李丹丹 魏雨田 陳 燕

華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院 河北唐山 063000

二甲雙胍抑制耐藥卵巢癌細(xì)胞生長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)研究

李丹丹 魏雨田 陳 燕

華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院 河北唐山 063000

①目的 研究二甲雙胍是否對(duì)耐藥卵巢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)有抑制作用。②方法MTT法檢測(cè)不同濃度二甲雙胍(0、1.25mmol/L、2.5mmol/L、5mmol/L、10mmol/L、20mmol/L、40mmol/L、80mmol/L)作用48小時(shí)后對(duì)卵巢癌SKOV3/DDP細(xì)胞生存率的影響。③結(jié)果 二甲雙胍對(duì)于SKOV3/DDP細(xì)胞具有劑量依賴(lài)的抑制作用(P<0.05)，最大抑制率為72%。④結(jié)論 二甲雙胍不僅能夠抑制卵巢癌SKOV3/DDP細(xì)胞增殖而且隨著濃度的增高抑制性增強(qiáng)。

二甲雙胍 卵巢癌 增殖

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)三大惡性腫瘤之一，而且其病死率位居首位，成為婦科惡性腫瘤致死的主要原因。我國(guó)卵巢癌的發(fā)病率及病死率呈逐年上升趨勢(shì)[1]。目前臨床上的主要治療方案是腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)聯(lián)合以紫杉醇、鉑類(lèi)為主的化療。但是現(xiàn)有的研究表明，化療不良反應(yīng)較大，而且化療價(jià)格昂貴以及原發(fā)性與獲得性耐藥等原因，導(dǎo)致5年生存率仍然很低。所以，越來(lái)越多的科研工作者對(duì)于發(fā)現(xiàn)新型化療藥物、提高現(xiàn)有化療藥物的敏感性或者逆轉(zhuǎn)化療耐藥投以高度的關(guān)注。二甲雙胍是目前臨床上廣泛應(yīng)用的治療糖尿病的藥物，主要作用機(jī)制為抑制肝糖元分解，也能夠改善外周組織對(duì)胰島素的敏感性、增加葡萄糖的攝取和利用。同時(shí)促進(jìn)脂肪和肌肉組織對(duì)葡萄糖的攝取，從而達(dá)到降低血糖的作用。最近研究發(fā)現(xiàn)二甲雙胍不僅是一種非常好的治療糖尿病藥物，還具有多重抗腫瘤效應(yīng)[2]，它可有效抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期停滯，能夠抑制肝癌、胰腺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌和腎癌等腫瘤的生長(zhǎng)[3～5]。但其抗腫瘤作用機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，仍需要進(jìn)一步研究[6,7]。二甲雙胍能夠抑制人腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，但是對(duì)卵巢癌的抑制作用及機(jī)制尚不明確。因此，本研究將探討二甲雙胍對(duì)卵巢癌SKOV3/DDP細(xì)胞增殖的影響，為卵巢癌的臨床預(yù)防及治療提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 人卵巢癌SKOV3和SKOV3/DDP細(xì)胞(北京協(xié)和細(xì)胞庫(kù))；二甲雙胍(sigma公司)、MTT(Sigma公司)；1640培養(yǎng)基(HyClone)、胎牛血清(HyClone)、胰酶(Biological Industries)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 卵巢癌細(xì)胞的培養(yǎng) 卵巢癌SKOV3/DDP細(xì)胞株是通過(guò)長(zhǎng)期小劑量順鉑刺激SKOV3培養(yǎng)出的具有耐藥性的卵巢癌細(xì)胞株。將耐藥細(xì)胞株SKOV3/DDP接種于15%磷酸鹽緩沖液(FBS)的1640培養(yǎng)基中、置于37℃含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將親本細(xì)胞SKOV3接種于10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在倒置相差顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞，待細(xì)胞鋪滿(mǎn)80%時(shí)，棄掉培養(yǎng)基，用胰酶消化后在顯微鏡下觀(guān)察，當(dāng)細(xì)胞回縮為圓形時(shí)，加入培養(yǎng)基終止消化。輕輕吹打細(xì)胞，當(dāng)貼壁細(xì)胞懸浮，無(wú)細(xì)胞團(tuán)，將細(xì)胞放入新的培養(yǎng)瓶中，加入培養(yǎng)基，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2 MTT法檢測(cè)二甲雙胍對(duì)卵巢癌細(xì)胞的增殖抑制率 取長(zhǎng)滿(mǎn)培養(yǎng)瓶80%的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SKOV3和SKOV3/DDP 細(xì)胞，去掉培養(yǎng)基，用PBS沖洗兩遍，再用胰酶消化2～3分鐘，然后加入完全培養(yǎng)基終止消化，用槍頭輕輕吹打細(xì)胞至無(wú)細(xì)胞團(tuán)，然后用移液管，將混勻的細(xì)胞懸液吸至50mL離心管中，上離心機(jī)，1500r/min離心5min，丟棄上清，然后加入培養(yǎng)基5mL稀釋?zhuān)眉?xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，進(jìn)而根據(jù)細(xì)胞密度，再加入適量培養(yǎng)基，最終稀釋成1×104/mL，并將其加入96孔板中，每孔加入200μL，細(xì)胞培養(yǎng)箱中過(guò)夜，當(dāng)細(xì)胞貼壁后，棄掉原有培養(yǎng)基，用PBS沖洗2遍，然后再加入二甲雙胍濃度梯度為0、1.25mmol/L、2.5mmol/L、5mmol/L、10mmol/L、20mmol/L、40mmol/L、80mmol/L的復(fù)合培養(yǎng)基，重復(fù)5次，培養(yǎng)48小時(shí)，到規(guī)定時(shí)間后，從溫箱中拿出96孔板，吸凈原有培養(yǎng)基，繼而每孔加入噻唑藍(lán)20μL，在溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)4個(gè)小時(shí)，再次吸凈，每孔再加入二甲亞砜(DMSO)10μL，震蕩混勻，使結(jié)晶物充分溶解，選擇波長(zhǎng)為490nm，在酶聯(lián)免疫吸附儀上測(cè)定各孔OD值。測(cè)定細(xì)胞增殖抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組光度吸收值OD值/對(duì)照組光度吸收值OD值)×100%。比較不同濃度二甲雙胍對(duì)親本細(xì)胞SKOV3和耐藥細(xì)胞SKOV3/DDP增殖抑制作用。

2 結(jié)果

2.1 卵巢癌SKOV3/DDP細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀(guān)察 在倒置相差顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞形態(tài),二甲雙胍作用48小時(shí)后，對(duì)照組SKOV3/DDP細(xì)胞生長(zhǎng)良好，多為梭形，貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)飽滿(mǎn)，經(jīng)不同濃度二甲雙胍干預(yù)后，存活細(xì)胞數(shù)目減少，細(xì)胞形態(tài)改變，收縮變小，細(xì)胞體內(nèi)顆粒感增強(qiáng)，透光性差，細(xì)胞與細(xì)胞間邊界不清楚。隨著二甲雙胍濃度的增加，上述現(xiàn)象更加明顯，見(jiàn)圖1。

注：A:對(duì)照組(4×);B:對(duì)照組(10×);C:10mmol/L的二甲雙胍(10×)；D:80mmol/L的二甲雙胍(10×)

圖1 二甲雙胍干預(yù)48小時(shí)各組與對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)的比較。

2.2 二甲雙胍可抑制卵巢癌耐藥細(xì)胞SKOV3/DDP的增殖MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，二甲雙胍的濃度越高，對(duì)卵巢癌親本細(xì)胞SKOV3和耐藥細(xì)胞SKOV3/DDP的增殖抑制率越高，提示在體外研究中，二甲雙胍可以抑制卵巢癌耐藥細(xì)胞SKOV3/DDP的增殖活性。當(dāng)作用時(shí)間固定為48小時(shí)，不同濃度的二甲雙胍組的增殖抑制率與對(duì)照組比較有差異(P<0.05)。提示增殖抑制率具有濃度依賴(lài)性，最大抑制率為72%。而相同濃度二甲雙胍對(duì)卵巢癌親本細(xì)胞和耐藥細(xì)胞增殖抑制率的影響無(wú)明顯差異(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 不同濃度二甲雙胍對(duì)卵巢癌細(xì)胞的增殖抑制率±s)

3 討論

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)中常見(jiàn)的惡性腫瘤，是病死率最高的婦科惡性腫瘤之一，對(duì)婦女的生命和身體健康造成了嚴(yán)重威脅。卵巢位于盆腔深部，所以卵巢癌起病隱秘，早期的癥狀和體征不明顯，就診時(shí)絕大部分已經(jīng)是晚期，多有盆腹腔轉(zhuǎn)移，患者預(yù)后不好?，F(xiàn)在卵巢癌首選的治療方案是腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)聯(lián)合以鉑類(lèi)和紫杉醇類(lèi)為主的術(shù)后輔助化療。盡管有大約70%～80%卵巢癌患者對(duì)鉑類(lèi)為主的初始化療有效，然而耐藥率特別高，5年生存率不到1/3。所以尋找新型化療藥成為非常有意義和亟待解決的問(wèn)題。

二甲雙胍單獨(dú)應(yīng)用很少引起低血糖，并且，二甲雙胍被認(rèn)為有助于延緩或改善糖尿病血管并發(fā)癥，這種改善作用不僅體現(xiàn)在其能降低血糖，而且能夠調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、內(nèi)分泌功能、高凝狀態(tài)和血小板機(jī)能亢進(jìn)，這些調(diào)節(jié)功能跟腫瘤的發(fā)生、發(fā)展也密切相關(guān)。二甲雙胍的抗腫瘤作用最初是通過(guò)觀(guān)察性研究調(diào)查發(fā)現(xiàn)的。通過(guò)收集大量的臨床病例，經(jīng)過(guò)嚴(yán)密的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)糖尿病患者發(fā)生腫瘤的概率高于非糖尿病患者，而臨床上應(yīng)用二甲雙胍來(lái)降低血糖的患者的腫瘤發(fā)生率明顯減小。Libby等[8]通過(guò)對(duì)8 000例糖尿病患者的觀(guān)察分析發(fā)現(xiàn)，有大概半數(shù)的患者接受二甲雙胍治療，另外約1/2的患者接受其他藥物治療，最終發(fā)現(xiàn)應(yīng)用二甲雙胍的患者惡性腫瘤發(fā)生率為7.3%，而使用其他藥物的患者惡性腫瘤發(fā)生率為11.6%，隨訪(fǎng)時(shí)間中位數(shù)分別為 3.5年及2.6年(P<0.01)。與此同時(shí)，口服二甲雙胍治療的患者總的腫瘤相關(guān)病死率為3.0%，而應(yīng)用其他治療的患者總的腫瘤相關(guān)病死率為6.1%，明顯比前者高。從而得出結(jié)論，二甲雙胍提高了腫瘤患者的生存率。最近在動(dòng)物及實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞研究上取得一些進(jìn)展，讓人們發(fā)現(xiàn)二甲雙胍具有抗腫瘤的多種生物活性，比如說(shuō)能抑制乳腺癌、前列腺癌、腎癌、卵巢癌、胰腺癌、結(jié)腸癌和神經(jīng)膠質(zhì)瘤等多種惡性腫瘤的生長(zhǎng)[9,10]，主要表現(xiàn)為對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用、對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用、活化腫瘤對(duì)化療藥物的敏感性、抑制腫瘤新生血管的生成[11]。但是二甲雙胍對(duì)卵巢癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用及機(jī)制還沒(méi)有明確的定論，因此本次實(shí)驗(yàn)研究在體外探討二甲雙胍對(duì)卵巢癌SKOV3/DDP細(xì)胞增殖的影響，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步顯示，二甲雙胍能夠明顯抑制卵巢癌SKOV3/DDP細(xì)胞增殖，并且具有濃度依賴(lài)性。

廣泛應(yīng)用于糖尿病治療的藥物二甲雙胍，在抗癌方面作用尚不清楚，但它很可能成為治療癌癥的新藥物，為前列腺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌等部位的癌癥，提供新的治療思路。根據(jù)最新研究，越來(lái)越多的流行病學(xué)和實(shí)驗(yàn)室證據(jù)表明，二甲雙胍很可能對(duì)卵巢癌有抑制作用。如果這些作用可以被進(jìn)一步證實(shí)，二甲雙胍有望作為一種預(yù)防性藥物或輔助治療藥物應(yīng)用于卵巢癌的控制中，可以為打破卵巢癌的耐藥和復(fù)發(fā)瓶頸做出貢獻(xiàn)。不過(guò)，目前的研究?jī)H僅局限于細(xì)胞株和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，尚無(wú)大規(guī)模臨床試驗(yàn)，今后仍需要更大樣本、為期更長(zhǎng)的病例對(duì)照或隊(duì)列研究來(lái)進(jìn)一步探索二甲雙胍與卵巢癌的關(guān)系[12]。

[1]JemalAbray,FMelissaM.GlobalCancerStatistic[J].CaCancerJClin,2011,61( 2):69-90

[2]WangJ,GaoQ,WangD,etal.Metformininhibitsgrowthoflungadenocarcinomacellsbyinducingapoptosisviathemitochondria-mediatedpathway[J].OncolLett,2015,10(3):1343-1349

[3]KasznickiJ,SliwinskaA,DrzewoskiJ.Metforminincancerpreventionandtherapy[J].AnnTranslMed,2014,2(6):57

[4]ChaiX,ChuH,YangX,etal.Metforminincreasessensi-tivityofpancreaticcancercellstogemcitabinebyreducingCD133(+)cellpopulationsandsuppressingERK/P70S6Ksignaling[J].SciRep,2015,5:14404

[5]SanchoP,Burgos-RamosE,TaveraA,etal.MYC/PGC-1αBalanceDeterminestheMetabolicPhenotypeandPlasticityofPancreaticCancerStemCells[J].CellMetab,2015,22(4):590-605

[6]LeoneA,DiGennaroE,BruzzeseF,etal.Newperspec-tiveforanoldantidiabeticdrug:metforminasanticanceragent[J].CancerTreatRes,2014,159:355-376

[7]WintersBPlymateS,ZeliadtSB,etal.Metformineffectsonbiochemicalrecurrenceandmetabolicsignalingintheprostate[J].Prostate,2015,75(15):1694-1703

[8]LibbyG,DonnellyLA,DonnanPT,etal.Newusersofmetforminareatlowriskofincidentcancer:acohortstudyamongpeoplewithtype2diabetes[J].DiabetesCare,2009,32(9):1620-1625

[9]YuZ,ZhaoG,XieG,etal.Metforminandtemozolomideactsynergisticallytoinhibitgrowthofgliomacellsandgliomastemcellsinvitroandinvivo[J].Oncotarget,2015,6(32):32930-32940

[10]SliwinskaA,RogalskaA,MarczakA,etal.Metformin,butnotsitagliptin,enhancesWP631-inducedapoptoticHepG2celldeath[J].ToxicolInVitro,2015,29(5):1116-1123

[11]JaraJ,ALópez-MunozR.Metforminandcancer:betweenthebioenergeticdisturbancesandtheantifolateactivity[J].PharmacolRes,2015,8(5):355-360

[12] 朱 杰,孫 紅.二甲雙胍與卵巢癌關(guān)系的研究進(jìn)展[J].國(guó)際婦產(chǎn)科學(xué)雜志，2014,42(1):52-56

(2016-08-03 收稿)(庫(kù)雪飛 編輯)

Inhibition effect of metformin on the growth of ovarian cancer cells

LIDandan,WEIYutian,CHENYan

(NorthChinaUniversityofScienceandTechnologyAffiliatedtoHospital,Tangshan063000,China)

Objective To study the inhibition effect of metformin on the growth of ovarian cancer cells.Methods Determined by MTT method to detect metformin (0 1.25,2.5,5,10,20,40,80 tendency/L) 48h of SKOV3/DDP cells survival rate.Results Metformin in SKOV3/ DDP cells with a dose dependent inhibition(P<0.05),themaximuminhibitionratewas72%.Conclusion Metformin can inhibit ovarian cancer SKOV3/DDP cell proliferation and has the concentration dependence.

Metformin.Ovarian cancer.Proliferation

李丹丹(1990-)，女，碩士研究生。研究方向：婦科腫瘤。

陳 燕。

R

A

2095-2694(2017)01-015-4