馮梅，任薇，閆淑芳，劉亞君

(克拉瑪依市中心醫(yī)院急診科1、檢驗科2，新疆 克拉瑪依 834000)

膿毒癥患者血漿miR-223表達(dá)水平及其臨床意義

馮梅1，任薇1，閆淑芳1，劉亞君2

(克拉瑪依市中心醫(yī)院急診科1、檢驗科2，新疆 克拉瑪依 834000)

目的探討膿毒癥患者血漿miR-223表達(dá)水平及其診斷價值。方法選取克拉瑪依市中心醫(yī)院2013年3月至2016年2月收治的膿毒癥患者31例(病例組)和同期健康查體者33例(對照組)為研究對象，分別采用實時熒光定量PCR(real-time PCR)法和免疫比濁法檢測兩組患者血漿miR-223和C反應(yīng)蛋白(CRP)表達(dá)水平，并應(yīng)用受試者工作特征曲線(ROC曲線)計算miR-223和CRP診斷膿毒癥的價值。結(jié)果病例組患者的血漿miR-223和CRP表達(dá)水平分別為(19.56±5.78)×10-4copy和(48.61±12.88)mg/L，對照組分別為(12.22±4.75)×10-4copy和(8.63± 3.21)mg/L，病例組患者的miR-223和CRP均明顯著高于對照組，差異均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)；血漿miR-223、CRP及兩者聯(lián)合診斷膿毒癥的敏感性分別為83.3%、60.9%和80.6%，特異性分別為71.9%、53.1%和81.3%，ROC曲線下面積AUC分別為0.82，0.67和0.90。結(jié)論膿毒癥患者血漿微小miR-223和CRP均顯著升高，可作為膿毒癥診斷的生物學(xué)參考指標(biāo)。

膿毒癥；miR-223；C反應(yīng)蛋白；臨床意義

膿毒癥(sepsis)是較為嚴(yán)重的全身感染性疾病，全世界范圍內(nèi)發(fā)病率均較高，臨床流行病學(xué)資料顯示，全球每年新發(fā)膿毒癥病例高達(dá)1 800萬，北美每年新發(fā)膿毒癥病例為75萬，且以每年1.5%～8.0%的速度上升[1]。我國目前尚無確切膿毒癥患者的流行病學(xué)數(shù)據(jù)，但根據(jù)我國人口數(shù)量眾多、老齡人口比例較高等因素推測，膿毒癥患者數(shù)遠(yuǎn)高于北美，每年新發(fā)病例應(yīng)高達(dá)數(shù)百萬人[2]。近年來，有文獻(xiàn)報道膿毒癥患者微小RNA表達(dá)譜與正常人相比發(fā)生明顯的改變，部分微小RNA表達(dá)水平顯著上升，部分表達(dá)下降[3]。在本研究中，筆者對比分析膿毒癥患者血漿中微小RNA miR-223的表達(dá)情況及其作為診斷膿毒癥血清學(xué)標(biāo)志物的可行性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取我院2013年3月至2016年2月收治的膿毒癥患者31例(病例組)和健康查體者33例(對照組)。病例組納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合美國危重癥協(xié)會膿毒癥診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]；(2)年齡大于18周歲；(3)留取患者血液標(biāo)本經(jīng)家屬簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)膿毒癥診斷不明確；(2)人類獲得性免疫缺陷綜合征患者(HIV患者)；(3)惡性腫瘤患者；(4)孕婦。病例組31例患者中男性20例，女性11例，平均年齡(65.18±11.23)歲，APACHEⅡ評分為(19.68±5.88)分；對照組為同期健康體檢人群，其中男性21例，女性12例，平均年齡(66.32±12.54)歲，并排除感染性疾病患者。

1.2 試劑與儀器 RNA提取試劑盒(購自日本Takara公司)；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(購自日本Takara公司)；DNA聚合酶(購自日本Takara公司)；引物序列(由深圳吉瑪公司合成)；CRP免疫比濁試劑盒，購自美國BIOSOURCE公司；實時熒光定量PCR儀(購自美國ABI公司)；

1.3 檢測方法

1.3.1 標(biāo)本留取 患者入院并確診膿毒癥后24 h內(nèi)抽取貴要靜脈血5 mL，1 600 r/min離心4 min后汲取上層血漿，并置于無菌EP管中-80℃冰箱保存待檢。

1.3.2 miR-223表達(dá)水平 采用real-time PCR法檢測血漿中miR-223表達(dá)水平，首先應(yīng)用Taka公司生產(chǎn)的RNA提取試劑盒提前RNA，并經(jīng)反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄為cDNA后采用ABI公司的real-time PCR儀進(jìn)行檢測。檢測體系為:SYBR Green 10 μL,上游引物1 μL，下游引物1 μL，dNTP 1 μL，Taq聚合酶2 μL，待測樣品cDNA 5 μL，ddH2O 30 μL，real-time PCR結(jié)果見圖1。

圖1 溶解曲線(A)與擴(kuò)增曲線(B)

1.3.3 血漿CRP水平 采用免疫比濁法檢測血漿CRP水平，檢測步驟按試劑盒操作說明進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用student-t檢驗，診斷實驗根據(jù)貝葉斯定理計算診斷敏感性和特異性并繪制ROC曲線，計算AUC面積，雙側(cè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組患者血漿miR-223和CRP水平比較 病例組患者的血漿miR-223和CRP水平明顯高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見表1。

表1 兩組患者血漿miR-223和CRP水平比較(±s)

表1 兩組患者血漿miR-223和CRP水平比較(±s)

組別病例組(n=31)對照組(n=33 t值P值miR-223(×10-4copy) 19.56±5.78 12.22±4.75 5.04 0.00 CRP(mg/L) 48.61±12.88 8.63±3.21 7.31 0.00

2.2 ROC曲線分析miR-223和CRP診斷價值 血漿miR-223、CRP以及兩者聯(lián)合診斷膿毒癥的敏感性分別為83.3%、60.9%和80.6%，特異性分別為71.9%、53.1%和81.3%，見表3，鑒別診斷的ROC曲線下面積AUC分別為0.82、0.67和0.90，見圖2。

表2 miR-223和CRP診斷膿毒癥的價值

圖2 血漿miR-223、CRP診斷膿毒癥ROC曲線

3 討 論

近年來，隨著人們對微小RNA研究的不斷深入，研究人員發(fā)現(xiàn)，微小RNA參與人類和哺乳動物中多種疾病的發(fā)生發(fā)展[5]。這些疾病包括惡性腫瘤、自身免疫性疾病、心血管疾病及其他慢性疾病。而新近的研究顯示，microRNA可能同時也參與人類感染性疾病的發(fā)病過程，包括膿毒癥等[6]。

膿毒癥是由細(xì)菌、真菌、病毒、寄生蟲等病原微生物感染導(dǎo)致的全身炎性反應(yīng)綜合征，其病生理過程涉及體內(nèi)多個器官和系統(tǒng)，膿毒癥是嚴(yán)重創(chuàng)傷、休克、感染、重癥患者常見的并發(fā)癥[7]。致病菌進(jìn)入人體后，開始產(chǎn)生大量的炎性因子參與反應(yīng)，當(dāng)炎性反應(yīng)失衡時對機(jī)體的功能造成一定損害。同時新近的研究顯示microRNA在膿毒癥發(fā)生發(fā)展中起到重要作用[1]。

MicroRNA是一類由內(nèi)源基因編碼的長度約為22個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，它們在動植物中參與轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控。大多數(shù)microRNA以單拷貝、多拷貝或基因簇(cluster)的形式存在于細(xì)胞組中。研究發(fā)現(xiàn)microRNA參與人類各種生命活動的調(diào)節(jié)，例如發(fā)育、病毒防御、器官形成等[5]。最近的研究發(fā)現(xiàn)microRNA與人類多種感染性疾病有關(guān)[1,6]。Goodwin等[9]通過對比膿毒癥患者和健康人群中微小RNA表達(dá)譜發(fā)現(xiàn)，在膿毒癥患者與健康人群中存在眾多差異表達(dá)的微小RNA，其中上調(diào)表達(dá)的micrRNA在膿毒癥患者中更為常見。

miR-223是新近被鑒定出來的小干擾RNA，并發(fā)現(xiàn)miR-223在敗血癥患者體內(nèi)明顯增高，與正常人群存在明顯的差異表達(dá)[10]，因此我們推測，血漿miR-223理論上可作為敗血癥的生物學(xué)標(biāo)記物。但關(guān)于血漿miR-223用于診斷膿毒癥的臨床研究鮮有報道。因此，在本研究中，我們對比了膿毒癥患者與正常人群血漿中miR-223的表達(dá)水平。研究發(fā)現(xiàn)膿毒癥患者血漿中miR-223的表示水平顯著高于正常人群，提示miR-223可能在膿毒癥的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮一定的生物學(xué)功能。同時由于膿毒癥患者與健康人群miR-223存在明顯的差異表達(dá)，其可作為膿毒癥診斷的標(biāo)記物，其診斷膿毒癥的敏感性和特異性分別為83.3%和71.9%。診斷敏感性較高，但特異性較低，僅為71.9%，但在本研究中，我們將miR-223與血漿CRP聯(lián)合檢查并作為診斷膿毒癥的參考指標(biāo)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-223聯(lián)合CRP的診斷敏感性為80.6%特異性為81.3%，特異性顯著提高。

因此，本研究認(rèn)為，miR-223在膿毒癥患者體內(nèi)顯著增高，可作為膿毒癥輔助診斷的參考指標(biāo)。但本研究納入患者例數(shù)相對較少，統(tǒng)計學(xué)效能較低，較少的患者例數(shù)可能無法全面覆蓋不同嚴(yán)重程度的膿毒癥患者。因而，下一步應(yīng)繼續(xù)增加樣本量，進(jìn)一步探討血漿miR-223用于膿毒癥輔助診斷的臨床價值。

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Expression of miR-223 in plasma of patients with sepsis and its clinical significance.

FENG Mei1,REN Wei1,YAN Shu-fang1,LIU Ya-jun2.Department of Emergency1,Department of Clinical Laboratory2,Kelamay Central Hospital, Kelamay 834000,Xinjiang,CHINA

ObjectiveTo investigate the expression of miR-223 in patients with sepsis and its diagnostic value.MethodsThirty-one patients with sepsis(the study group)who were treated in Kelamay Central Hospital during March 2013 to February 2016 and thirty-three healthy(the control group)subjects during the same period were enrolled in this study.The expression levels of miR-223 and C-reactive protein(CRP)in the two groups were measured by real-time PCR and immuno-turbidimetry,respectively.ROC curve was used to calculate the value of miR-223 and CRP in the diagnosis of sepsis.ResultsThe serum level of miR-223 and CRP in the study group were(19.56±5.78)×10-4copy and(48.61±12.88)mg/L,respectively,which were significantly higher than(12.22±4.75)×10-4copy and(8.63±3.21)mg/L in the control group(P＜0.01).The sensitivity,specificity and area under the ROC curve(AUC)of miR-223,CRP and combination of miR-223 and CRP were 83.3%,60.9%,80.6%,71.9%,53.1%,81.3%,and 0.82,0.67,0.90,respectively.ConclusionThe levels of miR-223 and CRP are significantly increased in the plasma of patients with sepsis,and it can be used as biological reference indicators for the diagnosis of sepsis.

Sepsis;miR-223;C-reactive protein;Clinical significance

R631

A

1003—6350（2017）01—0089—03

2016-06-03)

馮梅。E-mail：meif_klmy@163.com

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.01.027