段保擎，王天奇，錢偉鋒，閆文朝，彭曦冉

(河南科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，河南 洛陽 471003)

奶牛新孢子蟲病的巢式PCR診斷及ELISA檢測

段保擎，王天奇*，錢偉鋒，閆文朝，彭曦冉

(河南科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，河南 洛陽 471003)

為確定焦作某奶牛場奶牛流產(chǎn)是否與新孢子蟲感染有關(guān)，對(duì)采自該奶牛場流產(chǎn)奶牛的胎牛組織進(jìn)行新孢子蟲Nc5基因巢式PCR檢測診斷，并用ELISA方法對(duì)該奶牛場不同年齡階段奶牛血清樣品進(jìn)行新孢子蟲抗體檢測。結(jié)果顯示，在4例流產(chǎn)胎牛樣本中有3例檢出新孢子蟲DNA；新孢子蟲血清抗體陽性率達(dá)44.80%(112/250)，其中，經(jīng)產(chǎn)奶牛陽性率為55.40%(77/139)，未經(jīng)產(chǎn)奶牛或犢牛陽性率為31.53%(35/111)；經(jīng)產(chǎn)奶牛中有流產(chǎn)史的陽性率為73.17%(30/41)，其余未發(fā)生過流產(chǎn)的陽性率為47.96%(47/98)。綜上推斷，新孢子蟲是導(dǎo)致該奶牛場奶牛流產(chǎn)的主要病原。

奶牛； 新孢子蟲； 巢式PCR； 流產(chǎn)； 抗體

新孢子蟲病(neosporosis)是引起牛尤其是奶牛流產(chǎn)的重要原因之一，已有70多個(gè)國家和地區(qū)報(bào)道奶牛感染新孢子蟲[1-2]。目前，我國多個(gè)省(市)報(bào)道了新孢子蟲病[2-4]。河南省焦作市某奶牛場現(xiàn)存欄奶牛350多頭，自2006年5月—2015年9月共發(fā)生流產(chǎn)80多胎次，期間進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)室診斷，排除了弓形蟲、布氏桿菌、牛病毒性腹瀉病毒等致流產(chǎn)病原的存在。2015年10月，該奶牛場出現(xiàn)暴發(fā)性流產(chǎn)，10 d內(nèi)發(fā)生流產(chǎn)10例，占妊娠奶牛數(shù)量的20%?？紤]到該奶牛場散養(yǎng)有犬(新孢子蟲終末宿主)，推測流產(chǎn)與新孢子蟲感染有關(guān)，因此，用巢式PCR方法對(duì)該奶牛場流產(chǎn)胎牛組織進(jìn)行新孢子蟲Nc5基因檢測，同時(shí)用ELISA方法對(duì)不同年齡階段奶牛血清樣品進(jìn)行新孢子蟲抗體檢測，以確定該奶牛場新孢子蟲病的存在，旨在為該奶牛場預(yù)防新孢子蟲病提供參考。

1 材料和方法

1.1 病料采集

于2015年10月采集河南省焦作市某奶牛場4頭新鮮流產(chǎn)胎牛，胎齡為4 ～ 7個(gè)月，其母牛均未見其他明顯的臨床癥狀。將流產(chǎn)胎牛放入冰盒內(nèi)迅速送至實(shí)驗(yàn)室，取腦、心臟、肺臟、肝臟、脾臟、腎臟，-20 ℃保存。采用頸靜脈采血的方法，用一次性注射器采集不同年齡母奶牛血樣250份，每份不少于4 mL，分別編號(hào)，并收集對(duì)應(yīng)奶牛的年齡、流產(chǎn)情況(流產(chǎn)時(shí)胎齡及母牛表現(xiàn))等信息。

1.2 胎牛組織基因組 DNA提取

先用潔凈玻璃研磨器分別研磨腦、心、肺、肝、脾、腎等胎牛組織，再按組織/血液/細(xì)胞基因組DNA提取試劑盒(北京莊盟國際生物基因科技有限公司產(chǎn)品)的操作說明，提取對(duì)應(yīng)樣品中基因組DNA。

1.3 巢式PCR檢測

參考Yao 等[5]報(bào)道的針對(duì)新孢子蟲Nc5基因的巢式PCR引物進(jìn)行擴(kuò)增，外引物：Np6序列為5′-CTCGCAGTCAACCTACGTCTTCT-3′，Np21序列為5′-CCCAGTGCGTCCAATCCTGTAAC-3′；內(nèi)引物：Np9序列為5′- GTTGCTCTGCTGACGTGTCGTTG-3′，Np10序列為5′-CTCAACACAGAACACTGAACTCTCG-3′。內(nèi)引物擴(kuò)增產(chǎn)物大小是225 bp。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

PCR 擴(kuò)增采用 25 μL反應(yīng)體系：去離子水9.5 μL，2×EasyTaqPCR Super Mix 12.5 μL，上、下游引物(20 pmol/μL)各0.5 μL，模板2 μL。內(nèi)引物擴(kuò)增時(shí)取外引物擴(kuò)增產(chǎn)物1 μL為模板。

內(nèi)、外引物擴(kuò)增條件相同，均為94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，63 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸 10 min。分別以新孢子蟲 Nc-l分離株基因組DNA和去離子水為陽性對(duì)照和陰性對(duì)照。

通過2%瓊脂糖凝膠電泳，檢測巢式PCR擴(kuò)增結(jié)果。每頭新孢子蟲陽性胎牛各選取1個(gè)陽性擴(kuò)增產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司測序，通過NCBI網(wǎng)站上的BLAST工具對(duì)測序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)分析。

1.4 血清分離及抗體檢測

采集到的血液樣品首先水平放入 37 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱 2 h，然后置于4 ℃冰箱過夜，待析出血清后，將其離心轉(zhuǎn)移到潔凈離心管中(凡溶血者棄去)，貼上標(biāo)簽，保存于-20 ℃冰箱中，備用。檢測牛血清中新孢子蟲抗體的 ELISA 試劑盒由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)國家重點(diǎn)原蟲實(shí)驗(yàn)室劉群教授贈(zèng)送，按說明要求進(jìn)行血清抗體檢測。

1.5 數(shù)據(jù)處理

統(tǒng)計(jì)不同階段奶牛新孢子蟲血清抗體陽性率，用u檢驗(yàn)方法檢驗(yàn)差異顯著性[6]。

2 結(jié)果與分析

2.1 流產(chǎn)胎牛組織新孢子蟲Nc5基因巢式PCR檢測結(jié)果

從圖1可以看出，在4 例流產(chǎn)胎牛組織中，通過巢式PCR檢測出新孢子蟲Nc5基因片段陽性 3 例。3例陽性樣品，均在新孢子蟲重要寄生部位腦組織中檢出，有2例在心肌中也檢出(表1)。3個(gè)陽性病例中各選1個(gè)陽性反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行測序，經(jīng)BLAST比對(duì)結(jié)果顯示，測得的 3 株新孢子蟲Nc5基因序列之間有 3個(gè)堿基存在差異，相似性為 99%。與 GenBank 中新孢子蟲北京株(JN106449)和國外報(bào)道的新孢子蟲序列(EF463099、AY665722、AY911515)的相似性為 98%～99%。

M.DL 2000 plus DNA Marker； 1—4分別是腦、肝臟、脾臟、心臟組織；5.陽性對(duì)照； 6.陰性對(duì)照

胎牛組織編號(hào)腦心肝肺腎脾1234+++-++-------+--------+-

注：+為陽性；-為陰性; 1—4分別為流產(chǎn)時(shí)間在妊娠152、183、211、135 d的胎牛組織。

2.2 不同年齡階段新孢子蟲血清樣品檢測結(jié)果

由表2可知，本試驗(yàn)檢測的250份新孢子蟲血清樣品中，陽抗體陽性樣品112份，陽性率為44.80%。3歲以上的經(jīng)產(chǎn)奶牛血清樣品共139份，其中，77份為陽性，陽性率為55.40%；2歲以下的未經(jīng)產(chǎn)奶?；驙倥?11份，陽性樣品35份，陽性率為31.53%，經(jīng)u檢驗(yàn)，二者差異顯著(P<0.05)。3～6歲階段的新孢子蟲血清抗體陽性率53.17%(67/126)與7～9歲階段的陽性率76.92%(10/13)之間差異不顯著(P>0.05)。經(jīng)產(chǎn)奶牛中曾發(fā)生流產(chǎn)奶牛數(shù)量為41份，陽性率為73.17%(30/41)，其余未發(fā)生過流產(chǎn)的陽性率為47.96%(47/98)，經(jīng)u檢驗(yàn)，二者差異極顯著(P<0.01)。

表2 不同年齡階段新孢子蟲血清抗體陽性率情況

3 結(jié)論與討論

新孢子蟲感染是造成牛尤其是奶牛流產(chǎn)的重要原因之一，呈世界性分布，美國、英國、澳大利亞、新西蘭、日本等70多個(gè)國家都有報(bào)道，嚴(yán)重危害養(yǎng)牛業(yè)的健康發(fā)展[1-2]。我國多個(gè)省份和地區(qū)已報(bào)道該病的發(fā)生和流行。本次檢測隨機(jī)抽取4例新鮮流產(chǎn)胎牛組織，進(jìn)行了新孢子蟲病PCR診斷，并對(duì)不同年齡階段奶牛進(jìn)行血清抗體檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4例流產(chǎn)胎牛組織中3例陽性，且被檢血清抗體陽性率達(dá)44.80%，有流產(chǎn)史者陽性率極顯著高于無流產(chǎn)史的其他經(jīng)產(chǎn)奶?！，F(xiàn)場調(diào)查發(fā)現(xiàn)，該奶牛場長年散養(yǎng)4～6條犬，可自由進(jìn)入牛舍、活動(dòng)場，夜晚則多宿于飼草存放區(qū)。場內(nèi)胎盤和流產(chǎn)的胎牛被犬食用(該奶牛場現(xiàn)存的4條犬中有2條犬的糞便中檢出新孢子蟲卵囊，數(shù)據(jù)未發(fā)表)。根據(jù) Dubey 等[7]提出的奶牛感染新孢子蟲的風(fēng)險(xiǎn)因素，如牛場內(nèi)犬的存在、飼草飲水污染和缺乏管理等，結(jié)合該奶牛場奶牛流產(chǎn)的流行病學(xué)特征以及本次實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果，可以推斷新孢子蟲感染是造成該奶牛場奶牛流產(chǎn)的重要原因。

本次所檢測到的血清抗體陽性率明顯高于石冬梅等[8]所報(bào)道的該地區(qū)的陽性率 ，與王常漢等[4]在新疆地區(qū)調(diào)查某奶牛場的陽性率相當(dāng)。不同奶牛場陽性率的差異，除與檢測方法、抽樣對(duì)象有關(guān)外，還與氣候條件、牛群結(jié)構(gòu)、終末宿主的存在、飼草及飲水污染狀況、飼養(yǎng)管理水平等有關(guān)，其中，終末宿主的存在是奶牛感染本病的重要風(fēng)險(xiǎn)因素。本次檢測結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，隨供檢測奶牛年齡增加，血清抗體陽性率有增大的趨勢(shì)，說明該奶牛場奶牛新孢子蟲的感染可能主要來源于病原的水平傳播，即隨著奶牛日齡的增大，其食入犬新孢子蟲卵囊的機(jī)會(huì)大大增加，從而發(fā)生感染且血清抗體轉(zhuǎn)陽。至于場內(nèi)垂直傳播情況如何，需根據(jù)場內(nèi)奶牛系譜進(jìn)行跟蹤檢測與分析[9-10]。

鑒于奶牛感染新孢子蟲病所造成的嚴(yán)重?fù)p失，奶牛場應(yīng)重視本病的預(yù)防控制工作。首先，解決本病的水平傳播問題，將犬從場內(nèi)清除，禁止流浪犬進(jìn)入場內(nèi)；場內(nèi)員工不許與犬接觸；流產(chǎn)胎兒及胎衣要深埋，不能讓犬食入；飼草和飲水不能被犬糞便污染。其次，逐步解決垂直傳播問題，采用免疫學(xué)、PCR 等技術(shù)，檢出和隔離陽性牛，并逐步將其淘汰，同時(shí)禁止陽性牛入場，最終建立無新孢子蟲病牛群。

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Diagnosis ofNeosporacaninumInfection in Cattle Using Nested PCR and Its Detection by ELISA

DUAN Baoqing,WANG Tianqi*，QIAN Weifeng，YAN Wenchao,PENG Xiran

(College of Animal Science and Technology,Henan University of Science and Technology,Luoyang 471003,China)

In order to determine the prevalence ofNeosporacaniumin cattle from a dairy farm in Jiaozuo,aborted fetuses samples were tested by nested PCR,and serum samples of cattle with different ages were tested for antibodies toN.caninumby using an enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA).The results showed thatN.caninumDNA was detected in three of the four foetuses.N.caninumseroprevalence was 44.80%(112/250) in dairy cows.The seroprevalence was 55.40%(77/139) for dairy cows with pregnancy,31.53%(35/111) for dairy cows with no pregnancy or calf.The seroprevalence of dairy cows with an aborting history was 73.17%(30/41),47.96%(47/98) for dairy cows without abortion.Combined with the clinical manifestations of aborting dams and management in this dairy farm,N.caninumwas thought to be the most potential cause of abortions.

dairy cow;Neosporacanium; nested PCR; abortion; antibody

2016-10-12

河南科技大學(xué)博士科研啟動(dòng)基金項(xiàng)目(09001675)

段保擎(1989-)，女，河南泌陽人，在讀碩士研究生，研究方向：動(dòng)物原蟲病。E-mail:babyduan89@163.com

*通訊作者：王天奇(1965-)，男，河南新安人，教授，碩士，主要從事動(dòng)物原蟲病致病機(jī)理研究。E-mail:wtq@haust.edu.cn

S855.9

A

1004-3268(2017)02-0124-03