tài)學(xué)變化(HE，×100)

2.4 FRCS對骨組織ER-α免疫組化表達影響 ER-α免疫組化細胞質(zhì)和細胞核中均有表達(圖3)。與假手術(shù)組比較，模型對照組關(guān)節(jié)軟骨、骺板軟骨、骺板下初級小梁骨、髓腔的ER-α表達降低(P<0.05或P<0.01)；與模型對照組比較，雌激素組各部位ER-α表達水平增高(P<0.05或P<0.01)，胎腎組各部位ER-α表達水平明顯增高(P<0.05，表2)。

圖3 胎腎組大鼠骨組織ER-α在各部位的免疫組化陽性表達(DAB，×400)

表2 各組大鼠骨組織ER-α免疫反應(yīng)陽性目標積分光密度分析 (n=8；±s)

注：與假手術(shù)組比較，①P<0.05，②P<0.01；與模型對照組比較，③P<0.05，④P<0.01

3 討 論

PMO是指絕經(jīng)后婦女因卵巢功能衰退、雌激素水平下降導(dǎo)致全身性單位體積內(nèi)骨組織含量減少，骨密度下降及骨組織微結(jié)構(gòu)退行性病變?yōu)樘卣鞯拇x性疾病[4]。ER屬于核受體超家族成員，包括ER-α、ER-β兩種亞型。研究顯示，ER-α基因的多態(tài)性與PMO的發(fā)生及嚴重程度密切相關(guān)[5-7]。絕經(jīng)后卵巢功能減退導(dǎo)致的雌激素缺乏已是公認的PMO發(fā)生的重要原因，故雌激素替代療法(hormone replacement therapy, HRT)是治療PMO的首選方法[8]。但是，長期應(yīng)用雌激素可增加乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、心血管意外等發(fā)生概率[9]。因此，HRT不能用于一線骨質(zhì)疏松癥的預(yù)防及治療，但是可以利用雌激素的作用機制，尋找更為有效、安全的類雌激素樣藥物，如植物雌激素、雌激素受體調(diào)節(jié)藥等[10-12]。

FRCS是采用去除胎鼠腎包膜的腎臟制取懸液，通過血肉有情之品，補養(yǎng)受累本臟之不足，意在“以臟補臟”。前期課題組從骨形態(tài)學(xué)、骨生物力學(xué)、骨密度、骨礦含量及骨轉(zhuǎn)化的生化學(xué)方面發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)RCS能夠提高大鼠血清性激素水平，具有抗衰老及改善大鼠骨質(zhì)疏松的作用[13-15]，故推測FRCS可能發(fā)揮類雌激素樣作用，通過調(diào)控骨組織ER-α的表達影響骨代謝。

本課題采用去卵巢造模方式，同時給予雌二醇及FRCS干預(yù)。8周時發(fā)現(xiàn)模型對照組大鼠E2水平下降，光鏡下骨小梁中斷，間距變寬，髓腔明顯擴大，被脂肪組織和造血組織填充，失去原來的三維網(wǎng)架結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致骨干及骨皮質(zhì)變薄，松質(zhì)骨的整體力學(xué)強度下降。而雌激素及胎腎細胞懸液組骨小梁基本連接呈網(wǎng)，排列相對整齊，密度、厚度明顯增加，但較假手術(shù)組骨小梁間隙仍較大?？梢?，F(xiàn)RCS與雌二醇作用類似在一定程度上可延緩PMO的進程，但并不能逆轉(zhuǎn)PMOP的發(fā)生。

免疫組化切片發(fā)現(xiàn)，ER-α的免疫陽性表達主要集中于松質(zhì)骨的成骨細胞、各關(guān)節(jié)軟骨細胞、骺板軟骨細胞及骨髓間充質(zhì)細胞中，皮質(zhì)骨有較少表達，這也說明了為什么絕經(jīng)后松質(zhì)骨的受累程度遠遠超過皮質(zhì)骨[16]，同時我們發(fā)現(xiàn)，去勢后大鼠血清雌激素水平下降，股骨干骺端各部位的ER-α陽性表達均明顯減少，雌激素及FRCS干預(yù)后，各給藥組ER-α的表達顯著升高。這些說明：(1)在激素水平正常的情況下，雌激素可通過ER-α在骨代謝中發(fā)揮級聯(lián)反應(yīng)，參與維持骨代謝平衡[17]；(2)線性骨的生長是由骺板軟骨細胞所控制，骺板增生區(qū)及肥大區(qū)軟骨細胞中存在ER-α表達，提示ER-α在促進軟骨細胞增生、骺板閉合、影響長骨生長速率中起重要作用；(3)骨組織中ER-α的表達具有雌激素依賴性，雌激素水平降低后，其受體轉(zhuǎn)錄和翻譯水平同時受到抑制[5]，這一現(xiàn)象可被外源性FRCS有效阻止，其機制可能與FRCS通過促進性激素分泌及發(fā)揮“類激素”樣作用調(diào)節(jié)骨組織中ER-α的合成與分泌有關(guān)。

子宮增重法是檢測藥物雌激素活性最常用的評價方法[18]。本實驗結(jié)果顯示，OVX組大鼠子宮指數(shù)顯著下降，子宮內(nèi)膜明顯萎縮。應(yīng)用雌激素及FRCS干預(yù)后，子宮指數(shù)均不同程度地升高，子宮內(nèi)膜增厚，與雌激素作用相似，但FRCS引起的子宮增重效用與雌激素相比仍然較弱，反映出FRCS的“類激素”樣作用緩和，盡管不能逆轉(zhuǎn)機體自然衰老的過程，但可在一定程度上延緩生殖器官的衰老。

綜上所述，從現(xiàn)象方面FRCS具有“類激素”樣作用，可能通過調(diào)控骨組織 ER-α表達的影響調(diào)節(jié)骨代謝，從而改善去勢大鼠骨質(zhì)疏松模型的病理狀態(tài)，下一步課題組擬使用細胞芯片、蛋白芯片等手段，尋找FRCS影響的下游關(guān)鍵基因和分子，對其下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路進行深入的功能研究。

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(2016-06-20收稿 2016-08-10修回)

(責(zé)任編輯 武建虎)

Effect of fetal renal cell suspension on expression of bone ER-α in rats with ovariectomy

GU Yong1,GUO Hui2,DA Chenxing1，and ZHENG Qinglian3.

1.Digestive System Department，Shaanxi Provincial Crops Hospital of Chinese People’s Armed Police Force, Xi’an 710054, China；2.Health Division, Rear-service Department of Chinese People’s Armed Police Force, Beijing 100089,China;3.Department of Traditional Chinese Medicine，F(xiàn)irst Affiliated Hospital，Xi’an Jiaotong University，Xi’an 710061, China

Objective To investigate the effect of FRCS on expression of bone ER-αin rats with ovariectomy so as to provide evidence for the theory that the kidney dominates bones.Methods Four-month-old Sprague Dawley female rats were randomly divided into sham operated group, model control group, estrogen treatment group and FRCS treatment group. Only the fat around the ovary was removed in sham operated group, while ovaries were removed in other groups. Four weeks after operation, estrogen and FRCS were administered to rats of treatment groups respectively, and the treatment lasted four weeks. Then, the bone morphology was evaluated by HE stain, the serum level of E2was detected by radio-immunity, the protein expression of ER-α in cells of the bone tissue surface was investigated by immunohistochemical method.Results Compared with sham operated group, the bone trabecula in model control group was sparce and disorderly, the trabecular interspace was enlarged more obviously, and the serum level of E2decreased(P<0.01). Compared with model control group, the serum level of E2in estrogen treatment group and FRCS treatment group increased(P<0.01)and the bone brabecula was more continual and aligned in better order, the uterus index changed as serum E2did. Compared with sham operated group, the expression of ER-α decreased in the articular cartilage, epiphyseal plate, bone trabecula and bone marrow(AllP<0.05)in model control group. Compared with model control group, the expression of ER-α increased in estrogen treatment group and FRCS treatment group(AllP<0.05).Conclusions The mechanism by which FRCS can prevent and cure postmenopausal osteoporosis may lie in the ability of FRCS to modulate the expression of bone ER-α.

fetal renal cell suspension; ER-α; postmenopausal osteoporosis

顧 勇，博士，副主任醫(yī)師。

1.710054 西安，武警陜西總隊醫(yī)院消化內(nèi)科;2.100089 北京，武警部隊后勤部衛(wèi)生局；3.710061，西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院中醫(yī)科

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