張 岳， 楊俊穎， 王旭東， 宋?；郏?張莉莉， 石玉瑩， 陳秀玲， 王傲雪，

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150036；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150036)

2株淺白隱球酵母對葡萄灰霉病和柑橘青霉病采后防治效果的研究

張 岳1， 楊俊穎1， 王旭東2， 宋?；?， 張莉莉1， 石玉瑩1， 陳秀玲1， 王傲雪1，2

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150036；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150036)

以2株淺白酵母Ca63(Cryptococcusalbidus63)、Ca64(Cryptococcusalbidus64)為研究對象，通過平板對峙、顯微觀察致病菌和淺白酵母的共培養(yǎng)物。結(jié)果表明，2株淺白酵母均能顯著抑制葡萄灰霉病菌和柑橘青霉病菌的生長。Ca63和Ca64對葡萄灰霉病菌菌絲生長量的抑制率分別為83.1%、80.7%；Ca63和Ca64對柑橘青霉病菌菌絲生長量的抑制率分別為82.8%、77.1%。采后果實防治試驗發(fā)現(xiàn)2株酵母菌對葡萄灰霉病菌和柑橘青霉病菌都有良好的抑制效果，菌株Ca63對2種病菌的防治效果均好于菌株Ca64，Ca63防治灰霉病效果為62.6%，防治柑橘青霉病效果為72.6%。該研究為進(jìn)一步將這2種酵母菌應(yīng)用于果實采后保鮮提供了基礎(chǔ)。

淺白隱球酵母菌；葡萄灰霉??；柑橘青霉??；采后生物防治

水果因采摘后腐爛導(dǎo)致的資源浪費和經(jīng)濟(jì)損失十分巨大，防治采后果實病害的發(fā)生因此成為一項十分必要且迫切的工作。由真菌或細(xì)菌引起的侵染性病害是造成水果在采摘后腐爛的主要原因，如柑橘采后出現(xiàn)青霉病和綠霉病，葡萄園采后出現(xiàn)灰霉病，損失率都高達(dá)30%～50%[1-2]。迄今為止，控制采后果實病害的主要方法是使用化學(xué)殺菌劑，但隨著人們健康和環(huán)保意識的逐漸提高，化學(xué)殺菌劑毒性大、污染環(huán)境、長期使用導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生抗藥性等缺點逐漸暴露，迫使人們尋求新的防治方法。在國內(nèi)外研究的非殺菌劑防治方法中，利用拮抗菌進(jìn)行生物防治被認(rèn)為是最有前景的方法之一。淺白隱球酵母是一種用于采后保鮮的生防酵母菌，具有拮抗效果好[1]、抑菌譜廣、營養(yǎng)要求低[2]、生長快、不產(chǎn)生毒素、對多數(shù)化學(xué)殺菌劑不敏感[3]等特點，能與多種化學(xué)及物理方法結(jié)合使用，可以較好地防治果實采后病害。據(jù)研究報道，目前淺白隱球酵母已能有效抑制蘋果[4]、草莓[5]、梨[6]等果實的多種真菌病害，在南非，1株淺白隱球酵母已經(jīng)商業(yè)化生產(chǎn)，其商品命名為Yield Plus[7]。目前，對淺白隱球酵母的作用機(jī)制尚不明確，但是普遍認(rèn)為其作用機(jī)制主要包含寄生作用、分泌抗生物質(zhì)、誘導(dǎo)寄主產(chǎn)生抗性等。

本研究通過PDA平板對峙試驗和PDB液體共培養(yǎng)試驗研究2株淺白隱球酵母對葡萄灰霉病菌和柑橘青霉病菌的生長抑制作用，通過顯微觀察探索淺白隱球酵母對葡萄灰霉病菌和柑橘青霉病菌的寄生機(jī)制，為淺白隱球酵母的開發(fā)和應(yīng)用提供了技術(shù)基礎(chǔ)和實踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗菌株 2株淺白隱球酵母(Cryptococcusalbidus)Ca63、Ca64由筆者所在實驗室分離和保藏。將2株淺白隱球酵母接種在YPD固體培養(yǎng)基上劃線活化，挑取單菌落于 NYDB 液體種子培養(yǎng)基中，28 ℃條件下 180 r/min 振蕩培養(yǎng) 20 h，作種子液備用。葡萄灰霉病菌、柑橘青霉病菌從自然發(fā)病的葡萄和柑橘果實上分離，在平板上培養(yǎng)7 d以上使之大量產(chǎn)孢。用無菌水將孢子沖洗下來調(diào)配成濃度為 1×106CFU/mL 備用。

1.1.2 供試試劑 PDA培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200 g切成小塊，加入500 mL蒸餾水煮沸30 min后用雙層紗布過濾，向濾液中加入葡萄糖20 g和瓊脂20 g，用蒸餾水定容至1 L，121 ℃ 高壓蒸汽滅菌20 min。YPD培養(yǎng)基：葡萄糖20 g溶解于100 mL蒸餾水中，酵母粉10 g、蛋白胨20 g溶解于900 mL蒸餾水中，2瓶溶液于121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，用時將2瓶溶液混合均勻后使用。NYDB液體種子培養(yǎng)基：葡萄糖 20 g 溶解于100 mL蒸餾水中，酵母膏5 g和牛肉膏8 g溶解于 900 mL 蒸餾水中，2瓶溶液于121 ℃高壓蒸汽滅菌 20 min，用時將2瓶溶液混勻使用。

1.1.3 植物材料 葡萄和柑橘果實分別購自黑龍江省哈爾濱市當(dāng)?shù)厥袌觥?/p>

1.2 方法

1.2.1 2株淺白隱球酵母對葡萄灰霉病菌和柑橘青霉病菌的抑菌作用(PDA平板對峙試驗) 在PDA固體培養(yǎng)基上分別滴加20 μL 1×1010CFU/mL的2株淺白隱球酵母菌懸液，利用涂布棒將其均勻涂開，晾干，然后在培養(yǎng)基上分別接種1塊直徑為5 mm的圓形葡萄灰霉菌菌餅、柑橘青霉菌菌餅，26 ℃ 靜置培養(yǎng)7 d，以接種葡萄灰霉病菌和涂布無菌水、柑橘青霉病菌和涂布無菌水的PDA固體培養(yǎng)基作對照，觀察葡萄灰霉病菌和柑橘青霉病菌的生長狀態(tài)，每組處理3次重復(fù)。

1.2.2 2株酵母菌對病原菌菌絲生長的影響 在100 mL PDB 液體培養(yǎng)基中分別接種1 cm2大小的葡萄灰霉病菌和柑橘青霉病菌，再按照3%(體積分?jǐn)?shù))的接種量分別接入2株淺白隱球酵母種子液，26 ℃ 120 r/min搖瓶培養(yǎng)10 d，以不接種酵母菌作對照，每個處理取5 μL均勻滴在無菌載玻片上，置于顯微鏡下觀察葡萄灰霉病菌和柑橘青霉病菌菌絲生長狀態(tài)，每組處理3次重復(fù)。同時用紗布過濾收集菌絲，烘干后稱質(zhì)量，分析酵母菌對灰葡萄孢菌菌絲生長的影響，計算抑制率，每個處理3次重復(fù)。

抑制率=(對照菌絲干質(zhì)量-處理菌絲干質(zhì)量)/對照菌絲干質(zhì)量×100%。

1.2.3 2株酵母菌不同處理對采后葡萄和柑橘病害的防治效果 挑選顏色大小一致、無病害及機(jī)械損傷的葡萄和柑橘，在葡萄上用無菌針等距離針刺4個5 mm深的傷口，在柑橘上用無菌針等距離針刺10個1 cm深的傷口。將2株淺白隱球酵母和葡萄灰霉病菌、柑橘青霉病菌分別調(diào)配成1×1010CFU/mL 和1×106CFU/mL懸浮液，用針刺方法接種葡萄和柑橘處理3 min，12 h后在葡萄上接種葡萄灰霉病菌、在柑橘上接種柑橘青霉病菌。將處理后的葡萄和柑橘用保鮮膜及套袋的方式保持90%的相對濕度并貯于室溫，開始對葡萄、柑橘的發(fā)病情況進(jìn)行統(tǒng)計觀察，并計算病情指數(shù)，每3 d觀察1次。

葡萄發(fā)病病級包括0級：果實無病態(tài)；1級：發(fā)病面積0.25%～0.50%、果梗綠色、果實初見白色菌絲、果實富有彈性；3級：發(fā)病面積1%、果梗出現(xiàn)褐色斑點、果實有淺灰色菌絲、果實微軟無彈性；5級：發(fā)病面積5%、果實有深灰色菌絲、果實松軟、有發(fā)酵氣味；7級：發(fā)病面積10%、果實有褐色菌絲、發(fā)酵氣味明顯、果皮下陷、初見果蠅；9級：發(fā)病面積50%、果實有深褐色菌絲、果實腐爛下陷、果蠅量增加。

柑橘發(fā)病病級包括0級：果實無病態(tài)；1級：發(fā)病面積<10%、果皮軟化、呈水漬狀；3級：發(fā)病面積10%～30%、表面長出氣生菌絲且部分形成1層厚的白色霉斑；5級：發(fā)病面積為>30%～50%、大部分為淺綠色粉狀物；7級：發(fā)病面積為>50%～70%，大部分為青綠色粉狀物；9級：發(fā)病面積>70%，出現(xiàn)深綠色粉狀物。

病情指數(shù)=100×∑(各級發(fā)病果實數(shù)量×相應(yīng)級數(shù))/(調(diào)查總數(shù)×最高發(fā)病級數(shù))，試驗重復(fù)3次。

防治效果=(對照病情指數(shù)-處理病情指數(shù))/對照病情指數(shù)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 2株酵母菌對采后葡萄和柑橘的生防作用

2.1.1 2株淺白隱球酵母菌對葡萄灰霉病菌和柑橘青霉病菌的抑制作用(PDA平板對峙試驗) 在接種2株淺白隱球酵母菌的PDA對峙平板上均沒有明顯的抑菌圈出現(xiàn)，灰葡萄孢菌與酵母菌之間沒有明顯的分界線，但是與對照相比，接種了2株淺白隱球酵母的PDA平板上灰葡萄孢菌生長狀態(tài)明顯較弱。25 ℃靜置培養(yǎng)7 d后對照組菌絲鋪滿培養(yǎng)皿，菌絲濃密、生長旺盛且產(chǎn)孢量較高；接有淺白隱球酵母菌的平板上灰葡萄孢菌長勢較弱，未能鋪滿培養(yǎng)皿，菌絲稀疏、生長不旺盛且產(chǎn)孢量低(圖1)。

2.1.2 2株酵母菌對病原菌產(chǎn)孢及菌絲生長的影響 以單獨培養(yǎng)的葡萄灰霉病菌、柑橘青霉病菌為對照，將2株酵母菌與葡萄灰霉病菌、柑橘青霉病菌在26 ℃下共同搖瓶培養(yǎng)7 d后發(fā)現(xiàn)，2株酵母菌對葡萄灰霉病菌、柑橘青霉病菌菌絲生長均有明顯的抑制作用。對照組的菌絲生長旺盛，肉眼可見菌絲大量生長，而加入淺白隱球酵母的處理組中葡萄灰霉病菌、柑橘青霉病菌基本沒有生長，肉眼僅見少量菌絲(圖2)。顯微鏡下觀察Ca63和Ca64對葡萄灰霉病菌菌絲生長、柑橘青霉病菌菌絲生長的抑制情況也十分明顯，有大量酵母菌生長在致病菌周圍，致病菌的生長受到明顯抑制(圖3)。將菌絲過濾烘干并稱質(zhì)量發(fā)現(xiàn)，淺白隱球酵母處理組的菌絲干質(zhì)量顯著低于對照組(P<0.05)，且Ca63對葡萄灰霉病菌和柑橘青霉病菌菌絲生長的抑制能力好于Ca64。Ca63和Ca64對葡萄灰霉病菌菌絲生長量的抑制率分別為83.1%、80.7%；Ca63、Ca64對柑橘青霉病菌菌絲生長量的抑制率分別為82.8%、77.1%(表1、表2)。

表1 2株淺白隱球酵母對葡萄灰霉病菌菌絲生長的影響

表2 2株淺白隱球酵母對柑橘青霉病菌菌絲生長的影響

2.1.3 不同處理的2株酵母菌液對葡萄灰霉病和柑橘青霉病的生物防治 將2株淺白隱球酵母調(diào)配成1×1010CFU/mL 的懸浮液，用針刺葡萄和柑橘分別進(jìn)行處理 3 min，12 h后在葡萄上接種葡萄灰霉病菌1×106CFU/mL懸浮液、在柑橘上接種柑橘青霉病菌1×106CFU/mL懸浮液。結(jié)果表明，菌株Ca63防治2種病菌的效果都更佳，防治葡萄灰霉病效果為62.6%，防治柑橘青霉病效果為72.6%(表3、表4、圖3、圖4)。

表3 2株淺白隱球酵母對采后葡萄灰霉病的防治效果

表4 2株淺白隱球酵母采后柑橘青霉病的生防效果

3 討論

將淺白隱球酵母與葡萄灰霉病菌、柑橘青霉病菌進(jìn)行共培養(yǎng)時，2株酵母菌對葡萄灰霉病菌、柑橘青霉病菌菌絲生長均有明顯的抑制作用，且Ca63對葡萄灰霉病菌和柑橘青霉病菌菌絲生長的抑制能力好于Ca64。酵母菌迅速占位，先于病原菌消耗掉大量的營養(yǎng)和空間，意味著酵母菌活菌數(shù)量越多，接種時間越早，抑制病原菌效果越顯著。該研究中的2株酵母菌對病原菌起到了良好的預(yù)防作用，因此在實際應(yīng)用中采后果實應(yīng)盡早噴施或浸泡酵母菌菌液，提前抑制病原菌侵染和大量繁殖，從而達(dá)到提升經(jīng)濟(jì)價值的目的。

離體抑菌試驗中，PDA平板對峙試驗結(jié)果顯示，葡萄灰霉病菌、柑橘青霉病菌能夠繞過淺白隱球酵母繼續(xù)生長，沒有明顯的抑菌圈出現(xiàn)，說明本研究所用的2株淺白隱球酵母對葡萄灰霉病菌和柑橘青霉病菌的拮抗作用并不是通過分泌抗生素等殺菌物質(zhì)來完成的，這一結(jié)果與黃蓉和張紅印等的研究結(jié)果[8-9]一致。從葡萄灰霉病菌、柑橘青霉病菌的生長狀態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，接種2株淺白隱球酵母的平板上，葡萄灰霉病菌、柑橘青霉病菌整體的生長態(tài)勢明顯較弱，且菌絲生長稀疏，產(chǎn)孢量也較低，這一結(jié)果說明2株淺白隱球酵母雖然沒能產(chǎn)生有強(qiáng)效殺菌作用的抗生素類物質(zhì)[10]，但是很有可能分泌一些其他物質(zhì)能夠降低葡萄灰霉病菌、柑橘青霉病菌孢子的萌發(fā)率[11]，抑制葡萄灰霉病菌、柑橘青霉病菌的正常生長，削弱葡萄灰霉病菌、柑橘青霉病菌的生活力。黃蓉在對草莓灰霉病淺白隱球酵母的研究中發(fā)現(xiàn)，酵母菌能夠產(chǎn)生一些揮發(fā)性的物質(zhì)抑制灰霉菌菌絲的生長和孢子的萌發(fā)[8]。共培養(yǎng)試驗結(jié)果表明，高濃度的淺白隱球酵母活細(xì)胞能夠有效地抑制葡萄灰霉病、柑橘青霉?。?×1010CFU/mL的酵母活菌懸液能較好地抑制灰霉病原菌的生長[12]。范青等研究發(fā)現(xiàn)較高濃度的季也蒙假絲酵母能完全抑制桃果實采后軟腐病原菌葡枝根霉(Rhizopusstolonifer)孢子的萌發(fā)[13]。賀立紅等研究淺白隱球酵母的拮抗效果作用時發(fā)現(xiàn)，淺白隱球酵母菌量越大，對指狀青霉菌孢子萌發(fā)的抑制作用越強(qiáng)，指狀青霉孢子萌發(fā)率越低[14]。離體試驗結(jié)果表明2株淺白隱球酵母對葡萄灰霉病、柑橘青霉病能夠起到抑制作用，許多研究結(jié)果表明，高濃度拮抗菌的抑菌效果更顯著[15]，本研究離體抑菌試驗的結(jié)果也支持這一結(jié)論?；铙w試驗中，在葡萄、柑橘離體果實上的抑菌結(jié)果顯示，酵母菌在傷口處能夠迅速定殖生長，形成致密的菌膜，避免了病害的發(fā)生；淺白隱球酵母和葡萄灰霉病菌、柑橘青霉病菌同孔生長時，病斑擴(kuò)展大小和病情指數(shù)顯著低于只接種病原菌的處理，說明淺白隱球酵母的加入削弱了葡萄灰霉病菌、柑橘青霉病菌的生長和病害的加劇程度；淺白隱球酵母接種先后順序與其對灰霉病防治效果密切相關(guān)，先接種淺白隱球酵母的處理組中葡萄、柑橘果實的病情指數(shù)顯著低于后接種的處理組，且先接種淺白隱球酵母對葡萄灰霉病、柑橘青霉病在果實上的防治效果也顯著高于后者。這一結(jié)果與王一非、汪志浩等、羅楊的研究結(jié)果[16-18]一致，拮抗菌先于病原菌接種對發(fā)病率的影響非常顯著，能夠有效地降低發(fā)病率。綜上所述，在使用以上2種酵母菌時，應(yīng)以Ca63為主，并在發(fā)病前應(yīng)用較好。該研究能為進(jìn)一步應(yīng)用酵母菌進(jìn)行采后保鮮提供參考。

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10.15889/j.issn.1002-1302.2017.02.026

2015-12-05

黑龍江省高?？萍汲晒a(chǎn)業(yè)化前期研發(fā)培育項目(編號：1254CGZH27)；黑龍江省教育廳海外學(xué)人項目(編號：1252HQ011)。

張 岳(1990—)，男，山東萊州人，碩士研究生，主要從事蔬菜學(xué)研究。E-mail：346166440@qq.com。

王傲雪，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事植物分子細(xì)胞生物學(xué)研究。E-mail：axwang@neau.edu.cn。

S436.631.1+9；S436.661.1+9

A

1002-1302(2017)02-0096-04

張 岳，楊俊穎，王旭東，等. 2株淺白隱球酵母對葡萄灰霉病和柑橘青霉病采后防治效果的研究[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，45(2)：96-100.