王一超

華北理工大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院 河北唐山 063000

Akt和mTOR在腦缺血再灌注大鼠皮質(zhì)區(qū)的表達(dá)

王一超

華北理工大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院 河北唐山 063000

①目的 觀察蛋白激酶B(Akt)和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)在腦缺血再灌注大鼠皮質(zhì)區(qū)的表達(dá)及變化情況。②方法 66只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham組)、腦缺血再灌注組(MCAO組)、PI3K抑制劑組(LY294002組)，將后兩組按缺血再灌注時間分為3、6、24、48、72小時共5個觀察點(diǎn)，每個觀察點(diǎn)6只，Sham組6只大鼠。參照改良的Longa線栓方法制作動物模型。按照Zea-Longa量表法進(jìn)行大鼠神經(jīng)功能評分。采用HE染色法觀察皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化。免疫組化檢測Akt和mTOR蛋白的表達(dá)。③結(jié)果 與Sham組比較，其他兩組神經(jīng)元存活數(shù)目明顯減少。與MCAO組比較，LY294002組只有小部分神經(jīng)細(xì)胞變性、壞死。Sham組未見神經(jīng)功能缺損，與MCAO組比較，LY294002組各時間點(diǎn)神經(jīng)功能缺損評分減少。與Sham組比較，MCAO組各時間點(diǎn)的Akt、mTOR蛋白表達(dá)均明顯增高(P<0.05或P<0.01);與MCAO組比較，LY294002組各時間點(diǎn)的Akt和mTOR表達(dá)均明顯降低(P<0.05或P<0.01)。④結(jié)論Akt和mTOR蛋白在腦缺血再灌注大鼠皮質(zhì)區(qū)過度表達(dá)，可能是局灶性腦缺血再灌注發(fā)生、發(fā)展的重要機(jī)制之一。

腦缺血再灌注 皮質(zhì)區(qū) 蛋白激酶B哺乳動物雷帕霉素靶蛋白

腦缺血再灌注損傷(cerebral ischemia/reperfusion injury)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中較為常見。已有研究表明，腦缺血再灌注后神經(jīng)元損傷涉及多個分子機(jī)制[1～6]。磷酯酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，PKB或Akt)是體內(nèi)重要的抗凋亡、促存活的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，可通過激活下游一系列效應(yīng)因子參與細(xì)胞增殖、生長、分化等多種關(guān)鍵事件的調(diào)控。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，mTOR受到上游PI3K/Akt激活、磷酸化后，作用于下游的靶蛋白，來調(diào)控mRNA翻譯，從而促使一系列細(xì)胞生長、分化相關(guān)蛋白的表達(dá)[7]。已知PI3K/Akt/mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在腦缺血、腦腫瘤、退行性變中的作用已被廣泛研究[8～10]。但PI3K/Akt/mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與腦I/R發(fā)病機(jī)制中的研究尚少。本研究通過建立大腦中動脈閉塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)再灌注大鼠模型，動態(tài)檢測PI3K/Akt/mTOR信號通路中Akt和mTOR蛋白，探討其在腦缺血再灌注中的表達(dá)及意義。

1 材料與方法

1.1 動物 SD大鼠，雄性，共78只，重220～260 克，由中國人民解放軍醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物研究所供給，合格證號SCXK(軍)2009-003。在華北理工大學(xué)屏障環(huán)境動物實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，自然光照，喂養(yǎng)2周后行大鼠局灶性腦缺血再灌注造模。

1.2 主要試劑與儀器 腦立體定位儀購于日本Narishige公司，微型牙科鉆購于美國Grobet公司，組織切片機(jī)購于德國Leitz公司，LY294002購于美國Sigma公司，Akt兔抗鼠多克隆抗體購于美國Bioworld公司，mTOR兔抗鼠多克隆抗體購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司，PV6001試劑盒、DAB顯色盒購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，圖像采集及分析系統(tǒng)購于美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 動物分組 應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字表法將試驗(yàn)動物分為假手術(shù)組(Sham組)6只、腦缺血再灌注組(MCAO組)30只和PI3K抑制劑LY294002組(LY294002組)30只。MCAO和LY294002組按缺血再灌注時間分為再灌注后3、6、24、48、72小時(n=6只)。

1.3.2 動物模型制備 MCAO組：采用改良Longa法制備MCAO再灌注大鼠模型[11]。術(shù)前大鼠禁食12小時，禁水4小時。用10%的水合氯醛(0.3mL/100g)腹腔麻醉，于頸部正中行25～30mm縱形切口，暴露并分離右側(cè)頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)和頸內(nèi)動脈(ICA)。將ECA 遠(yuǎn)端結(jié)扎，在ECA近分叉處打一活結(jié)，動脈夾夾閉近心端CCA與遠(yuǎn)心端ICA，于ECA結(jié)扎處的近心端剪一小口，于ICA處插入栓線，結(jié)扎備用線固定栓線，經(jīng)ICA(松開此處動脈夾)栓至大腦中動脈起始部，阻斷來自同側(cè)頸內(nèi)動脈、大腦后動脈及由對側(cè)經(jīng)前交通動脈回流的血液。以分叉處為標(biāo)記，栓線插入深度為(18.0±0.5)mm，感到阻力時停止插線造成缺血，2小時后拔出栓線，實(shí)現(xiàn)缺血再灌注。分別于再灌注3、6、24、48、72小時取材。Sham組步驟同上，但不結(jié)扎動脈。LY294002組：大鼠成功麻醉后，固定鼠頭，切開頭皮并分離皮下組織，過氧化氫擦試顱骨以充分暴露前囟的“十字交叉”。側(cè)腦室立體定位[12]：Bregma點(diǎn)旁開0.9mm，向后1.5mm，微型牙科鉆于定位點(diǎn)打孔，有明顯突破感后拔出。用10μL微量注射器吸取10μL預(yù)先配制好的LY294002溶液，再次定位穿刺部位，用微量注射器沿鉆孔緩慢進(jìn)針，進(jìn)針深度約3.8mm，在 5分鐘內(nèi)緩慢勻速注入，留針5分鐘，然后緩慢拔針，縫合頭皮，穿刺完畢。側(cè)腦室注射完畢后行MCAO再灌注手術(shù)。術(shù)后手術(shù)部位均用慶大霉素噴灑以抗感染，然后再縫合傷口。

1.3.3 神經(jīng)行為學(xué)評分 大鼠處死前按照Zea-Longa量表法進(jìn)行大鼠神經(jīng)功能評分。0分，正?；顒樱?分，提尾時左前爪呈內(nèi)收屈曲位；2分，行走時向左轉(zhuǎn)圈；3分，站立時向左傾倒；4分，不能自發(fā)行走，意識障礙。評分1～3分進(jìn)入本實(shí)驗(yàn)，0分和4分剔除，及時補(bǔ)充。

1.3.4 腦組織標(biāo)本制備 各組大鼠神經(jīng)缺損評分結(jié)束后，立即以水合氯醛(350mg/kg)腹腔麻醉，取仰臥位開胸暴露心臟，從心尖插入灌注針至左心室，同時剪開右心耳快速滴入生理鹽水300mL進(jìn)入體循環(huán)，無血污后滴入4%多聚甲醛400mL。待大鼠身體僵硬后迅速斷頭取右腦組織，浸泡于4%多聚甲醛溶液24小時，取其前囟前1mm至前囟后2mm之間的腦組織切塊，切取厚2mm的冠狀切片;常規(guī)脫水、透明、浸蠟包埋，切片，載玻片撈片，晾干后45℃烤箱中烘烤備用。

1.3.5 HE染色 將備用腦組織切片常規(guī)二甲苯脫蠟，各級乙醇,100%乙醇→95%乙醇→80%乙醇→75%乙醇脫水，蘇木素染色5分鐘及伊紅染色2分鐘，中性樹膠封片。在光學(xué)顯微鏡(×200)下觀察神經(jīng)元結(jié)構(gòu)變化。

1.3.6 免疫組織化學(xué)染色 切片常規(guī)脫蠟至水；磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，5min/次；3% 過氧化氫室溫15分鐘；PBS沖洗3次，5min/次；枸櫞酸鹽高壓熱修復(fù)抗原，冷卻至室溫;PBS沖洗3次，5min/次；滴加Akt抗體(1∶250)、mTOR抗體(1∶300)，置濕盒內(nèi)4℃孵育過夜；PBS沖洗3次，5min/次;PV6001試劑盒37℃孵育50分鐘，PBS沖洗3次，5min/次；DAB鏡檢控制顯色。Akt陽性產(chǎn)物呈棕黃色顆粒，主要定位于胞漿，部分定位于胞核；mTOR定位于細(xì)胞質(zhì)和/或細(xì)胞核,陽性染色為淡黃色、棕黃色或棕褐色。蘇木素復(fù)染、脫水、透明、封片。高倍鏡下隨機(jī)分別觀察各組大鼠皮質(zhì)區(qū)不重疊的6個視野，進(jìn)行Akt、mTOR蛋白陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)算陽性細(xì)胞平均數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分結(jié)果 手術(shù)后Sham組大鼠活動正常(評分為0分)，未發(fā)現(xiàn)神經(jīng)功能缺損癥狀。MCAO組和LY294002組在各個時間點(diǎn)均有不同程度神經(jīng)功能缺損癥狀(評分1～3分)。與MCAO組比較，LY294002組各時間點(diǎn)神經(jīng)功能缺損評分減低，缺失癥狀改善，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，見表 1。

表1 兩組大鼠術(shù)后神經(jīng)功能缺損評分比較±s，分)

注：*P<0.05,**P<0.01

2.2 大鼠腦組織HE染色結(jié)果Sham組神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本正常，胞漿被染成紅色，細(xì)胞核清晰可見，部分可見核仁，被染成藍(lán)色。MCAO組腦組織結(jié)構(gòu)疏松，神經(jīng)元變性，核固縮、深染，部分胞漿呈空泡樣改變，還可見周圍毛細(xì)血管充血現(xiàn)象。LY29002組只有一小部分神經(jīng)元變性、壞死，大部分神經(jīng)元結(jié)構(gòu)完整 ，染色較淺，見圖1。

Sham組MCAO組LY294002組

圖1 各組大鼠再灌注24h時皮質(zhì)區(qū)HE染色結(jié)果

2.3 各組大鼠皮質(zhì)區(qū)Akt和mTOR蛋白表達(dá)結(jié)果Sham組大鼠皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)細(xì)胞可見散在Akt和mTOR陽性表達(dá)細(xì)胞，MCAO組各時間點(diǎn)Akt、mTOR表達(dá)明顯增加，且隨著時間的延長逐漸增多，24小時達(dá)到高峰，48小時表達(dá)下降但仍很高。與Sham組比較，MCAO組各時間點(diǎn)Akt和mTOR蛋白陽性細(xì)胞均明顯增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；LY294002組Akt和mTOR各個時間點(diǎn)陽性細(xì)胞數(shù)均低于MCAO組，且均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)見表2、表3，圖2、圖3。

表2 不同時間點(diǎn)各組大鼠皮質(zhì)區(qū)Akt陽性表達(dá)比較±s，n=6)

注：與MCAO組比較：*P<0.05；與Sham組比較：**P<0.01

注：a1、a2、a3、a4、a5分別為MCAO組3h、6h、24h、48h、72h；b1、b2、b3、b4、b5分別為LY294002組的3h、6h、24h、48h、72h。

圖2 兩組大鼠皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)細(xì)胞不同時間點(diǎn)Akt表達(dá)比較(免疫組化，×400)

注：與MCAO組比較：*P<0.05；與Sham組比較：**P<0.01

注：c1、c2、c3、c4、c5分別為MCAO組3h、6h、24h、48h、72h；d1、d2、d3、d4、d5分別為LY294002組的3h、6h、24h、48h、72h。

圖3 各組大鼠皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)細(xì)胞不同時間點(diǎn)mTOR表達(dá)(免疫組化，×400)

3 討論

腦缺血可以誘導(dǎo)腦梗死的發(fā)生或選擇性腦神經(jīng)元死亡，皮質(zhì)區(qū)發(fā)生腦缺血是造成神經(jīng)功能缺損的主要原因之一。本研究按照改良的Longa法建立大鼠MCAO模型。它可以高度模擬腦I/R發(fā)病特點(diǎn)，并且缺血后生理指標(biāo)較穩(wěn)定，是目前較理想的腦I/R制備模型。術(shù)后我們發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)了不同程度的左側(cè)肢體癱瘓。HE染色病理學(xué)顯示右側(cè)大腦中動脈供血區(qū)神經(jīng)細(xì)胞水腫、變性、壞死，神經(jīng)細(xì)胞減少等變化。這一結(jié)果與Longa敘述的基本吻合，且神經(jīng)功能缺損評分降低，證明我們的造模是成功的。

PI3K是由一個催化亞基p110和調(diào)節(jié)亞基p85組成的二聚體，其與細(xì)胞增殖、抗凋亡、細(xì)胞遷移、細(xì)胞癌性轉(zhuǎn)移等眾多生理、病理過程有關(guān)。正常情況下，PI3K在細(xì)胞內(nèi)含量不多。在生長因子如：血小板源性生長因子、胰島素樣生長因子等刺激下PI3K有不同程度的增加[13]。Akt為PI3K下游重要的蛋白之一，在靜息狀態(tài)細(xì)胞中主要存在于細(xì)胞漿，PI3K的激活將致Akt磷酸化。活化后的Akt啟動通路下游的級聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)一步磷酸化下游底物，通過多種途徑發(fā)揮其促進(jìn)細(xì)胞存活、抗細(xì)胞凋亡作用。有大量研究顯示，PI3K/Akt通路在缺血性腦損傷中起到保護(hù)作用[14～16]。mTOR屬于磷脂酰肌醇激酶相關(guān)蛋白激酶(phosphatidylinositolkinase-relatedkinase，PIKK)的家族成員，是PI3K信號通路下游分子之一。mTOR在通路中扮演著樞紐作用，既接受上游PI3K/Akt的信息，又將信息進(jìn)一步傳遞給下游，影響細(xì)胞周期的進(jìn)展。PI3K/Akt/mTOR信號通路的活化在各類疾病發(fā)生、發(fā)展過程中起作用。李鵬等[17]報(bào)道PI3K、Akt和mTOR在無功能性垂體腺瘤中表達(dá)，為NFPAs的靶向治療提供了更多依據(jù)。有研究證實(shí)了PI3K/Akt/mTOR通路在膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用，且該通路抑制劑如LY294002、雷帕霉素等的研究已進(jìn)入治療腦膠質(zhì)瘤的隊(duì)伍里[18]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，與Sham組相比，MCAO組海馬皮質(zhì)區(qū)各時間點(diǎn)的Akt、mTOR陽性細(xì)胞表達(dá)明顯增高(P<0.05)，提示腦受到缺血再灌注損傷刺激后，激活了PI3K/Akt/mTOR通路，使Akt、mTOR因子大量表達(dá)。應(yīng)用PI3K特異性抑制劑LY294002進(jìn)行干預(yù)后，LY294002組Akt、mTOR在各時間點(diǎn)表達(dá)顯著降低(P<0.05)，提示LY294002有效抑制PI3K催化活性，阻礙Akt的激活，進(jìn)一步說明PI3K/Akt/mTOR轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在腦缺血再灌注損傷發(fā)病過程中發(fā)揮了作用，為腦I/R治療提供了新的靶點(diǎn)。

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(2016-09-02 收稿)(庫雪飛 編輯)

Expression of Akt and mTOR in the cortex area of rats with focal cerebral ischemia /reperfusion injury

WangYichao

(NorthChinaUniversityofScienceandTechnology,Tangshan063000,China)

Objective To observe the expression of Akt and mTOR in the cortex area of rats with focal cerebral ischemia /reperfusion injury. Methods A total of 66 SD rats were evenly randomized into 3 groups:sham-operation group(n=6)，cerebral ischemia/reperfusion injury model group(MCAO group) and LY294002 group.The rats in the latter two groups subjected to 3，6，24，48 and 72h of I/R(6 in each group).The I/R model was established by referring to the improved Longa thread bolt method.The neurological function score of rats was scored according to the Zea-Longa scale.The structural changes of neurons in the cortical area were observed by HE staining.The expressions of Akt and mTOR were detected by immunohistochemial staining. Results The number of survival neurons in the other two groups was significantly decreased compared with the sham group.Compared with the MCAO group,only a small part of the LY294002 group showed degeneration and necrosis.Neurological function deficit was not found in sham-operation.There was a lower score in LY294002 group compared with the MCAO group.The expressions of Akt and mTOR were obviously increased at all-time points in the I/R group compared with these in the sham-operation group(P<0.05或P<0.01);Compared with MCAO group,LY294002 group showed lower expressions of Akt and mTOR at all-time points(P<0.05或P<0.01). Conclusion PI3K/Akt/mTOR signaling pathway is involved in the pathogenesis of vascular dementia rats.

Cerebral ischemia /reperfusion injury.Cortex area.Akt.mTOR

王一超(1988-)，女，碩士，助教。研究方向：腦血管病。

R

A

2095-2694(2017)01-009-6