陳國梁， 田瑞康， 趙 康， 楊成成， 安 鵬， 張向前

(延安大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/陜西省紅棗重點實驗室，陜西延安 716000)

一步PCR法融合狗頭棗ACOⅠ基因片段

陳國梁， 田瑞康， 趙 康， 楊成成， 安 鵬， 張向前

(延安大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/陜西省紅棗重點實驗室，陜西延安 716000)

以狗頭棗ACOⅠ基因外顯子Ⅲ和Ⅳ的部分序列為靶標(biāo)序列，采用一步PCR法對其進(jìn)行融合擴(kuò)增。經(jīng)與T載體連接、測序。結(jié)果表明：經(jīng)一步PCR法擴(kuò)增到大小為589 bp的融合基因片段，經(jīng)序列比對，其與ACOⅠ外顯子Ⅲ和Ⅳ序列一致性為100%。表明在一個PCR反應(yīng)體系中通過4引物一次性擴(kuò)增可獲得融合基因，該方法是一種簡便、經(jīng)濟(jì)、有效的融合基因構(gòu)建方法。

狗頭棗；ACOⅠ基因；一步PCR法

乙烯是植物主要內(nèi)源激素之一，對植物的生長發(fā)育特別是果實成熟和衰老過程的調(diào)節(jié)有重要作用，是公認(rèn)的果實成熟激素[1-6]。在果實的成熟過程中，乙烯的大量生成會提高與果實成熟有關(guān)酶的活性，進(jìn)而促進(jìn)果實的成熟[5-14]。ACC氧化酶(1-aminocyclopropane-l-carboxylic acid oxidase，ACO)是植物中乙烯生物合成途徑的關(guān)鍵酶之一，可直接催化ACC轉(zhuǎn)變?yōu)橐蚁3，5]。鑒于乙烯生物合成相關(guān)基因在調(diào)控果品成熟及衰老方面的重要作用，采用生物技術(shù)對該基因調(diào)控，以便在基因水平上控制ACO的表達(dá)，則有可能從根本上解決果實延熟、抗衰老等問題。該研究選擇了狗頭棗ACOⅠ基因外顯子Ⅲ及Ⅳ的部分基因片段[15]，通過一步PCR法將其融合，用于RNAi的植物表達(dá)載體的構(gòu)建，為調(diào)控紅棗ACOⅠ 基因的表達(dá)來延緩棗果的成熟，為延熟、耐儲紅棗新品種的培育奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒及試劑

菌株E.coliDH5α、質(zhì)粒pGM-TACC Ⅰ(含ACOⅠ基因)均為筆者所在課題組保存，DNA回收試劑盒、TaqDNA Polymerase、限制性內(nèi)切酶等購自TaKaRa公司，DNA Marker購自天為時代公司，其他試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純，PCR引物合成和DNA測序由上海生工生物技術(shù)有限公司完成。

1.2 引物設(shè)計

以狗頭棗ACOⅠ基因序列(登錄號：JF812966.1)為依據(jù)，考慮到采用PCR拼接2個基因片段(294 bp)、1 096～1 359 bp 之間的片段(264 bp)，分別稱為：F1、F2。用于擴(kuò)增ACOⅠ基因片段的引物采用Oligo 7.0分析軟件設(shè)計，依次為命名為3U、3RL、4RU、4L，4條引物組成如下：

3U：5′-GCGGATCCCTCGAGATGAATTGGAGACACTAG

CTGAGG-3′；

3RL 構(gòu)成(含F(xiàn)1片段非編碼鏈5′端23 bp和F2片段非編碼鏈3′端22 bp)：5′-CTCTTGTATTTCCCATTTGTTATAAGGTTGACTACAA TGGAGTGG-3′；

4RU 構(gòu)成(含F(xiàn)1片段編碼鏈3′端22 bp和F2片段編碼鏈5′端23 bp)：5′-CCACTCCATTGTAGTCAACCTTATAACAAATGG GAAATACAAGAG-3′；

4L 引物構(gòu)成(F2片段非編碼鏈5′端22 bp)：5′-GCATCGATGAATTCAACATTAGTTTCCACTGCTTTC-3′。

以上引物中，分別在3U、4L引物中引入17、14 bp酶切位點堿基序列(見引物中下劃線部分序列)，為后續(xù)試驗作準(zhǔn)備。

1.3 一步PCR法構(gòu)建融合基因

以質(zhì)粒pGM-TACC Ⅰ(含融合基因F1、F2片段)DNA為模板，加入Taq酶、dNTPs、目的基因F1與F2片段的上下游引物3U、3RL、4RU、4 L各1 μL配成25 μL的反應(yīng)體系。在 94 ℃ 4 min、95 ℃ 40 s、53.5 ℃ 45 s、72 ℃ 45 s的反應(yīng)參數(shù)下進(jìn)行5個循環(huán)后，將退火溫度改為51.5 ℃、其他擴(kuò)增參數(shù)不變進(jìn)行5個循環(huán)，72 ℃ 3 min。再將退火溫度改為53 ℃、其他擴(kuò)增參數(shù)不變進(jìn)行10個循環(huán)，72 ℃ 3 min。然后將 25 μL 的反應(yīng)液(含Taq酶、dNTPs、 MgCl2、所設(shè)計融合基因的上、下游引物，即3U、4 L各1 μL，濃度為10 μmol/L)加入上述反應(yīng)體系中；在94 ℃ 4 min、95 ℃ 40 s、54.7 ℃ 45 s、72 ℃ 1 min條件下擴(kuò)增30個循環(huán)，72 ℃ 10 min，4 ℃冷卻后取5.0 μL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4 融合基因片段與T載體的連接及測序

將經(jīng)電泳檢測大小合適的PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收并與T載體連接、轉(zhuǎn)化、篩選、鑒定。酶切和PCR鑒定后將所得陽性克隆子(命名為pGEM-TF)委托上海生物技術(shù)有限責(zé)任公司測序。

2 結(jié)果與分析

2.1 一步PCR法構(gòu)建融合基因的原理

一步PCR法構(gòu)建融合基因的原理如圖1所示。以質(zhì)粒pGM-TACC Ⅰ為模板起初2次5個循環(huán)擴(kuò)增是分別擴(kuò)增出F1、F2基因片段；第3次10個循環(huán)的擴(kuò)增是將已擴(kuò)出來的F1、F2片段互為模板和引物進(jìn)行基因融合，第4次30個循環(huán)是以形成的融合基因為模板，融合基因的上下游引物即3U與4 L為引物，獲得融合基因全長序列。

2.2 F1與F2片段的一步PCR融合擴(kuò)增結(jié)果

將上述擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物取5 μL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果(圖2)獲得大小約590 bp的特異條帶，與預(yù)期片段大小符合。初步表明2片段已按設(shè)計融合在一起。

2.3 基因融合產(chǎn)物的酶切與測序結(jié)果

將經(jīng)篩選獲得的重組質(zhì)粒pGEM-TF，經(jīng)PCR和雙酶切進(jìn)行鑒定，結(jié)果(圖3、圖4)表明，PCR擴(kuò)增及酶切片段的大小均為590 bp，與預(yù)期大小一致，說明融合基因片段已連至載體。經(jīng)測序及序列比對，結(jié)果與GenBank中的序列完全一致。進(jìn)一步確定以含目的基因的質(zhì)粒pGM-TACC Ⅰ為模板，通過一步PCR法成功獲得了狗頭棗ACOⅠ基因序列中F1和F2片段的融合基因。

3 結(jié)論與討論

重疊延伸PCR技術(shù)是采用具有互補(bǔ)末端的引物，使PCR產(chǎn)物形成重疊鏈并在隨后的擴(kuò)增反應(yīng)中通過重疊鏈的延伸，將不同來源的擴(kuò)增片段拼接起來。利用該技術(shù)不需要內(nèi)切酶消化和連接酶處理即可進(jìn)行有效的基因重組，能較快獲得依靠限制性內(nèi)切酶消化的方法難以得到的產(chǎn)物。通過精心設(shè)計引物，利用該技術(shù)可將2條以上的基因構(gòu)建成為融合基因，如Shevchuk等利用重疊延伸PCR技術(shù)成功地將多個DNA片段連接在一起[16-19]。此外重疊延伸PCR在基因的定點突變、長片段基因的合成、構(gòu)建重組質(zhì)粒和載體、基因敲除以及目的基因的擴(kuò)增等方面有其廣泛而獨特的應(yīng)用[20-26]。

一步PCR法融合ACOⅠ基因外顯子Ⅲ及Ⅳ的部分基因片段也屬于重疊延伸PCR法，但其優(yōu)點是不需要將單個PCR產(chǎn)物回收再融合即只需要構(gòu)建1個PCR反應(yīng)就可以得到融合基因。在達(dá)到融合目的的同時，縮短了試驗周期，節(jié)約了成本，減少了操作環(huán)節(jié)，為重疊延伸PCR法的應(yīng)用提供了新的選擇。

[1]田世平. 果實成熟和衰老的分子調(diào)控機(jī)制[J]. 植物學(xué)報，2013，48(5)：481-488.

[2]蔣天梅，殷學(xué)仁，王 平，等. 乙烯調(diào)控非躍變型果實成熟衰老研究進(jìn)展[J]. 園藝學(xué)報，2011，38(2)：371-378.

[3]Cornelius S，Barry，James J. Giovannoni.ethylene and fruit ripening[J]. Jorunal Plant Growth Regul，2007，26：143-159.

[4]劉進(jìn)平. 乙烯生物合成關(guān)鍵酶基因研究進(jìn)展[J]. 熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，33(1)：51-57.

[5]Jafari Z，Haddad R，Hosseini R，et al. Cloning，identification and expression analysis of ACC oxidase gene involved in ethylene production pathway[J]. Molecular Biology Reports，2013，40(2)：1341-1350.

[6]Aarti G，Ram K P. M Vt rajama.delayed ripening and improved fruit processing quality in tomato by RNAi-mediated silencing of three homologs of 1-aminopropane-1-carboxylate synthase gene[J]. Journal of Plant Physiology，2013，170(11)：987-995.

[7]Minas I S，Vicente A R，Dhanapal A P，et al. Ozone-induced kiwifruit ripening delay is mediated by ethylene biosynthesis inhibition and cell wall dismantling regulation[J]. Plant Science，2014，229(229)：76-85.

[8]Wang Y H，Xu F X，F(xiàn)eng X Q，et al. Modulation of actinidia arguta fruit ripening by three ethylene biosynthesis inhibitors[J]. Food Chemistry，2015，173(173)：405-413.

[9]Sekeli R，Abdullah J O，Namasivayam P A，et al. RNA interference of 1-Aminocyclopropane-1-carboxylic acid oxidase (ACO1andACO2) genes expression prolongs the shelf Life of eksotika (CaricapapayaL.) papaya fruit[J]. Molecules，2014，19(6)：8350-8362.

[10]程 然，生吉萍. 草莓果實成熟衰老影響因子及其調(diào)控機(jī)制研究進(jìn)展[J]. 食品科學(xué)，2015，36(9)：242-247.

[11]李 通. 蘋果ACC合成酶基因在果實乙烯合成中的調(diào)控機(jī)制研究[D]. 沈陽：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)，2014.

[12]李 通，張志宏，王愛德. 蘋果果實成熟過程中ACC合成酶基因作用機(jī)理研究進(jìn)展[J]. 園藝學(xué)報，2012，39(9)：1665-1672.

[13]Chervin C，El K A，Roustan J P，et al. Ethylene seems required for the berry development and ripening in grape，a non-climacteic fruit[J]. Plant Science，2004，167：1303-1305.

[14]李 敏. 乙烯調(diào)控早熟蘋果果實軟化和裂果機(jī)理的初步研究[D]. 泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013.

[15]陳國梁，齊向英，涂容福，等. 狗頭棗ACCⅠ氧化酶基因的克隆及其序列分析[J]. 食品與生物技術(shù)學(xué)報，2014，33(6)：647-651.

[16]Shevchuk N A，Bryksin A V，Nusinovich Y A，et al. Construction of long DNA molecules using long PCR-based fusion of several fragments simultaneously[J]. Nucleic Acids Research，2004，32(2)：e19.

[17]陳國梁，張金文，王 蒂. 馬鈴薯gbss、ssⅡ和ssⅢ基因片段的融合及其RNAi載體的構(gòu)建[J]. 中國生物工程雜志，2008，28(8)：51-56.

[18]王玉瑞. 大腸桿菌O157：H7效應(yīng)分子NleB1和NleB2的初步研究[D]. 合肥：安徽大學(xué)，2014.

[19]陳國梁，張金文，王 蒂，等. 重疊PCR一步法對三種淀粉合成酶融合基因的構(gòu)建[J]. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2010，45(3)：38-43.

[20]徐雪麗，張 偉，劉 艷，等. 頭孢菌素C?；竿蛔兾稽c的研究[J]. 中國生物工程雜志，2015，35(2)：59-65.

[21]徐 芳，姚泉洪，熊愛生，等. 重疊延伸PCR技術(shù)及其在基因工程上的應(yīng)用[J]. 分子植物育種，2006，4(5)：747-750.

[22]郭紫芬，軒貴平，陳方方，等. 用改進(jìn)的重疊延伸PCR技術(shù)構(gòu)建三位點突變載體[J]. 生物技術(shù)通訊，2014，25(2)：248-251.

[23]馬 彥，岑 雯，劉 昕，等. 兩步融合PCR法構(gòu)建煙曲霉ssk1基因敲除株[J]. 山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2014，45(4)：255-260.

[24]鄺翡婷，袁定陽，李 莉，等. 一種載體構(gòu)建的新方法：重組融合PCR法[J]. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2012，31(6)：634-639.

[25]王 華，文 一，于寒松，等. 重疊延伸PCR技術(shù)構(gòu)建β-環(huán)糊精葡糖基轉(zhuǎn)移酶基因的定點突變原核表達(dá)載體[J]. 食品工業(yè)科技，2013，34(19)：145-147，151.

[26]魏 薇，李 凡，陳海如. 利用重疊延伸PCR技術(shù)擴(kuò)增長片段DNA[J]. 云南大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2008，30(增刊1)：86-88.

10.15889/j.issn.1002-1302.2017.02.007

2015-12-11

陜西省重點實驗室項目(編號：15JS123)；延安市農(nóng)業(yè)攻關(guān)項目(編號：2011kn-09)；延安大學(xué)高水平大學(xué)建設(shè)項目(編號：2012SXTS06)；延安大學(xué)校級科研項目(編號：YDZ2012-12、YD2014-01)；地方高校國家級大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計劃(編號：201410719041)。

陳國梁(1974—)，男，陜西定邊人，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向為植物生物技術(shù)。E-mail：glc9359@163.com。

Q786

A

1002-1302(2017)02-0028-03

陳國梁，田瑞康，趙 康，等. 一步PCR法融合狗頭棗ACOⅠ基因片段[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，45(2)：28-30.