徐 艷，徐繼法，陳 磊，趙吉強(qiáng)，F(xiàn)U Zeyu，JAMESON Paula E ，宋建成

(1.煙臺(tái)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東煙臺(tái) 264005; 2.School of Biological Sciences,University of Canterbury,Christchurch,New Zealand)

小麥TILLING突變體檢測中基因組DNA提取方法的優(yōu)化

徐 艷1，徐繼法1，陳 磊1，趙吉強(qiáng)1，F(xiàn)U Zeyu2，JAMESON Paula E2，宋建成1

(1.煙臺(tái)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東煙臺(tái) 264005; 2.School of Biological Sciences,University of Canterbury,Christchurch,New Zealand)

為了優(yōu)化小麥高通量TILLING突變體掃描所需基因組DNA提取的方法，對(duì)利用SDS法、改良SDS法、CTAB法、改良CTAB法、AxyPrep DNA提取試劑盒、Qiagen DNeasy Plant Mini Kit試劑盒以及再生Qiagen硅膠柱方法提取的小麥基因組DNA進(jìn)行了系統(tǒng)比較。結(jié)果表明，盡管7種方法所提取DNA的純度及瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果均良好，但再生Qiagen硅膠柱方法、CTAB法和改良SDS法的DNA濃度顯著高于其他方法。根據(jù)小麥細(xì)胞分裂素氧化酶基因1( TaCKX1)的DNA序列設(shè)計(jì)引物，以新鮮DNA樣品用于PCR擴(kuò)增大于1 000 bp的片段時(shí)，后4種方法擴(kuò)增效果優(yōu)于前3種方法；DNA在-20 ℃下保存100 d后重新進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，則只有Qiagen試劑盒和再生Qiagen硅膠柱2種方法提取的DNA能擴(kuò)增出大于1 000 bp的片段。采用本實(shí)驗(yàn)室與新西蘭坎特伯雷大學(xué)合作建立的再生硅膠柱與自配提取液提取小麥基因組DNA，既保證了DNA的高質(zhì)量，又降低了使用試劑盒的成本，為小麥TILLING庫的構(gòu)建及其他相關(guān)試驗(yàn)提供了一種經(jīng)濟(jì)有效的DNA提取方法。

小麥；TILLING；基因組DNA；提取方法

小麥?zhǔn)鞘澜绺鞯貜V泛種植的主要糧食作物之一。其全基因組大小高達(dá)17 000 Mb，約是人類基因組的5倍多，水稻基因組的36倍，而且80%的基因組序列為冗余重復(fù)序列[1]。同時(shí)，其異源六倍體的特性決定了性狀遺傳的復(fù)雜性，每個(gè)基因常含有三個(gè)拷貝。因此，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)進(jìn)行小麥基因功能研究和農(nóng)藝性狀的遺傳改良具有較大難度[2]。定向誘導(dǎo)基因組局部突變 (targeting induced local lesions IN genomes,TILLING)技術(shù)是20世紀(jì)90年代末期由美國Fred Hutchinson癌癥研究中心Steven Henikoff團(tuán)隊(duì)和華盛頓大學(xué)Luca Comai團(tuán)隊(duì)發(fā)展起來的一種反向遺傳學(xué)研究方法[3-7]。該技術(shù)結(jié)合了化學(xué)誘變、PCR技術(shù)和高通量定向篩選的方法，已被廣泛應(yīng)用于遺傳學(xué)研究，是功能基因組研究中用于發(fā)現(xiàn)遺傳多樣性和大規(guī)模篩選基因突變的有效手段[4-5]。目前，該技術(shù)已成功地應(yīng)用于小麥的基因組研究和育種實(shí)踐[8-11]。提取數(shù)千個(gè)突變體植株的高質(zhì)量基因組DNA是TILLING技術(shù)中的基礎(chǔ)環(huán)節(jié)，由于突變?nèi)后wDNA庫建成后需要長期保存，以便隨時(shí)滿足不同研究人員及不同研究項(xiàng)目對(duì)目的基因突變進(jìn)行掃描檢測的需要。因此，所提取DNA的質(zhì)量將直接影響后續(xù)PCR等步驟的結(jié)果乃至TILLING群體突變體篩選鑒定成敗[12-14]。

目前，常用的植物基因組DNA提取方法，如CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)法、SDS(十二烷基磺酸鈉)法、PVP(聚乙烯吡咯烷酮)法等，不僅提取效率和DNA的質(zhì)量存在較大差異[15-21]，而且我們在進(jìn)行小麥TIILING群體突變體篩選過程中發(fā)現(xiàn)，這些方法所提取的許多DNA樣品經(jīng)一段時(shí)間保存后，PCR擴(kuò)增效果發(fā)生明顯衰減，甚至經(jīng)常導(dǎo)致擴(kuò)增完全失敗，嚴(yán)重影響了TILLING突變體的掃描效果和效率。而采用國內(nèi)外公認(rèn)效果較好的Qiagen等試劑盒，盡管保證了所提取DNA的高質(zhì)量，但往往因DNA得率較低和提取成本太高等缺陷，難以滿足TIILING突變體篩選對(duì)大量DNA樣品的需要。本研究對(duì)采用CTAB法及其改良法、SDS法及其改良法、兩種DNA提取試劑盒以及新建立的提取方法所提取的小麥葉片基因組DNA進(jìn)行系統(tǒng)比較，旨在獲得快速、簡便、低成本提取小麥基因組DNA的方法，為TILLING技術(shù)應(yīng)用過程中大量DNA樣品的提取提供可靠保障。

1 材料與方法

1.1 植物材料

DNA提取材料為實(shí)驗(yàn)室水培至展開葉長10 cm左右的野生型濟(jì)麥22幼苗，選取新鮮葉片剪成1 cm后混勻。

1.2 試驗(yàn)試劑

Qiagen DNA提取試劑盒購自德國Qiagen公司。AxyPrep基因組DNA小量試劑盒購自康寧生命科學(xué)有限公司。其他試驗(yàn)用試劑均為分析純。1×TE buffer、Binding buffer、Washing buffer Ⅰ、Washing buffer Ⅱ和Elution buffer的配制參照Fu等[22]的方法。

1.3 基因組DNA的提取方法

本研究共采用了7種基因組DNA提取方法，每種方法重復(fù)3次。

1.3.1 SDS法

取新鮮小麥葉片，在液氮中研磨成粉末，稱取0.05 g于1.5 mL離心管中；加入500 μL SDS提取液，混勻，室溫靜置10 min；65 ℃水浴30 min，間或混勻；冰浴5 min，加入20 μL 2% β-巰基乙醇，混勻后靜置5 min，室溫12 000 r·min-1下離心5 min；取450 μL上清于新的1.5 mL離心管中，加入500 μL氯仿-異戊醇(24∶1)，混勻后靜置5 min，室溫12 000 r·min-1下離心5 min；取400 μL上清于新的1.5 mL離心管(如果雜質(zhì)含量仍然很高，可以重復(fù)該步1～2次)，加入等體積-20 ℃預(yù)冷的異丙醇，混勻，于-20 ℃冰箱，靜置30 min；4 ℃ 12 000 r·min-1下離心10 min，棄上清，用70%乙醇洗沉淀2次，涼風(fēng)吹干或37 ℃烘干；加入50 μL的1×TE buffer溶解沉淀。

1.3.2 改良SDS法

對(duì)上述SDS法進(jìn)行兩方面的改進(jìn)：(1)提取緩沖液中加入2% PVP和20 μL 2% β-巰基乙醇。(2)水浴后加入500 μL氯仿-異戊醇(24∶1)，混勻靜置，離心；取450 μL上清于新的1.5 mL離心管中，加入等體積-20 ℃預(yù)冷的異丙醇，混勻。后面步驟同1.3.1。

1.3.3 CTAB法

取新鮮小麥葉片，在液氮中研磨成粉末，稱取0.05 g于1.5 mL離心管中；加入500 μL 60 ℃預(yù)熱的CTAB緩沖液和10 μL β-巰基乙醇，混勻；于60 ℃水浴30 min，間或混勻；冰浴15 min，加入500 μL氯仿-異戊醇(24∶1)，混勻后冰浴15 min，間或混勻，室溫10 000 r·min-1下離心5 min；取450 μL上清于另一1.5 mL離心管，加入等體積-20 ℃預(yù)冷的異丙醇，混勻；-20 ℃靜置30 min，4 ℃ 10 000 r·min-1下離心10 min；棄上清，用70%乙醇洗沉淀2次，涼風(fēng)吹干或37 ℃烘干；用50 μL的1×TE buffer溶解沉淀。

1.3.4 改良CTAB法

取新鮮小麥葉片，在液氮中研磨成粉末，稱取0.05 g于1.5 mL離心管中；加入500 μL 65 ℃預(yù)熱的CTAB緩沖液和10 μL β-巰基乙醇，混勻；于65 ℃水浴1 h，間或混勻；加入500 μL氯仿-異戊醇(24∶1)，不停混勻10 min，室溫10 000 r·min-1下離心5 min；取450 μL上清于另一2.0 mL離心管，加入1 500 μL(至少是上清液2倍)的-20 ℃預(yù)冷的異丙醇，混勻；于-20 ℃靜置1 h，4 ℃ 10 000 r·min-1下離心5 min；棄上清，加入500 μL的1×TE buffer于室溫溶解30 min；至白色沉淀完全溶解后，加入500 μL氯仿-異戊醇(24∶1)，輕輕混勻10～20 min，室溫10 000 r·min-1下離心5 min；取450 μL上清于新的2.0 mL離心管，加入1.5 mL -20 ℃預(yù)冷無水乙醇和60 μL醋酸鈉，混勻，于-20 ℃過夜(至少2 h)；4 ℃ 12 000 r·min-1下離心5 min，棄上清，用70%乙醇洗沉淀2次，涼風(fēng)吹干或37 ℃烘干；加入50 μL的1×TE buffer溶解沉淀。

1.3.5 AxyPrep DNA提取試劑盒法

DNA的提取嚴(yán)格按照試劑盒的操作說明進(jìn)行。

1.3.6 Qiagen DNeasy Plant Mini Kit提取試劑盒法

DNA的提取嚴(yán)格按照試劑盒的操作說明進(jìn)行。

1.3.7 再生Qiagen硅膠柱提取法

取新鮮小麥葉片，在液氮中研磨成粉末，稱取0.05 g于1.5 mL離心管中；加入500 μL 85 ℃預(yù)熱的CTAB緩沖液，混勻后于85 ℃水浴10 min，間或混勻；加入500 μL氯仿-異戊醇(24∶1)，混勻，室溫12 000 r·min-1下離心5 min；取450 μL上清于新的1.5 mL離心管，加入750 μL Binding buffer，混勻；每次移取700 μL混合液于經(jīng)1～10次再生的Qiagen硅膠柱(再生方法：將已使用過的硅膠柱于1 mol·L-1HCl浸泡12 h后，轉(zhuǎn)移至0.1 mol·L-1HCl浸泡2～3 d，最后用無菌水離心過濾清洗3遍)，12 000 r·min-1下離心1 min，棄濾液；加入700 μL Washing buffer Ⅰ，12 000 r·min-1下離心1 min，重復(fù)一次；加入800 μL Washing buffer Ⅱ，12 000 r·min-1下離心1 min，棄濾液，12 000 r·min-1離心2 min；將硅膠柱置于新的1.5 mL離心管，加入50 μL 65 ℃預(yù)熱的Elution buffer，靜置1 min，12 000 r·min-1離心1 min，可重復(fù)一次。

1.4 DNA的質(zhì)量檢測

1.4.1 微量分光光度計(jì)檢測

采用微量分光光度計(jì)(NanoVue)測定以上所提取DNA的A260/A280、A260/A230和濃度值。

1.4.2 瓊脂糖凝膠電泳檢測

取DNA溶液1 μL，用1.0%瓊脂糖凝膠在130 V的電壓下電泳20 min，由溴化乙錠染色，用Gel Doc XR+全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)(Bio-RAD公司)拍照檢測DNA質(zhì)量。

1.4.3 PCR擴(kuò)增檢測

細(xì)胞分裂素氧化酶對(duì)小麥的生長發(fā)育和產(chǎn)量有重要影響，本實(shí)驗(yàn)室目前正以細(xì)胞分裂素氧化酶基因1 ( TaCKX1)為目的基因?qū)ILLING群體進(jìn)行突變體篩選，在篩選過程中發(fā)現(xiàn)常規(guī)方法提取的DNA用于擴(kuò)增大于1 000 bp的片段時(shí)常無法擴(kuò)增出目的條帶。因此，本試驗(yàn)以擴(kuò)增 TaCKX1基因來檢測DNA的質(zhì)量。根據(jù) TaCKX1基因的DNA序列，采用primer 5.0設(shè)計(jì)引物(表1)。PCR反應(yīng)體系為10 μL，含10×PCR buffer 1 μL、25 mmol·L-1MgCl20.7 μL、100 ng·μL-1的DNA模板0.4 μL、10 μmol·L-1的上下游引物各0.4 μL、10 mmol·L-1dNTPs 0.1 μL、TaqDNA聚合酶0.2 μL、ddH2O 6.8 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸70 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增完成后，取等量的PCR產(chǎn)物，用1.0%瓊脂糖凝膠在130 V電壓下電泳15～20 min，根據(jù)條帶大小和清晰度比較PCR產(chǎn)物的質(zhì)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同方法所提取DNA的微量分光光度計(jì)檢測結(jié)果

表2為7種方法提取的DNA的純度和濃度。由表2可見，采用不同方法提取小麥基因組DNA，A260/A280比值都在1.8～2.0之間，A260/A230比值都接近2.0，說明所提取的DNA純度都很好；而再生Qiagen硅膠柱法、CTAB法和改良SDS法的DNA濃度都顯著高于其他方法。其中再生Qiagen硅膠柱法提取的濃度最高，比濃度位居第二的CTAB法提高50.2%，比Qiagen DNeasy Plant Mini Kit提取試劑盒法提高234.4%。

表1 用于擴(kuò)增 TaCKX1基因的引物Table 1 Primers of TaCKX1 gene

表2 不同方法所提取DNA的純度和濃度Table 2 Purity and concentration of DNA extracted using different methods

用SPSS 17對(duì)各濃度進(jìn)行差異顯著性分析，各濃度后不同小寫字母表示差異在0.01水平上顯著。

Significance analysis of concentrations was conducted using SPSS 17; The lowercases following the concentrations indicated the significant differences at 0.01 levels.

2.2 不同方法所提取DNA的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果

對(duì)DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖1，且多次電泳均得到相似結(jié)果。由圖1可知，7種方法所提取的DNA完整性均較好，無RNA和其他雜質(zhì)污染。在上樣量都為1 μL的情況下，SDS法和Qiagen硅膠柱法所提取DNA條帶亮度較其他方法的低，說明DNA濃度較低；改良SDS法、CTAB法和AxyPrep試劑盒法所提取的DNA主帶下方有拖帶現(xiàn)象，說明DNA有部分降解；改良CTAB法、Qiagen試劑盒法和再生Qiagen硅膠柱法提取的DNA條明亮，無拖帶現(xiàn)象，DNA質(zhì)量較好。

2.3 新鮮DNA的PCR擴(kuò)增檢測結(jié)果

將三個(gè)上游引物和兩個(gè)下游引物進(jìn)行兩兩組合，可擴(kuò)增出6種大小不同的PCR產(chǎn)物，F(xiàn)10/R16為1 078 bp，F(xiàn)10/R17為1 150 bp，F(xiàn)11/R16為970 bp，F(xiàn)11/R17為1 042 bp，F(xiàn)13/R16為659 bp，F(xiàn)13/R17為731 bp。以7種方法提取的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果均如圖2所示。其中SDS法、改良SDS法和CTAB法只能擴(kuò)增出較小的片段，對(duì)于大于1 000 bp的片段擴(kuò)增困難；改良CTAB法、AxyPrep試劑盒法、Qiagen試劑盒法和再生Qiagen硅膠柱法能夠擴(kuò)增出較大片段。

M：DL2000；1：SDS法；2：改良SDS法；3：CTAB法；4：改良CTAB法；5：AxyPrep DNA試劑盒法；6：Qiagen DNA試劑盒法；7：再生Qiagen硅膠柱法。圖2和圖3中同。

M: DL2000; 1: SDS method; 2: Modified SDS method; 3: CTAB method; 4: Modified CTAB method; 5:AxyPrep DNA column method; 6:Qiagen DNeasy Plant Mini Kit method; 7: Regenerated Qiagen column method.The same in Fig.2 and Fig.3.

圖1 7種方法所提取DNA的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

Fig.1 Agarose gel electrophoresis result of DNA extracted by seven methods

圖2 以不同方法所提取DNA為模板的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

2.4 于-20 ℃存放100 d后DNA的PCR擴(kuò)增檢測結(jié)果

TILLING技術(shù)中所提取的DNA需要長期存放，以便隨時(shí)對(duì)目的基因進(jìn)行掃描篩選，但長期存放會(huì)影響DNA的質(zhì)量，進(jìn)而影響后續(xù)的PCR結(jié)果和突變體鑒定的效率。圖3為DNA于-20 ℃存放100 d后再進(jìn)行檢測的結(jié)果，多次電泳得到相似結(jié)果。由圖可見，DNA存放一段時(shí)間后都有輕微降解，其中改良CTAB法降解最嚴(yán)重，其他方法提取的DNA主帶仍清晰明亮。為進(jìn)一步鑒定本研究所提取DNA的質(zhì)量，將能夠較好擴(kuò)增出大片段的4種DNA于-20 ℃存放100 d后再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖4。由圖4可見，存放100 d后，對(duì)于兩對(duì)擴(kuò)增小片段引物，4種方法所提取的DNA都有較好的擴(kuò)增效果；而對(duì)于四對(duì)擴(kuò)增大片段引物，則只有Qiagen法和再生Qiagen硅膠柱法能擴(kuò)增出清晰明亮的條帶，改良CTAB法和AxyPrep法擴(kuò)增結(jié)果不佳。

圖3 7種方法所提取DNA經(jīng)-20 ℃存放100 d后的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

M：DL2000；1：改良CTAB法；2：AxyPrep試劑盒法；3：Qiagen試劑盒法；4：再生Qiagen硅膠柱法。

M: DL2000; 1: Modified CTAB method; 2:AxyPrep DNA column method; 3:Qiagen DNeasy Plant Mini Kit method; 4: Regenerated Qiagen column method.

圖4 -20 ℃存放100 d后的DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增后所得產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

Fig.4 Agarose gel electrophoresis result of PCR products with DNA template stored in -20 ℃ for 100 days

3 討 論

高質(zhì)量的DNA是TILLING技術(shù)成功應(yīng)用的基礎(chǔ)。由于小麥基因組龐大，遺傳基礎(chǔ)復(fù)雜，且植株中含有較多的多酚、蛋白質(zhì)、脂類等干擾物質(zhì)，常規(guī)方法提取出的DNA往往不能滿足PCR的要求。尤其是由于用于TILLING突變體鑒定的DNA往往需要進(jìn)行長達(dá)數(shù)年甚至更長時(shí)間的保存，對(duì)DNA的質(zhì)量要求非常高。盡管國內(nèi)外研究者對(duì)DNA提取中的雜質(zhì)去除進(jìn)行了很多研究[23-26]，但在本研究條件下效果均不夠理想。本文比較了7種不同的DNA提取方法，其中SDS法、改良SDS法和CTAB法簡單快速，但所得DNA常無法擴(kuò)增出大于1 000 bp的產(chǎn)物，此結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)室利用TILLING群體對(duì)多個(gè)目標(biāo)基因突變體篩選試驗(yàn)過程中所遇到的情況是一致的。改良CTAB法和AxyPrep試劑盒法所得DNA能夠較好的擴(kuò)增出產(chǎn)物，但長期儲(chǔ)存后擴(kuò)增效果差，并且改良CTAB法耗時(shí)過長，所用試劑多，不適合TILLING技術(shù)進(jìn)行大規(guī)模基因組DNA樣品的提取。Qiagen試劑盒法和再生Qiagen硅膠柱法所提取的DNA質(zhì)量高，儲(chǔ)存一段時(shí)間后能擴(kuò)增出清晰明亮的條帶，可滿足TILLING技術(shù)對(duì)DNA質(zhì)量的要求。然而，Qiagen試劑盒的費(fèi)用較高，不適合科研經(jīng)費(fèi)不足的研究者或需要大批量提取DNA樣品的TILLING技術(shù)。而采用本實(shí)驗(yàn)室與新西蘭坎特伯雷大學(xué)Jameson教授實(shí)驗(yàn)室合作建立的再生硅膠柱法，通過HCl浸泡及無菌水洗滌等簡單程序?qū)κ褂眠^的硅膠柱進(jìn)行回收再生，可使Qiagen試劑盒硅膠柱重復(fù)利用10次以上[22]，可以大幅度降低成本。而且所提取的小麥基因組DNA具有得率高、質(zhì)量好、PCR擴(kuò)增成功率高等優(yōu)點(diǎn)，能很好地滿足TILLING技術(shù)中大量提取DNA樣品的需求。

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Optimization of Genomic DNA Extraction Methods for Mutant Screen in a Wheat TILLING Population

U Yan1,XU Jifa1,CHEN Lei1,ZHAO Jiqiang1,FU Zeyu2,JAMESON Paula E2,SONG Jiancheng1

(1.School of Life Sciences,Yantai University,Yantai,Shandong 264005,China; 2.School of Biological Sciences,University of Canterbury,Christchurch,New Zealand)

In order to optimize the genomic DNA extraction methods for efficient mutant screening in wheat TILLING population,seven different DNA extraction methods,such as SDS method,modified SDS method,CTAB method,modified CTAB method,AxyPrep DNA column method,Qiagen DNeasy Plant Mini Kit method and regenerated Qiagen column method,were compared for their effectiveness on genomic DNA extraction.The results showed that the DNA concentration varied among different extraction methods,and the DNA concentration of regenerated Qiagen column method,CTAB method,and modified SDS method were higher than that of the other method.The quality of DNA extracted by all the seven methods in terms of purity and integrity were satisfied when detected with agarose gel electrophoresis.However,when these DNA samples were used as PCR template to amplify products more than 1 000 bp in length,the amplification efficiency of the modified CTAB method,AxyPrep DNA column method,Qiagen DNeasy Plant Mini Kit method and regenerated Qiagen column method was much better than that of the other three methods.After storing the DNA samples in -20 ℃ for 100 days,the target gene sequences longer than 1 000 bp could only be amplified from the DNA samples extracted using Qiagen DNeasy Plant Mini Kit method and regenerated Qiagen column method.The newly developed method combining the regenerated Qiagen column with home-made solutions allowed us to extract high quality genomic DNA from a wheat TILLING population,with much higher DNA concentration and lower cost than the Qiagen DNeasy Plant Mini Kit.This will provide an efficient and economical genomic DNA extraction method for TILLING procedure in wheat.

Wheat; TILLING; Genome DNA; Extraction methods

時(shí)間：2017-01-16

2016-10-05

2016-12-24

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31371616)

E-mail：xuyan540769161@163.com

宋建成(E-mail:Jcsong88@yahoo.com)

S512.1；S330

A

1009-1041(2017)02-0185-07

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