徐金青，夏騰飛，王 蕾，王寒冬，張懷剛，劉登才，昌 西，沈?；?/p>

(1.中國科學(xué)院高原適應(yīng)與進(jìn)化重點實驗室，中國科學(xué)院西北高原生物研究所，青海西寧 810001； 2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100039； 3.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)小麥研究所，四川溫江 611830； 4.西藏農(nóng)牧學(xué)院，西藏林芝 860000;5.青海省作物分子育種重點實驗室，青海西寧 810001)

青稞轉(zhuǎn)錄組SSR位點及其基因功能分析

徐金青1,2，夏騰飛1,2，王 蕾1,5，王寒冬1，張懷剛1,5，劉登才3，昌 西4，沈裕虎1,5

(1.中國科學(xué)院高原適應(yīng)與進(jìn)化重點實驗室，中國科學(xué)院西北高原生物研究所，青海西寧 810001； 2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100039； 3.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)小麥研究所，四川溫江 611830； 4.西藏農(nóng)牧學(xué)院，西藏林芝 860000;5.青海省作物分子育種重點實驗室，青海西寧 810001)

為了探討青稞轉(zhuǎn)錄中SSR位點信息及其所在基因的生物學(xué)功能，使用MISA軟件分析青稞轉(zhuǎn)錄組中SSR的分布頻率和重復(fù)基元的基本類型，通過BLASTX對含有SSR的Unigene與nr、COG、Swiss-Prot和KEGG等公共數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對和功能注釋。結(jié)果表明，在青稞轉(zhuǎn)錄組拼接得到的58 065個Unigene中發(fā)現(xiàn)9 576條序列中含有11 930個SSR位點，SSR發(fā)生頻率為16.49%，平均每6.63 kb出現(xiàn)1個SSR位點，共有119種重復(fù)基元(motif)。青稞轉(zhuǎn)錄組SSR出現(xiàn)頻率最高的是三核苷酸重復(fù)基元(64.19%)，其次是二核苷酸重復(fù)基元(24.05%)。AG/CT和AGG/CCT、CCG/CGG、AGC/CTG分別是二核苷酸重復(fù)和三核苷酸重復(fù)中的優(yōu)勢重復(fù)基元。在轉(zhuǎn)錄組中SSR重復(fù)次數(shù)以5～12次為主，基序長度主要集中在12～25 bp，平均長度為21.15 bp。9 576個含SSR的Unigene與nr、COG、Swiss-Prot和KEGG等公共數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLASTX比對，分別得到7 987、5 559、5 588和2 077個注釋。通過基因功能注釋發(fā)現(xiàn)青稞轉(zhuǎn)錄組中含SSR的序列主要與生物的基礎(chǔ)代謝相關(guān)。

青稞；轉(zhuǎn)錄組；SSR；功能注釋

簡單重復(fù)序列(simple sequence repeat,SSR)又稱簡單序列長度多態(tài)性(simple sequence length polymorphism,SSLP)、短串聯(lián)重復(fù)序列(short tandem repeats,STR)、微衛(wèi)星(microsatellite)DNA，其串聯(lián)重復(fù)的核心序列為1～6 bp[5]。SSR標(biāo)記廣泛分布在真核和原核生物基因組中，具有遺傳共顯性、擴(kuò)增技術(shù)簡單、基因組中廣泛分布和多態(tài)性豐富等特點，已大量應(yīng)用于遺傳和物理圖譜構(gòu)建、基因定位、遺傳多樣性研究以及分子標(biāo)記輔助育種中[5-6]。在青稞中，SSR標(biāo)記已廣泛應(yīng)用于遺傳多樣性評估及其與農(nóng)藝性狀的關(guān)聯(lián)分析研究中。楊 菁等[7]和吳昆侖[8]利用SSR標(biāo)記分析，分別證實青海省栽培青稞和來自西藏、青海、四川和云南的青稞種質(zhì)資源具有豐富的遺傳多樣性；潘志芬等[9]利用30對SSR引物研究青藏高原栽培青稞的遺傳多樣性，并發(fā)現(xiàn)其在淀粉性狀、抗病性、麥芽性狀以及裸粒性狀等都存在豐富的遺傳變異；孟亞雄[10]等利用92對SSR標(biāo)記對108份青稞進(jìn)行遺傳多樣性分析，并通過關(guān)聯(lián)分析找到與株高、穗長、穗粒數(shù)和分蘗數(shù)等農(nóng)藝性狀相關(guān)聯(lián)的標(biāo)記。

傳統(tǒng)的SSR(基因組SSR，genomic-SSR)標(biāo)記的開發(fā)局限于已知基因組信息的物種。而以EST-SSR為代表的genetic-SSR來源于基因的轉(zhuǎn)錄區(qū)，直接與基因功能相關(guān)，進(jìn)而與相關(guān)的重要性狀關(guān)聯(lián)。二代測序技術(shù)的誕生，使得轉(zhuǎn)錄組測序廣泛得到應(yīng)用，在此基礎(chǔ)上開發(fā)的genetic-SSR相比EST-SSR提供更大的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)，從而加速了SSR標(biāo)記、特別是與重要性狀關(guān)聯(lián)的SSR標(biāo)記的開發(fā)[5]。由于不依賴于基因組信息，由轉(zhuǎn)錄組開發(fā)的分子標(biāo)記是根據(jù)基因本身的差異而建立的標(biāo)記，不僅信息量大，而且通用性好，在親緣物種之間矯正連鎖圖譜和比較作圖方面具有獨特的優(yōu)勢[11]。本研究通過對青稞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行SSR檢測，并分析SSR的序列特征及其組成情況，同時注釋其所在序列的基因功能，推測其可能相關(guān)聯(lián)的性狀，以期為今后開展青稞遺傳多樣性分析、遺傳連鎖圖譜構(gòu)建提供豐富的候選SSR標(biāo)記，同時也為青稞分子標(biāo)記輔助育種和功能基因定位研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)

選取4個青稞栽培品種(表1)作為試驗材料，種植于培養(yǎng)間。當(dāng)植株長出4～5片葉子時，取單株葉片利用Trizol法提取總RNA后，送至北京百邁克生物公司(Biomarker Technologies)，利用Illumina HiSeq 2000進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。測序數(shù)據(jù)(raw reads)經(jīng)去除rRNA、接頭以及低質(zhì)量的reads，得到clean reads。clean reads利用Trinity[12]軟件進(jìn)行從頭組裝，然后使用TGICL[13]去除冗余，得到共含79 122 598個核苷酸的58 065條Unigene。

1.2 轉(zhuǎn)錄組SSR搜索分析

通過MISA(MIcroSAtellite identification tool，http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/)軟件對轉(zhuǎn)錄組Unigene序列進(jìn)行SSR位點識別，其識別條件為單核苷酸重復(fù)不低于15次，二核苷酸重復(fù)不低于6次，三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重復(fù)不低于5次，復(fù)合SSR的識別條件是兩個SSR位點間的距離不超過100 bp。將生成的文本文件導(dǎo)入到Excel中進(jìn)行基本的統(tǒng)計分析。SSR發(fā)生頻率=搜索到的含SSR的Unigene序列數(shù)量/總Unigene序列數(shù)量；SSR分布頻率=SSR數(shù)量/總Unigene序列數(shù)量；SSR分布的平均距離=總Unigene長度/搜索到的SSR數(shù)量[6，14]。

表1 4份供試青稞材料的基本信息Table 1 Hulless barley materials used in this study

1.3 青稞轉(zhuǎn)錄組中含SSR的Unigene 的功能注釋

通過BLASTX，分別將青稞轉(zhuǎn)錄組中含SSR的9 576條Unigene序列比對到nr(non-redundant)、COG(cluster of orthologous groups of proteins)、Swiss-Prot以及KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)等蛋白數(shù)據(jù)庫，比對參數(shù)e值<10-5。將通過BLASTX與nr蛋白數(shù)據(jù)庫比對生成的XML文件導(dǎo)入到Blast2GO[15]軟件，得到轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中含SSR的Unigene序列的基因本體(gene ontology,GO)注釋信息，然后利用WEGO(http://wego.genomics.org.cn/cgi-bin/wego/index.pl)[16]在線分析軟件對注釋的Unigene序列進(jìn)行GO功能分類統(tǒng)計，分析含有SSR的Unigene的功能分布特征；通過與COG庫進(jìn)行比對后，得到的Unigene注釋結(jié)果按照COG數(shù)據(jù)庫的23個類別進(jìn)行分類統(tǒng)計；對含有SSR的Unigene序列所參與的代謝途徑的分析則是根據(jù)其在KEGG數(shù)據(jù)庫中的比對注釋信息，得到其在KEGG本體(KEGG orthology，KO)系統(tǒng)中的相應(yīng)K編號，然后利用K編號將Unigene注釋到相應(yīng)的代謝通路上。

TWEAK上游引物5′-ATCGCAGCCCATTATGAAGT-3′、下游引物 5′-GAAGAGTCCGAAGTAGGTGAGG-3′，p38MAPK 上游引物 5′-TCGAGACCGTTTCAGTCCAT-3′、下游引物5′-CCACGGACAAATATCCACT-3′，GAPDH上游引物5′-ATCACCATCTTCCAGGAGCGA-3′、下游引物5′-CCTTCTCCATGGTGGTGAAGA-3′均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

2 結(jié)果與分析

2.1 青稞轉(zhuǎn)錄組中SSR的序列特征

根據(jù)獲取的19.89 Gb青稞RNA-Seq數(shù)據(jù)，利用Trinity軟件組裝得到58 065條Unigene，總堿基數(shù)為79 122 598 bp，平均每條Unigene長約1.3 kb。使用MISA軟件共搜索到11 930個SSR，分布于9 576條Unigene上，其中含有多個SSR(含復(fù)合SSR)的Unigene共1 875條，占含SSR的Unigene序列總數(shù)的19.58%。總體上，含SSR的Unigene序列占所有Unigene的16.49%，平均每6.63 kb出現(xiàn)1個SSR。

青稞轉(zhuǎn)錄組SSR重復(fù)類型豐富，從單核苷酸重復(fù)到六核苷酸重復(fù)均有出現(xiàn)，其中以三核苷酸重復(fù)為主(7 658個)，占SSR總數(shù)的64.19%，分布頻率為13.19%；其次是二核苷酸重復(fù)(2 869個)，占SSR總數(shù)的24.05%，分布頻率為4.94%；五核苷酸和六核苷酸重復(fù)SSR數(shù)量較少，二者加起來占SSR總數(shù)的1.19%，分布頻率分別為0.19%和0.05%(表2)。二核苷酸重復(fù)的SSR平均長度最短，僅為14.97 bp，六核苷酸重復(fù)SSR平均長度最長，為31.45 bp(表2)。三核苷酸重復(fù)SSR的平均分布距離最短(10.33 kb)，而六核苷酸重復(fù)SSR平均分布距離最長(2 728.37 kb)(表2)。

不同重復(fù)類型的青稞轉(zhuǎn)錄組SSR均有多種基元。在考慮堿基互補(bǔ)且包含復(fù)合SSR重復(fù)基元的情況下，單核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重復(fù)SSR出現(xiàn)的基元種類數(shù)分別為2、4、10、33、48和22種，共計119種基元(表2)。在篩選到的11 930個SSR中，單核苷酸重復(fù)的優(yōu)勢基元為C/G，占單核苷酸重復(fù)的68.42%，占SSR總數(shù)的3.05%，而A/T基元僅占單核苷酸重復(fù)的31.57%，占SSR總數(shù)的1.41%。說明對原始序列預(yù)處理時去除5′端polyT和3′端的polyA序列是有效的，基本可以排除假陽性A/T的存在。二核苷酸重復(fù)類型中，AG/CT基元最多，占該重復(fù)類型總數(shù)的59.25%。三核苷酸重復(fù)類型的優(yōu)勢基元有CCG/CGG、AGG/CCT和AGC/CTG三種，分別占三核苷酸重復(fù)類型總數(shù)的36.88%、20.34%和16.02%，共73.24%。四、五和六核苷酸重復(fù)類型中各基元的分布頻率均較低，ATCC/ATGC、AGGGG/CCCCT和ACAGAG/CTCTGT為各自的優(yōu)勢基元，分別占各自重復(fù)類型的11.11%、10.62% 和13.79%(表2)。

青稞轉(zhuǎn)錄組SSR各重復(fù)類型在不同重復(fù)數(shù)下的數(shù)量存在明顯差異(表3)。由于單核苷酸重復(fù)類型的識別條件設(shè)置為重復(fù)數(shù)≥15，故在表3中對單核苷酸重復(fù)未做統(tǒng)計。除單核苷酸外的其余各重復(fù)類型的重復(fù)數(shù)介于5～12次之間，隨著重復(fù)次數(shù)的增加，各重復(fù)類型的出現(xiàn)頻率逐步降低。各重復(fù)類型的重復(fù)數(shù)主要集中在5～7次，占SSR總數(shù)的70.49%。二核苷酸重復(fù)的主要重復(fù)數(shù)為6～11，三核苷酸重復(fù)的主要重復(fù)數(shù)為5～7次，四核苷酸重復(fù)的重復(fù)數(shù)主要為5～6，五、六核苷酸重復(fù)的主要重復(fù)數(shù)為5。另外，重復(fù)數(shù)最多的基元為單堿基重復(fù)C/G，重復(fù)次數(shù)為40次。三堿基重復(fù)AAC/GTT基元的重復(fù)數(shù)次之，為29次，這也是長度最長的重復(fù)(87 bp)。

表2 青稞轉(zhuǎn)錄組中SSR各重復(fù)類型的分布特征Table 2 Distribution characteristics of various SSR repeat types in hulless barley transcriptome

表3 青稞轉(zhuǎn)錄組SSR各重復(fù)類型在不同重復(fù)次數(shù)下的數(shù)量Table 3 Number of various SSR repeat types with different number of repeats in hulless barley transcriptome

-表示不符合鑒定條件。

- indicated that did not meet the analysis conditions.

青稞轉(zhuǎn)錄組SSR基元長度分布如圖1所示?？傮w看來，青稞轉(zhuǎn)錄組的基元長度分布在12～87 bp。大部分青稞轉(zhuǎn)錄組SSR基元長度集中在12～25 bp(11 869個)，占SSR總數(shù)的99.49%?；L度為26～29 bp的SSR數(shù)量僅為12個，占SSR總數(shù)的0.10%。大于30 bp的有49個，僅占SSR總數(shù)的0.41%。其中基元長度為15 bp的SSR數(shù)量最多，有4 748個，占SSR總數(shù)的39.80%?；L度為18 bp的SSR數(shù)量次之(2 315個)，占SSR總數(shù)的19.40%?；?AG/CT)長度為26 bp的SSR重復(fù)僅有1個。未出現(xiàn)基元長度為29 bp的SSR。

圖1 青稞轉(zhuǎn)錄組SSR重復(fù)序列長度的分布頻率

2.2 青稞轉(zhuǎn)錄組中含SSR序列的基因功能注釋

通過MISA軟件的搜索，共有9 576條Unigene含有SSR。為了解青稞轉(zhuǎn)錄組中含有SSR序列的基因功能，本研究通過與公共蛋白數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，以期得到含有SSR序列的Unigene的功能注釋及分類信息。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有7 987、5 559、5 588、2 077條Unigene分別與nr、COG、Swiss-Prot和KEGG比對得到注釋信息，有1 683條Unigene在上述4個數(shù)據(jù)庫中得到共同注釋信息。

GO注釋用于描繪基因及其基因產(chǎn)物的特點，將基因功能分為3個本體，即細(xì)胞組分(cellular component)、分子功能(molecular function)和生物進(jìn)程(biological process)。其下又分了很多亞類，各類間互相關(guān)聯(lián)，從不同角度對基因的功能進(jìn)行分類注釋。通過對含SSR的青稞Unigene進(jìn)行GO注釋，可以全面描述青稞中含SSR基因和基因產(chǎn)物的屬性。將搜索到含有SSR的Unigene序列使用BLASTX比對到nr蛋白數(shù)據(jù)庫，取比對分值最高的為序列的注釋信息。其中7 987條Unigene序列得到了注釋信息，1 589條Unigene序列無注釋信息。再使用Blast2GO軟件進(jìn)行含SSR的Unigene的GO注釋，有5 015條Unigene序列取得相應(yīng)的GO分類號，占含SSR的Unigene序列總數(shù)的52.37%，其他2 972條不能成功注釋。將含有SSR序列的5 015條Unigene編號及其對應(yīng)的GO分類號導(dǎo)入到GO分類圖形顯示在線分析工具WEGO軟件中，得到其基因功能分布(圖2)。結(jié)果表明，有GO注釋的5 015條Unigene序列被分配至細(xì)胞組分、分子功能和生物進(jìn)程3個本體下的45個亞類中，3個本體分別包含12、11和22個亞類。在注釋到生物進(jìn)程類的Unigene中，分別有3 156條、2 627條被注釋到代謝進(jìn)程(metabolic process)和細(xì)胞進(jìn)程(cellular process)，分別占注釋為該類的Unigene數(shù)量的62.93%和52.38%。在細(xì)胞組分中，分別有2 194和2 164條具有GO分類號的Unigene被注釋到細(xì)胞(cell)和細(xì)胞成分(cell part)中，分別占注釋為該類的43.75%和43.15%。而在分子功能中，結(jié)合活性(binding)和催化活性(catalytic activity)是兩個最主要的功能分類，各有2 993條和2 275條，分別占注釋為該類的59.68%和45.36%，其中多被注釋為轉(zhuǎn)移酶活性(transferase activity)、水解酶活性(hydrolase activity)、核苷酸結(jié)合(nucleotide binding)。綜合以上信息，在青稞轉(zhuǎn)錄組中鑒定出的含有SSR的Unigene主要是參與細(xì)胞的基礎(chǔ)代謝活動。

COG數(shù)據(jù)庫是基于細(xì)菌、藻類和真核生物的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系構(gòu)建得到的，可以對基因產(chǎn)物進(jìn)行直系同源分類。對青稞轉(zhuǎn)錄組中含有SSR的Unigene進(jìn)行COG分類(圖3)，共獲得5 559個COG功能注釋，涉及4個類別、23個功能亞類。總體來看，除缺乏注解(poorly characterized)的1 639條Unigene外(其中984條為一般功能預(yù)測，655條為功能未知)，注釋到細(xì)胞進(jìn)程及信號傳遞(cellular processes and signaling)、信息存儲及處理(information storage and processing)和代謝(metabolism)三大類別的分別有1 512條、1 235條和1 173條，分別占具COG功能注釋Unigene數(shù)量的27.20%、22.22%和21.10%。在細(xì)胞進(jìn)程及信號傳遞類中，有502條注釋到細(xì)胞周期控制(cell cycle control)、細(xì)胞分裂(cell division)及染色體分隔(chromosome partitioning)亞類，有386條注釋到翻譯后修飾(posttranslational modification)、轉(zhuǎn)運(yùn)(protein turnover)及分子伴侶(chaperones)亞類，有297條注釋到細(xì)胞壁(cell wall)、細(xì)胞膜(cell membrane)及質(zhì)膜(envelope)的生物合成亞類中，分別占該類的33.20%、25.53%和19.64%。沒有Unigene注釋到細(xì)胞核結(jié)構(gòu)(nuclear structure)和細(xì)胞外結(jié)構(gòu)(extracellular structures)亞類。在信息存儲及處理類中，有659條注釋到翻譯(translation)、核糖體結(jié)構(gòu)(ribosomal structure)及生物合成(biogenesis)亞類，有292條注釋到轉(zhuǎn)錄(transcription)，有209條注釋到復(fù)制、重組和修復(fù)(replication,recombination and repair)亞類，有75條注釋到染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和動力學(xué)亞類，分別占該類的53.36%、23.64%、16.92%和6.07%。在代謝類中，有330條注釋到碳水化合物運(yùn)輸與代謝(carbohydrate transport and metabolism)亞類，占該類的28.13%，其次是氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝(amino acid transport and metabolism)、無機(jī)鹽轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝(inorganic ion transport and metabolism)和脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝(lipid transport and metabolism)。

1：細(xì)胞；2：細(xì)胞成分；3：細(xì)胞器；4：細(xì)胞器組分；5：大分子復(fù)合物；6：細(xì)胞膜；7：細(xì)胞被膜；8：細(xì)胞外區(qū)域；9：共質(zhì)體；10：病毒體；11：細(xì)胞外區(qū)域部分；12：病毒粒子部分；13：代謝進(jìn)程；14：細(xì)胞進(jìn)程；15：生物調(diào)節(jié)；16：色素沉積；17：定位；18：建立定位；19：刺激反應(yīng)；20：細(xì)胞成分組織；21：細(xì)胞成分的生物合成；22：多細(xì)胞生物進(jìn)程；23：發(fā)育過程；24：廢棄的生物進(jìn)程；25：解剖結(jié)構(gòu)形成；26：繁殖；27：生殖過程；28：多有機(jī)體過程；29：生長；30：免疫系統(tǒng)的過程；31：死亡；32：病毒繁殖；33：生物附著；34：節(jié)律過程；35：結(jié)合；36：催化活性；37：轉(zhuǎn)運(yùn)活性；38：轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性；39：結(jié)構(gòu)分子活性；40：翻譯調(diào)節(jié)活性；41：分子傳感活性；42：抗氧化活性；43：酶調(diào)節(jié)活性；44：電子載體活性；45：營養(yǎng)物儲存活性。

1:Cell；2:Cell part；3:Organelle；4:Organelle part；5:Macromolecular complex；6:Membrane；7:Envelope；8:Extracellular region；9:Symplast；10:Virion；11:Extracellular region part；12:Virion part;13:Metabolic process；14:Cellular process；15:Biological regulation；16:Pigmentation；17:Localization；18:Establishment of localization；19:Response to stimulus；20:Cellular component organization；21:Cellular component biogenesis；22:Multicellular organismal process；23:Developmental process；24:Obsolete biological process；25:Anatomical structure formation；26:Reproduction；27:Reproductive process；28:Multi-organism process；29:Growth；30:Immune system process；31:Death；32:Viral reproduction；33:Biological adhesion；34:Rhythmic process;35:Binding；36:Catalytic activity；37:Transporter activity；38:Transcription regulator activity；39:Structural molecule activity；40:Translation regulator activity；41:Molecular transducer activity；42:Antioxidant activity；43:Enzyme regulator activity；44:Electron carrier activity；45:Nutrient reservoir activity.

圖2 青稞轉(zhuǎn)錄組中含SSR的Unigene的GO注釋

Fig.2 GO annotation of Unigenes containing SSR in hulless barley transcriptome

R：一般功能預(yù)測；S：未知功能；J：翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物合成；K：轉(zhuǎn)錄；L：復(fù)制、重組和修復(fù)；B：染色體結(jié)構(gòu)與動力學(xué)；A：RNA加工與修改；D：細(xì)胞周期控制、細(xì)胞分裂、染色體分隔；O：翻譯后修飾、蛋白質(zhì)反轉(zhuǎn)、分子伴侶；M：細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、質(zhì)膜生物合成；T：信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制；U：細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸、分泌和囊泡運(yùn)輸；V：防御機(jī)制；Z：細(xì)胞骨架；N：細(xì)胞運(yùn)動；G：碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝；E：氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝；P：無機(jī)鹽轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝；I：脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝；C：能量產(chǎn)生與轉(zhuǎn)換；Q：次生代謝產(chǎn)物的合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝；H：輔酶轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝；F：核苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝。

R:General function prediction only; S:Function unknown; J:Translation,ribosomal structure and biogenesis; K:Transcription; L:Replication,recombination and repair; B:Chromatin structure and dynamics; A:RNA processing and modification; D:Cell cycle control,cell division and chromosome partitioning; O:Posttranslational modification,protein turnover and chaperones; M:Cell wall,membrane and envelope biogenesis; T:Signal transduction mechanisms; U:Intracellular trafficking,secretion and vesicular transport; V:Defense mechanisms; Z:Cytoskeleton; N:Cell motility; G:Carbohydrate transport and metabolism; E:Amino acid transport and metabolism; P:Inorganic ion transport and metabolism; I:Lipid transport and metabolism; C:Energy production and conversion; Q:Secondary metabolites biosynthesis,transport and metabolism; H:Coenzyme transport and metabolism; F:Nucleotide transport and metabolism.

圖3 青稞基因組中含SSR的Unigene的COG功能注釋

Fig.3 Functional classification of SSR Unigene in hulless barley transcriptome based on COG analysis

通過與KEGG數(shù)據(jù)庫的比對，可以分析含SSR的Unigene 在青稞代謝途徑中的富集情況。注釋KEGG代謝通路時，會給每一個功能基因定一個K編號(K numbers)，并注釋到具有相應(yīng)歸類的代謝通路(pathway)中。分析發(fā)現(xiàn)，有2 077條(21.69%)含SSR的Unigene具有KEGG注釋結(jié)果，共得到1 225個K編號并被注釋到312個KEGG代謝通路中，平均1.70個Unigene具有相同的功能，說明Unigene中有許多功能相同。另外的7 499條(78.31%)未得到注釋結(jié)果。在對注釋到的312個通路圖進(jìn)行分析時，利用KEGG數(shù)據(jù)庫的分類，將其歸類到全部7大類代謝通路中，其中被注釋到新陳代謝(metabolism)和遺傳信息處理(genetic information processing)類的Unigene數(shù)量最多，分別有534和490條，占全部含SSR的Unigene的5.58%和5.12%，占能注釋到通路的Unigene的25.71%和23.59%。對注釋到新陳代謝通路中的Unigene作進(jìn)一步分類分析，結(jié)果(圖4)發(fā)現(xiàn)，除化學(xué)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化圖(chemical structure transformation maps)亞類外，其他亞類中均有分布。注釋到碳水化合物代謝、能量代謝、氨基酸代謝和脂質(zhì)代謝途徑中的Unigene占主導(dǎo)地位，分別有199、107、104和81條，各占新陳代謝通路的37.27%、20.04%、19.48%和15.17%。這與GO注釋得到的基礎(chǔ)代謝為主的注釋結(jié)果一致。

1：碳水化合物代謝；2：能量代謝；3：氨基酸代謝；4：脂質(zhì)代謝；5：輔因子及維生素代謝；6：核苷酸代謝；7：萜類及聚酮代謝；8：其他氨基酸代謝；9：其他次生產(chǎn)物代謝；10：聚糖生物合成及代謝；11：異質(zhì)物降解及代謝。

1:Carbon metabolism; 2:Energy metabolism; 3:Amino acid metabolism; 4:Lipid metabolism; 5:Metabolism of cofactors and vitamins; 6:Nucleotide metabolism; 7:Metabolism of terpenoids and polyketides; 8:Metabolism of other amino acids; 9:Biosynthesis of other secondary metabolites; 10:Glycan biosynthesis and metabolism; 11:Xenobiotics biodegradation and metabolism.

圖4 青稞轉(zhuǎn)錄組中注釋到新陳代謝通路中的含有SSR 的Unigene的代謝途徑分析

Fig.4 Analysis of Unigenes containing SSR in hulless barley transcriptome annotated to metabolism pathway

有5 588條含SSR的Unigene在Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫中比對得到注釋信息，其中有68條直接得到了在大麥(Hordeumvulgare)中的注釋信息，2 946條是在擬南芥(Arabidopsisthaliana)中的注釋信息，1 040條是在水稻(Oryzasativa)中的注釋信息，84條是在玉米(Zeamays)中的注釋信息，72條是在小麥(Triticumaestivum)中的注釋信息。在Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫中得到注釋的5 588條Unigene中有5 573條在nr庫中也得到了注釋信息，其功能涵蓋了生物進(jìn)程、細(xì)胞組分和分子功能三大類。因此GO注釋的分類結(jié)果也可以大致用來解釋在Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫得到注釋的5 588條Unigene的分類信息。

3 討 論

3.1 青稞轉(zhuǎn)錄組中SSR的序列特征

在本研究中，青稞轉(zhuǎn)錄組SSR分布頻率為1/6.63 kb，與之前從大麥的EST數(shù)據(jù)中搜索到的SSR的頻率基本一致(1/6.30 kb)[17]。與其他植物相比較，青稞轉(zhuǎn)錄組SSR出現(xiàn)頻率高于小麥(1/15.60 kb)[18]、大豆(1/7.40 kb)[17]、番茄(1/11.10 kb)[17]、玉米(1/8.10 kb)[17]、擬南芥(1/13.83 kb)[17]、楊樹(1/14.00 kb)[17]、棉花(1/20.00 kb)[17,19]和洋蔥(1/14.10 kb)[20]。這表明，青稞轉(zhuǎn)錄組中SSR數(shù)量很豐富，出現(xiàn)頻率比較高，考慮到在本文中搜索到的SSR基于轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，因此這些SSR都有較高的利用潛能。

從目前已有的報道來看，大多數(shù)植物的EST-SSRs的重復(fù)單元類型以二核苷酸和三核苷酸為主。大麥[17,21]、燕麥[17]、黑麥[17]、水稻[21-22]、小麥[21]、高粱[21]、玉米[21]、藏茵陳川西獐牙菜[23]、洋蔥[20]、云南松[14]等植物中以三核苷酸為主。而在黨參[24]、野三七[25]、燈盞花[26]、茶樹[27]等植物中則是以二核苷酸重復(fù)為主。此外南方紅豆杉[28]、巴西橡膠樹[29]的優(yōu)勢重復(fù)基元為六核苷酸。在本研究中，青稞轉(zhuǎn)錄組中的SSR序列以三核苷酸重復(fù)為主，其次是二核苷酸重復(fù)，不同重復(fù)類型的SSR數(shù)量隨基元堿基數(shù)量增加呈下降趨勢，這種SSR重復(fù)類型的偏好性可能與分析的數(shù)據(jù)量有關(guān)，也可能與其自身長度的穩(wěn)定性有關(guān)。重復(fù)類型中三核苷酸重復(fù)居多，推測可能與三聯(lián)體密碼子選擇作用有關(guān)，因為除三、六核苷酸重復(fù)之外，其他重復(fù)類型重復(fù)次數(shù)的改變，會導(dǎo)致閱讀框的改變，容易造成移碼突變，進(jìn)而影響基因產(chǎn)物[23]。在青稞轉(zhuǎn)錄組SSR序列中二核苷酸重復(fù)以AG/CT為主，三核苷酸重復(fù)中CCG/CGG、AGG/CCT和AGC/CTG居多，這與藜麥(AG/CT)[30]、玉米(CCG/GGC和AGG/CCT)[17]基本一致。但是，不同的植物的優(yōu)勢重復(fù)基元存在差異，在藏茵陳川西獐牙菜中，二核苷酸重復(fù)中的優(yōu)勢基元類型是AT/TA[23]，在辣椒中AAC/GTT[31]是三核苷酸重復(fù)中的優(yōu)勢重復(fù)基元，這可能與植物自身基因組的差異、數(shù)據(jù)量的大小以及分析數(shù)據(jù)的來源密切相關(guān)。

3.2 青稞轉(zhuǎn)錄組中含SSR序列的功能注釋

通過對青稞轉(zhuǎn)錄組中含有SSR的Unigene在4個公共數(shù)據(jù)庫中的比對和功能注釋，發(fā)現(xiàn)在GO注釋中主要歸類于生物進(jìn)程下的代謝進(jìn)程和細(xì)胞進(jìn)程、細(xì)胞組分下的細(xì)胞和細(xì)胞部分以及分子功能下的催化和結(jié)合活性。在COG注釋中，大部分Unigene歸類于細(xì)胞進(jìn)程及信號傳遞類下的細(xì)胞周期控制、細(xì)胞分裂及染色體分隔亞類，信息存儲及處理類下的翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)及生物合成亞類，代謝類下的糖類運(yùn)輸與代謝亞類。另外，在KEGG代謝通路注釋中，大部分Unigene注釋到新陳代謝和遺傳信息處理類，且在新陳代謝途徑中，主要集中在碳水化合物代謝、能量代謝、氨基酸代謝和脂質(zhì)代謝途徑。綜合以上注釋信息，青稞轉(zhuǎn)錄組中含SSR的Unigene序列主要與生物的基礎(chǔ)代謝相關(guān)。在注釋過程中存在多個含SSR的Unigene共同注釋到相同功能上，出現(xiàn)這種情況不僅因為在一個基因家族中多個基因行使相同的功能，而且也可能是轉(zhuǎn)錄本在后期加工過程中存在可變剪接造成的，此外也與軟件拼接有關(guān)[32]。對轉(zhuǎn)錄組SSR的應(yīng)用還需要進(jìn)行相應(yīng)的引物篩選等工作，同時，可以有針對性地選擇與一定功能相關(guān)的基因作為SSR標(biāo)記位點，從而利于目標(biāo)性狀的篩選[32]。

4 結(jié) 論

使用MISA軟件分析了青稞轉(zhuǎn)錄組中SSR信息，發(fā)現(xiàn)青稞轉(zhuǎn)錄組中SSR出現(xiàn)頻率比較高，平均每6.63 kb出現(xiàn)一個SSR位點，以三核苷酸重復(fù)為主要重復(fù)類型。對含有SSR的Unigene進(jìn)行功能注釋，表明青稞轉(zhuǎn)錄組中含SSR的Unigene主要與生物的基礎(chǔ)代謝相關(guān)。總之，本文基于青稞轉(zhuǎn)錄組搜索到的SSR類型豐富，生物功能多樣，具有很大的利用潛能。

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Characterization and Gene Function Analysis of SSR Sequences in Hulless Barley Transcriptome

XU Jinqing1,2,XIA Tengfei1,2,WANG Lei1,5,WANG Handong1,
ZHANG Huaigang1,5,LIU Dengcai3,CHANG Xi4,SHEN Yuhu1,5

(1.Key Laboratory of Adaptation and Evolution of Plateau Biota,Northwest Plateau Institute of Biology,Chinese Academy of Sciences,Xining,Qinghai 810001,China; 2.University of Chinese Academy of Sciences,Beijing 100039,China; 3.Triticeae Research Institute,Sichuan Agricultural University,Wenjiang,Sichuan 611830,China; 4.Agricultural and Animal Husbandry College of Tibet University,Linzhi,Tibet 860000,China；5.Qinghai Province Key Laboratory of Crop Molecular Breeding,Xining,Qinghai 810001,China)

In order to characterize the SSRs in hulless barley (HordeumvulgareL. var.nudumHK. f.) transcriptome and annotate the SSR sequences based on bioinformatics analysis,the distribution frequency and basic repeat motifs of SSRs in hulless barley transcriptiome were screened by MISA software. The gene annotation of SSR sequences were obtained by BLASTX against nr,COG,Swiss-Prot and KEGG databases. A total of 11 930 SSRs with 119 kinds of repeat motifs were found in 58 065 Unigenes,distributed in 9 576 Unigenes,which accounted for 16.49% of all Unigenes,and the density of distribution was 6.63 kb per SSR. Among the SSRs in hulless barley transcriptome,the most abundant repeat motif was the tri-nucleotide (64.19%),followed by the di-nucleotide (24.05%). AG/CT and AGG/CCT,CCG/CGG and AGC/CTG were the superior type in di-,and tri-nucleotide repeat motif(s).Most of the repeat number of SSRs was from 5 to 12,and the length of the motif ranged from 12 to 25 bp,with an average of 21.15 bp. 9 576 SSR sequences were annotated with BLASTX against protein databases (nr,COG,Swiss-Prot and KEGG),of which,7 987,5 559,5 588 and 2 077 were annotated,respectively. The annotation of the SSR sequences in hulless barley suggested that they were mainly related to the basic biological metabolism.

Hulless barley; Transcriptome; SSR; Function annotation

時間：2017-01-16

2016-10-05

2016-12-22

青海省應(yīng)用基礎(chǔ)研究計劃項目(2015-ZJ-702)；中國科學(xué)院“西部之光”聯(lián)合學(xué)者項目；西藏自治區(qū)西部提升計劃“作物學(xué)學(xué)科建設(shè)”項目(XBTSZWXK-01)

E-mail:xjq1088@126.com

沈?；?(E-mail:shenyuhu@nwipb.cas.cn)；昌 西 (E-mail:164281890@qq.com)

S512.3；S330

A

1009-1041(2017)02-0175-10

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