黃巧玲，覃聰，黃廣群

(來賓市中醫(yī)醫(yī)院檢驗科，廣西 來賓 546100)

NLRP3炎癥小體及其下游炎癥因子在動脈粥樣硬化炎癥反應中的作用

黃巧玲，覃聰，黃廣群

(來賓市中醫(yī)醫(yī)院檢驗科，廣西 來賓 546100)

目的探討NLRP3炎癥小體及其下游炎癥因子在動脈粥樣硬化炎癥反應中的作用。方法選擇氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)作用于人單核細胞系THP-1，經Western blot法檢測NLRP3及其下游炎癥因子半胱天冬酶-1(Caspase-1)、白介素-1β(IL-1β)和白介素-18(IL-18)的表達；并采用SiRNA技術下調空白處理組(Blank組)和ox-LDL處理組NLRP3基因表達，分別檢測以上指標。結果與空白處理組相比，50 mg/L、100 mg/L、150 mg/L的ox-LDL作用于單核細胞后可促進NLRP3的表達，NLRP3下游的Caspase-1、IL-1β和IL-18表達水平與NLRP3表達一致，表達也均明顯升高，差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。NLRP3小干擾RNA(SC-45469)轉染后，Blank組與ox-LDL組的NLRP3及其下游炎癥因子Caspase-1、IL-1β和IL-18的表達均有顯著下降(P＜0.05)；而轉染后Blank組與ox-LDL組各指標下降率組間比較差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。結論NLRP3炎癥小體參與動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的過程，其可能通過改變ox-LDL的表達水平，誘發(fā)炎癥相關因子Caspase-1、IL-1β和IL-18的分泌來調節(jié)，NLRP3炎癥小體具有成為臨床上防治動脈粥樣硬化的新靶點的重要潛力。

動脈粥樣硬化；NLRP3；炎癥小體；氧化低密度脂蛋白；炎癥因子

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是動脈硬化中最常見的一種血管病，以動脈壁的脂質沉積、功能紊亂及斑塊形成、慢性炎性細胞浸潤為主要特征，是冠心病形成及發(fā)展的主要病理過程[1]。研究發(fā)現，膽固醇、低密度脂蛋白(low-density lipoprotein，LDL)、感染性微生物、高血壓、吸煙等誘發(fā)因素的共同作用都會誘導慢性炎癥反應，從而最終會使得患者的動脈粥樣硬化形成[2]。由于參與動脈粥樣硬化發(fā)生機制和發(fā)展過程的細胞因子和基因產物等因素復雜繁多，導致其在臨床預防和治療上難度重重，因此發(fā)病率和病死率逐年升高。進而，深入探索動脈粥樣硬化發(fā)生和發(fā)展的病理生理機制，尋求臨床治療AS的有效途徑和創(chuàng)新靶點，成為當下心血管專家的關注焦點和研究熱點。為了進一步探究AS炎癥反應中NLRP3炎癥小體及其下游炎癥因子的作用，本研究通過氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL)作用于人單核細胞系THP-1模擬動脈粥樣硬化炎癥反應，檢測NLRP3、半胱天冬酶-1(Caspase-1)、白介素-1β (interleukin-1β，IL-1β)和白介素-18(interleukin-18，IL-18)的表達，以闡明NLRP3炎癥小體在AS炎癥反應中的作用機制，為臨床治療AS提供了相關的理論依據，同時也提供了新的治療靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 人單核細胞系THP-1，購自中國科學院上海生物細胞所；ox-LDL，購自北京協生生物科技有限責任公司；NLRP3(SC-34411)、Caspase-1 (SC-622)、IL-1β(SC-7884)、IL-18(SC-7954)、β-actin (SC-130656)一抗，羊抗兔IgG，購自美國Santa cruz公司；NLRP3小干擾RNA(SC-45469)，購自美國Santa cruz公司；LipofectamineTM2000 Reagent，購自美國Invitrogen公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 THP-1細胞培養(yǎng) 細胞復蘇后置入PRIM-1640培養(yǎng)液中，于37℃、5%、CO2條件下培養(yǎng)細胞，待細胞生長融合至80%時，胰酶消化并傳代，所有實驗細胞均選取3～4代進行。

1.2.2 Western blot法檢測NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18、β-actin蛋白表達情況 取對數生長期細胞2×108/L接種于6孔培養(yǎng)板中，分為4組，空白對照組和分別加入終劑量為50 mg/L、100 mg/L、150 mg/L ox-LDL的給藥組，于37℃、5%、CO2條件下培養(yǎng)24 h后用細胞裂解液提取總蛋白，BCA蛋白定量，SDS-PAGE電泳，轉膜，封閉。NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18、β-actin一抗(1:1 000)過夜，洗膜，孵育二抗(1:50 000)，洗膜，加入ECL試劑，曝光，顯影，定影，分析。

1.2.3 NLRP3小干擾 RNA轉染 無血清PRIM-1640培養(yǎng)基稀釋小干擾RNA，參照說明書將300 μL轉染復合物(小干擾RNA與LipofectamineTM2000以1:4混合)靜置15 min后，與THP-1細胞空白對照組和ox-LDL組(100 mg/L)于37℃、5%、CO2條件下共同孵育6 h，去除培養(yǎng)基更換新鮮培養(yǎng)基，再次檢測以上指標。

1.3 統(tǒng)計學方法 應用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差(±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，NLRP3小干擾RNA轉染下各指標及下降率比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 ox-LDL誘導下人單核中NLRP3及其下游炎癥因子的表達變化 50 mg/L、100 mg/L、150 mg/L的ox-LDL分別作用于單核細胞后可促進NLRP3的表達，較空白處理組明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，并具有濃度依賴性；NLRP3下游的Caspase-1、IL-1β和IL-18表達水平與NLRP3表達一致，表達也均顯著升高，差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見表1。

表1 ox-LDL誘導下人單核NLRP3及其下游炎癥因子的表達變化(±s)

表1 ox-LDL誘導下人單核NLRP3及其下游炎癥因子的表達變化(±s)

注：與Blank組比較，aP＜0.05。

組別NLRP3caspase-1IL-1βIL-18 Blank組ox-LDL 50 mg/L組ox-LDL 100 mg/L組ox-LDL 150 mg/L組F值P值1.03±0.25 1.52±0.31a1.97±0.29a2.25±0.33a8.332 0.031 1.02±0.27 2.54±0.42a3.24±0.37a4.21±0.45a8.348 0.029 1.05±0.21 2.35±0.38a3.29±0.41a4.40±0.45a8.42 0.026 1.04±0.22 2.25±0.34a3.30±0.39a3.61±0.29a8.451 0.023

2.2 NLRP3小干擾RNA轉染對NLRP3及其下游炎癥因子表達的影響 NLRP3小干擾RNA (SC-45469)轉染后，Blank組與ox-LDL組的NLRP3及其下游炎癥因子Caspase-1、IL-1β和IL-18的表達均有顯著下降(P＜0.05)；而轉染后Blank組與ox-LDL組各指標下降率組間比較差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，見表2。

表2 NLRP3小干擾RNA轉染對NLRP3及其下游炎癥因子表達的影響(±s)

表2 NLRP3小干擾RNA轉染對NLRP3及其下游炎癥因子表達的影響(±s)

注：與本組轉染前比較，aP＜0.05。

組別Blank組ox-LDL組時間轉染前轉染后轉染前轉染后NLRP3 1.02±0.31 0.50±0.35a2.46±0.37 1.53±0.35aCaspase-1 1.04±0.30 0.41±0.32a3.10±0.42 1.31±0.38aIL-1β 1.01±0.39 0.45±0.36a3.03±0.47 1.14±0.37aIL-18 1.05±0.28 0.55±0.44a2.93±0.51 1.32±0.31a

3 討論

動脈粥樣硬化會對大中動脈內膜及中層等結構產生重要的影響，最終發(fā)展成為冠心病，也是心腦血管疾病的重要致病因素[3]，而血管壁功能的紊亂以及斑塊形成是動脈粥樣硬化的主要特點。冠心病作為發(fā)達國家死亡患者的首要原因，已被越來越多的研究學者所重視，越來越多的研究表明，動脈粥樣硬化歸根究底也是一種慢性炎癥，炎癥的情況會伴隨著動脈粥樣硬化的各個階段，在這整個過程中炎癥細胞因子起到了重要的作用[4-5]。根據相關研究證實，先天免疫模式識別受體(pattern-recognition receptors，PRRs)介導的炎癥反應對動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展起到了重要的作用，同時發(fā)揮著橋梁作用[6]。PRPs主要包括位于胞膜表面的Toll樣受體(toll-like receptors，TLRs)和胞漿內的NOD樣受體(NLRs)[7-8]，在NLRs中，NLRP3炎癥小體逐漸被發(fā)現可能參與AS炎癥反應。

NLRP3在冠狀動脈硬化早期就開始發(fā)揮作用，LDL可使患者血管壁沉積大量的膽固醇結晶。當巨噬細胞吞噬這些膽固醇結晶后，自然而然轉化為泡沫細胞。而泡沫細胞通過破壞溶酶體釋放活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)和蛋白酶激活NLRP3，同時進一步促使炎癥因子誘導巨噬細胞、中性粒細胞、淋巴細胞和血管平滑肌細胞浸潤和活化。而這些活化的細胞又促進IL-1、IL-18等炎癥因子生成，從而引起更多的血管平滑肌細胞壞死，形成惡性循環(huán)。而在細胞外的膽固醇和纖維素隨著時間的延續(xù)，不停的進行堆積，使得磷酸鈣結晶，而后沉積，同時又使得巨噬細胞中溶酶體進一步快速破裂[9-11]。本研究指出，NLRP3炎癥小體參與動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的過程，可能是通過改變ox-LDL的表達水平，誘發(fā)炎癥相關因子Caspase-1、IL-1β和IL-18的分泌來調節(jié)的。而我們通過NLRP3小干擾RNA(SC-45469)轉染，干預NLRP3的高水平表達，從而有效降低了炎癥小體及其下游炎癥因子的表達水平，本研究指出NLRP3炎癥小體具有成為臨床上防治動脈粥樣硬化的新靶點的重要潛力。但本研究僅局限在ox-LDL的誘導上，動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展還受其他更多的脂質體和細胞因子等調控，因此在接下來的研究中，筆者需要通過調節(jié)不同的脂質體和其他細胞因子來模擬動脈粥樣硬化的生理病理過程，并擴大炎癥小體的研究范圍，從更全面的角度和視野探索出最佳的治療途徑和方法。

綜上所述，NLRP3炎癥小體參與動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的過程，其可能通過改變ox-LDL的表達水平，誘發(fā)炎癥相關因子Caspase-1、IL-1β和IL-18的分泌來調節(jié)，NLRP3炎癥小體具有成為臨床上防治動脈粥樣硬化的新靶點的重要潛力。

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Roles of NLRP3 inflammasome and its downstream inflammatory cytokines in inflammatory response of atherosclerosis.

HUANG Qiao-ling,QIN Cong,HUANG Guang-qun.Department of Clinical Laboratory,Laibin City Hospital of Traditional Chinese Medicine,Laibin 546100,Guangxi,CHINA

ObjectiveTo investigate the roles of NLRP3 inflammasome and its downstream inflammatory cytokines in inflammatory response of atherosclerosis.MethodsNLRP3 and its downstream inflammatory cytokines of Caspase-1,interleukin-1 beta(IL-1β)and interleukin-18(IL-18)expression were detected by western blot with oxidized low-density lipoprotein(ox-LDL)in human monocytic THP-1 cell line.SiRNA technology was applied to down-regulate the expression of NLRP3 gene in blank treatment group(blank group)and ox-LDL treatment group, and the above indicators were detected.ResultsCompared with the blank group,ox-LDL(50 mg/L,100 mg/L and 150 mg/L)in the mononuclear cells can significantly promote the expression of NLRP3,as well as its downstream in-flammatory cytokines of Caspase-1,IL-1β and IL-18(P＜0.05).After transfection of SiRNA(SC-45469),the expression of NLRP3 and Caspase-1,IL-1β and IL-18 in blank group and ox-LDL treament group were significantly decreased(P＜0.05),but the inhibition rate of each index showed no significant difference between the two groups(P＞0.05).ConclusionNLRP3 inflammasome is involved in the development of atherosclerosis by changing the expression of ox-LDL and inducing the secretion of inflammation-related factors(Caspase-1,IL-1β and IL-18),which has potential to become the new target for the prevention and treatment of atherosclerosis.

Atherosclerosis;NLRP3;Inflammasome;Oxidized low-density lipoprotein;Inflammatory cytokines

R541.4

A

1003—6350（2017）01—0086—03

2016-06-01)

黃巧玲。E-mail：qiaolhuang@163.com

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.01.026