趙鳳菊，曹 東，李井春，魏 澍

(遼寧省動物疫病預防控制中心，遼寧 沈陽 110164)

豬源大腸埃希菌超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的檢測及其耐藥性分析

趙鳳菊，曹 東，李井春，魏 澍

(遼寧省動物疫病預防控制中心，遼寧 沈陽 110164)

為了解遼寧地區(qū)豬源大腸埃希菌產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)情況及耐藥情況，采用紙片擴散法對從遼寧地區(qū)分離到的65株大腸埃希菌進行ESBLs檢測及耐藥性分析，并用PCR方法對確證的產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌進行TEM、CTX-M、OXA和SHV基因型檢測。結果發(fā)現(xiàn)，在65株大腸埃希菌中，20株大腸埃希菌產(chǎn)ESBLs，陽性率為30.77%；在20株產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌中，9株為TEM型，1株為CTX-M型，8株為同時攜帶TEM型和CTX-M型，1株為同時攜帶TEM型和OXA型，1株為同時攜帶TEM型、CTX-M型和OXA型。藥敏試驗結果表明，產(chǎn)ESBLs菌株的耐藥率明顯高于非產(chǎn)ESBLS菌株，且產(chǎn)ESBLs菌株均為多重耐藥菌株?？梢姡|寧地區(qū)產(chǎn)ESBLs豬源大腸埃希菌的檢出率較高，流行的主要基因型為TEM型和TEM+CTX-M型。

大腸埃希菌； 超廣譜β-內(nèi)酰胺酶； 基因型； 耐藥性

腸桿菌科細菌抗β-內(nèi)酰胺類抗生素主要是由β-內(nèi)酰胺酶介導的抗生素水解[1]，β-內(nèi)酰胺酶包括青霉素酶、超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(extended spectrum beta-lactamase，ESBLs)、碳青霉烯酶和頭孢菌素酶[2]。其中，ESBLs能水解所有的青霉素類和頭孢菌素類抗生素，包括廣譜頭孢菌素，如頭孢噻肟或頭孢他啶，但對頭霉素、碳青霉烯類抗生素及酶抑制劑敏感[3-4]。ESBLs是以腸桿菌科細菌為代表的革蘭氏陰性菌對β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥的主要原因之一[5]，主要見于大腸埃希菌和克雷伯菌[6]。ESBLs通常位于質(zhì)粒上，能通過結合、轉化和轉導形式在菌株和菌種間擴散，產(chǎn)ESBLs 菌耐藥譜廣，表現(xiàn)出多重耐藥性，給臨床疾病治療帶來嚴峻的挑戰(zhàn)[7-9]。通過國內(nèi)外相關研究可知，隨著獸醫(yī)臨床上抗生素的廣泛使用，大腸埃希菌的耐藥情況越來越嚴峻，多重耐藥現(xiàn)象普遍存在。不僅嚴重影響到畜牧業(yè)的健康發(fā)展，同時也嚴重威脅著人類健康。因此，有必要掌握動物源大腸埃希菌的耐藥情況、ESBLs的分布情況及主要流行的ESBLs基因型，為豬大腸埃希菌病的綜合防治提供科學依據(jù)。

為查明遼寧地區(qū)豬源大腸埃希菌產(chǎn)ESBLs情況、ESBLs主要基因型及產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌的耐藥情況，對分離到的65株菌進行了ESBLs的檢測，并對產(chǎn)ESBLs菌株進行了基因型檢測，分析了產(chǎn)ESBLs菌株與非產(chǎn)ESBLs菌株的耐藥情況。為進一步研究豬源大腸埃希菌的耐藥機制奠定基礎，也為遼寧地區(qū)豬大腸埃希菌病的綜合防控提供科學依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 菌株是從遼寧沈陽(A)、鞍山(C)、撫順(D)、本溪(E)、錦州(G)、營口(H)、遼陽(K)、鐵嶺(M)、朝陽(N)、葫蘆島(P)10個不同地區(qū)病死豬或患病豬的組織臟器、活豬糞便中分離得到，共65株。全部菌株由遼寧省動物疫病預防控制中心實驗室保存。質(zhì)控菌株大腸埃希氏菌ATCC25922購自杭州市天和微生物試劑有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基及試劑 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基(生產(chǎn)批號分別為20130608、20130708)購自北京奧博星生物技術有限公司；頭孢曲松(CRO，30 μg/片)、頭孢噻肟(CTX，30 μg/片)、水解酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基(MH)、超廣譜β-內(nèi)酰胺酶檢測試劑盒雙紙片試條[頭孢噻肟(CTX，30 μg/片),頭孢噻肟/棒酸(CTX/CA，30 μg/片)]、頭孢他啶(CAZ，30 μg/片)、頭孢他啶/棒酸(CAZ/CA，30 μg/片)(生產(chǎn)批號分別為140506、140506、140509/141028)均購自杭州市天和微生物試劑有限公司；DNAzol基因組DNA提取試劑購自Invitrogen公司；Prime STAR?HS DNA Polymerase with GD Buffer、ExTaqDNA聚合酶、10×ExTaqBuffer、2.5 mmol/L dNTPs、DL2000 DNA Marker、溴化乙錠均購自大連寶生物科技有限公司。其他為實驗室常規(guī)試劑。

1.1.3 引物設計 根據(jù)GenBank上登錄的TEM、CTX-M、OXA和SHV基因序列，利用Primer Premier 5.0軟件設計了4對特異性引物(表1)，并由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

表1 ESBLs 4種基因型的PCR擴增引物

1.2 方法

1.2.1 ESBLs的檢測

1.2.1.1 菌懸液的制備 將待檢菌培養(yǎng)18～24 h后，挑取純培養(yǎng)菌落置于無菌生理鹽水中，制成相當于0.5麥氏單位的菌懸液，用滅菌棉簽蘸取適量均勻涂抹到MH瓊脂培養(yǎng)基表面，貼好紙片后，在35 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～18 h，測量藥敏試紙在平板中產(chǎn)生的抑菌環(huán)直徑，檢測結果根據(jù)NCCLS標準進行判定。

1.2.1.2 ESBLs初步篩選 采用紙片擴散法，篩選試驗選用CRO和CTX 2種藥敏紙片。若CRO抑菌環(huán)直徑≤25 mm或CTX抑菌環(huán)直徑≤27 mm，則提示試驗菌株可能產(chǎn)生ESBLs，需進一步作表型確證試驗來加以確定。

1.2.1.3 ESBLs表型確證 確證試驗按ESBLs檢測試劑盒雙紙片試條操作說明進行。若確證試驗時含棒酸紙片的抑菌環(huán)直徑大于不加棒酸紙片的抑菌環(huán)5 mm以上，則判定產(chǎn)生ESBLs。

1.2.2 ESBLs基因型檢測

1.2.2.1 細菌培養(yǎng)及菌液的DNA模板制備 將大腸埃希菌劃線接種于麥康凱培養(yǎng)基于37 ℃培養(yǎng)18～24 h后，挑選典型菌落，用1 mL無菌生理鹽水制備成一定濃度的菌懸液。吸取200 μL菌懸液至1.5 mL Eppendorf管中，加入800 μL DNAzol提取試劑，混勻后4 ℃、 12 000 r/min離心10 min。吸取900 μL上清，置于新的1.5 mL Eppendorf管中，加入500 μL無水乙醇，混勻后4 ℃、12 000 r/min離心5 min。吸棄上清，用無菌水配制的75%乙醇洗滌2次，干燥后用40 μL無菌水溶解沉淀，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.2 ESBLs基因型檢測反應體系 采用25 μL反應體系，10×PCR Buffer 2.500 μL，2.5 mmol/L dNTP 2.000 μL，上、下游引物(20 μmol/L)各1.000 μL，ExTaq酶0.125 μL，滅菌水16.375 μL，模板2.000 μL。

1.2.2.3 ESBLs基因型測序反應體系 采用50 μL反應體系，Prime STAR HS DNA Polymerase 0.5 μL，2×Prime STAR GD Buffer(Mg2+plus)25.0 μL， dNTP Mixture(2.5 mmol/L each)8.0 μL，上、下游引物各1.0 μL(引物濃度為20 μmol/L)，模板5.0 μL，滅菌水補至50.0 μL。

1.2.2.4 產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌基因型檢測 應用建立的基因型檢測方法對確證產(chǎn)ESBLs的大腸埃希菌進行基因型檢測。

1.2.2.5 擴增產(chǎn)物的序列測定 各選2株TEM和OXA基因型PCR產(chǎn)物及5株CTX-M基因型PCR產(chǎn)物直接送上海生工生物工程技術服務有限公司進行序列測定，并與NCBI基因庫進行序列同源性比較。

1.2.3 藥敏試驗 采用常規(guī)藥敏紙片擴散法，挑取18～24 h的培養(yǎng)物制備成0.5麥氏單位的菌懸液，均勻涂布于MH瓊脂培養(yǎng)基表面，培養(yǎng)18～16 h，測量抑菌環(huán)直徑。藥敏結果根據(jù)NCCLS標準按敏感(S)、中介(I)、耐藥(R)進行判定。

2 結果與分析

2.1 ESBLs篩選試驗結果

質(zhì)控菌株大腸埃希氏菌ATCC25922對頭孢曲松和頭孢噻肟2種藥物的抑菌環(huán)直徑均在質(zhì)控范圍內(nèi)。通過初步篩選試驗可知，65株大腸埃希菌中有32株可判定為疑似產(chǎn)ESBLs菌株。

2.2 ESBLs確證試驗結果

通過對32株判定為疑似產(chǎn)ESBLs菌株進行的表型確證試驗可知，20株大腸埃希氏菌被確定為產(chǎn)ESBLs菌株，陽性率為30.77%(表2)。

表2 32株可能產(chǎn)ESBLs菌株的確證試驗結果 mm

注：+為陽性；-為陰性，下同。

2.3 產(chǎn)ESBLs與非產(chǎn)ESBLs菌株藥敏對比結果

采用紙片擴散法，對20株產(chǎn)ESBLs與45株非產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌進行13種抗菌藥物的藥敏試驗(表3)。分析結果表明，產(chǎn)ESBLs菌株對所選13種抗菌藥物的耐藥率明顯高于非產(chǎn)ESBLs菌株；且產(chǎn)ESBLs菌株均表現(xiàn)為多重耐藥性，其中，65%(13/20)為9～11重耐藥菌，20%(4/20)為7～8重耐藥菌，15%(3/20)為4～6重耐藥菌。

表3 產(chǎn)與非產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌藥敏試驗比較結果

2.4 產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌基因型檢測結果

通過設計的4對特異性引物對確證的20株產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌進行了基因型試驗。試驗結果表明，在20株產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌中，9株為TEM型，占45%；1株為CTX-M型，占5%；8株為TEM+CTX-M型，占40%；1株為TEM+OXA型，占5%；1株為TEM+CTX-M+OXA型，占5%；未檢測出攜帶SHV型的菌株(表4)。

表4 20株產(chǎn)ESBLs菌株基因型檢測結果

2.5 ESBLs陽性擴增產(chǎn)物的序列測定結果

2株TEM基因PCR產(chǎn)物測序結果顯示：A6、G4樣品與NCBI基因庫中TEM基因的同源性均為100%。2株OXA基因PCR產(chǎn)物測序結果顯示，A6、G4樣品與NCBI基因庫中OXA基因的同源性均為99%。A2、A6、C2、C3、H1樣品與NCBI基因庫中CTX-M基因的同源性均為99%。

3 結論與討論

雖然各種抗生素和化學合成藥物在人類與動物各種疾病的防控中發(fā)揮了重要而積極的作用，但由于近年來抗菌藥物的不合理使用導致多種病原菌對各種抗菌藥物的耐藥性日趨嚴峻，尤其是多重耐藥菌株的不斷出現(xiàn)嚴重威脅著人類健康，也給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失[10-15]。ESBLs的產(chǎn)生是導致細菌產(chǎn)生多重耐藥性的主要原因之一，目前超過200多種的ESBLs已經(jīng)在各種腸桿菌科的物種和其他非腸道微生物中被發(fā)現(xiàn)[1]，且產(chǎn)ESBLs細菌在世界范圍內(nèi)越來越普遍[16]，攜帶ESBLs的腸桿菌科細菌已成為重要的病原菌[1]。雖然大腸埃希菌耐藥基因的傳播能夠通過多種途徑進行，但動物源食品是人類ESBLs陽性菌株的主要來源，對人類健康造成潛在危脅[17]。因此，掌握動物源大腸埃希菌ESBLs的產(chǎn)生、分布情況及其主要基因特點對人類健康具有重要意義。在對遼寧地區(qū)豬源大腸埃希菌ESBLs的檢測中發(fā)現(xiàn)，ESBLs的陽性率為30.77%，除撫順、葫蘆島外，其他8個市(區(qū))均分離到產(chǎn)ESBLs的大腸埃希菌，說明遼寧地區(qū)豬源大腸埃希菌中ESBLs的檢出率很高，且分布范圍很廣。在產(chǎn)與非產(chǎn)ESBLs菌株的耐藥性比較中也發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)ESBLs菌株的耐藥率明顯高于非產(chǎn)ESBLs菌株；且產(chǎn)ESBLs菌株耐藥譜廣，主要為9～11重耐藥，占65%。由此可見，ESBLs的產(chǎn)生是導致豬源大腸埃希菌多重耐藥出現(xiàn)的主要原因。

由于第3代頭孢菌素的頻繁使用，在1983年首次報道了能夠水解廣譜頭孢菌素的由質(zhì)粒編碼的β-內(nèi)酰胺酶[18]，這些ESBLs大多數(shù)是TEM、SHV或CTX-M型成員[19]。最近,CTX-M型ESBLs的檢出率越來越高，尤其是在產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌中[20]。為明確遼寧地區(qū)豬源大腸埃希菌中ESBLs的基因型，建立了針對TEM、CTX-M、OXA和SHV基因型的PCR檢測方法，并對確證產(chǎn)ESBLs的菌株進行了基因型鑒定。通過對TEM、CTX-M和OXA基因擴增陽性PCR產(chǎn)物的序列測定與分析，證明本研究所建立的PCR方法可以準確地對產(chǎn)ESBLs菌株進行基因型鑒定。通過用所建立的基因型檢測方法對20株產(chǎn)ESBLs菌株進行檢測發(fā)現(xiàn)，遼寧地區(qū)ESBLs主要為TEM基因型，其次為TEM+CTX-M型，同時遼寧地區(qū)還檢出攜帶TEM+OXA型和TEM+CTX-M+OXA型的菌株，未檢測出攜帶SHV型的菌株。

在過去60 a里，β-內(nèi)酰胺類抗生素對細菌性感染的治療一直是最成功的藥物[21]。由于目前使用的抗生素超過一半為β-內(nèi)酰胺類抗生素，β-內(nèi)酰胺類耐藥菌的出現(xiàn)使其臨床效果嚴重受限[22]。在抗生素選擇性壓力不斷增大的情況下，新的ESBLs不斷出現(xiàn)[23]，使得細菌病的臨床治療難以奏效。因此，有必要定期對動物群體進行耐藥性及ESBLs檢測，科學指導臨床用藥，為細菌病的防治提供理論依據(jù)。

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Detection and Analysis of Drug Resistance of ESBLs in Escherichia coli Strains Isolated from Swine

ZHAO Fengju,CAO Dong,LI Jingchun,WEI Shu

(Prevention and Control Center of Liaoning Province Animal Epidemic Disease,Shenyang 110164,China)

In order to investigate extended spectrum beta-lactamase(ESBLs) production and drug resistance ofEscherichiacolistrains isolated from swines in Liaoning areas,65 strains ofE.coliisolates were tested.ESBLs was detected by K-B,and the genotypes ofTEM,CTX-M,OXAandSHVwere detected by PCR.The results indicated that 20 strains were producing ESBLs in 65 strains ofE.coli,and the positive rate was 30.77%.Nine strains wereTEMtype,one strain wasCTX-Mtype,eight strains wereTEMandCTX-Mtype,one strain wasTEMandOXAtype,one strain wasTEM,CTX-MandOXAtype.The drug resistance rate of ESBLs producing strain was higher than that of non-ESBLs strains,and all of them were multiple drug resistance strains.This study showed that the detection rate of ESBLs strains was higher,TEMtype,TEMandCTX-Mtype were predominant genotypes in Liaoning areas.

Escherichiacoli; ESBLs; genotype; drug resistance

2016-08-10

遼寧省自然科學基金項目(201402573， 2130106)

趙鳳菊(1978-)，女，河北廊坊人，高級獸醫(yī)師，碩士，主要從事動物人畜共患病的防控與研究。 E-mail:fengjuzhao2003@163.com

S855.1

A

1004-3268(2017)02-0111-05