宋雨霏，郭 彥，辛友志，崔建偉，周?chē)?guó)利

(聊城大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,山東 聊城 252059)

牛BBOX1基因3′UTR變異體的克隆及其多態(tài)性分析

宋雨霏，郭 彥，辛友志，崔建偉，周?chē)?guó)利*

(聊城大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,山東 聊城 252059)

為鑒定牛BBOX1基因選擇性多聚腺苷酸化的不同變異體及其3′UTR的多態(tài)性，采用3′RACE的方法檢測(cè)出BBOX1基因3個(gè)不同3′UTR全長(zhǎng)的APA變異體，短APA變異體3′ UTR長(zhǎng)度為229 bp，長(zhǎng)APA變異體3′UTR長(zhǎng)度分別為664 bp和678 bp。利用SSCP與測(cè)序相結(jié)合的方法，在BBOX1基因的3′UTR中檢測(cè)到10個(gè)多態(tài)性，其中7個(gè)為SNP，分別為c.12T>C、c.100A>G、c.241T>C、c.480T>C、c.557T>C、c.606T>C和c.650T>C；3個(gè)為插入或缺失突變，分別為c.28_29insC、c.434_435delGT和c.512_513insTGC。SNP c.650T>C定位在Poly(A)加尾信號(hào)PAS3中，使加尾信號(hào)序列AAUAAA突變成AACAAA，導(dǎo)致3′ UTR長(zhǎng)度為678 bp的變異體出現(xiàn)。

牛；BBOX1基因； 選擇性多聚腺苷酸化； 多態(tài)性； 3′ UTR

左旋肉堿是體內(nèi)脂肪代謝必需的內(nèi)在物質(zhì)，其具有促進(jìn)脂肪酸的β-氧化、降低血清膽固醇及甘油三酯的含量、提高機(jī)體耐受力等重要生理功能[1]。還可以和線(xiàn)粒體內(nèi)的短鏈?；?乙酰、丙酰、支鏈酰等)結(jié)合，形成酰-肉堿排出細(xì)胞外，從而起到調(diào)節(jié)線(xiàn)粒體內(nèi)?；鵆oA與CoA-SH的比例的作用，并為細(xì)胞質(zhì)中脂肪酸合成提供乙?；蟍2]。因此，左旋肉堿對(duì)動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育、繁殖、健康具有重要的作用[3]。左旋肉堿主要是在5種酶的作用下，以賴(lài)氨酸和蛋氨酸為原料合成[4]。在左旋肉堿的生物合成途徑中，最后一步反應(yīng)由γ-丁酰甜菜堿羥化酶(gamma-butyrobetaine hydroxylase 1,BBOX1)催化完成[5]。研究報(bào)道，不同飲食可以改變BBOX1基因的表達(dá)水平和酶的活性，從而影響肉毒堿的利用。增加脂肪酸利用將會(huì)相應(yīng)地提高左旋肉堿合成相關(guān)酶的含量及左旋肉堿的水平。禁食時(shí)機(jī)體將優(yōu)先利用脂肪酸作為能量來(lái)源，所以會(huì)引起B(yǎng)BOX1基因 mRNA水平、BBOX1酶活性和左旋肉堿含量的上升[6]。

人和鼠的BBOX1基因的cDNA翻譯區(qū)已被克隆，在這2個(gè)物種中，開(kāi)放閱讀框(ORF)長(zhǎng)度為1 161 bp，編碼387個(gè)氨基酸[7-8]。通過(guò)3′RACE方法，已經(jīng)鑒定出人、小鼠的BBOX1基因存在不同長(zhǎng)度的3′UTR選擇性多聚腺苷酸化(alternative polyadenylation，APA)變異體[9-10]。小鼠高脂肪飼喂后，BBOX1基因的近端多聚腺苷酸加尾信號(hào)的變異體的mRNA表達(dá)量增加2.1倍，從而導(dǎo)致BBOX1活性和左旋肉堿產(chǎn)量的提高[10]。目前，關(guān)于牛的BBOX1基因的APA變異體及該基因遺傳變異的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。為此，鑒定了牛BBOX1基因的APA變異體，并檢測(cè)該基因3′UTR的多態(tài)性，以期為該基因在牛肉質(zhì)性狀及脂肪沉積中的功能研究奠定分子生物學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 供試動(dòng)物

供試魯西黃牛和草原紅牛分別來(lái)自山東省聊城市張爐集鎮(zhèn)牛場(chǎng)和吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)牛場(chǎng)。

1.2 主要試劑

SMARTTMRACE cDNA 擴(kuò)增試劑盒和Advantage?2 PCR 試劑盒購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；pGM Simple T Fast克隆試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、Trizol、TaqDNA 聚合酶、dNTPs、EDTA、SDS、氯仿、去離子甲酰胺、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、瓊脂糖均購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；其他常規(guī)試劑均為分析純。

1.3 組織樣品采集、DNA及總RNA的提取

魯西黃牛和草原紅牛各30頭，用打耳器采集耳組織樣品，將其放入75%乙醇中帶回實(shí)驗(yàn)室，-20 ℃保存。用動(dòng)物組織基因組DNA抽取試劑盒提取耳組織的基因組DNA，溶于TE緩沖液中，-20 ℃保存。在山東省聊城市張爐集鎮(zhèn)屠宰廠(chǎng)，采集3頭魯西黃牛的肝臟組織，屠宰后20 min內(nèi)采集肝臟組織并迅速投到液氮中帶回實(shí)驗(yàn)室，利用Trizol試劑提取總RNA，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA的完整性。

1.4 3′ RACE鑒定BBOX1基因的APA變異體

根據(jù)NCBI中電子克隆的牛BBOX1基因(NM_001101881.2)的mRNA序列，利用Oligo 7.0軟件設(shè)計(jì)1條3′RACE基因特異性引物，用于擴(kuò)增BBOX1基因的不同長(zhǎng)度的APA剪切變異體。引物序列為5′-GGCTTATGCTGACTGGGATGTG-3′。利用方法1.3中提取的肝臟組織的總RNA為材料進(jìn)行3′RACE，操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。3′ RACE的產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，然后用凝膠DNA回收試劑盒純化回收，將回收的產(chǎn)物進(jìn)行TA克隆，獲得的陽(yáng)性克隆由生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序，測(cè)序結(jié)果采用DNAStar 5.0進(jìn)行序列分析。

1.5 牛BBOX1基因3′ UTR的多態(tài)性檢測(cè)

根據(jù)NCBI中牛BBOX1基因(NM_001101881.2)的mRNA序列設(shè)計(jì)2對(duì)引物，用于擴(kuò)增BBOX1基因3′UTR區(qū)域。F1為5′-ATGCTGACTGGGATGTGG-3′，R1為5′-GGGCAAAAGAGAGTTCAGGAT-3′；F2為5′-GAAATGAATCCGCCACAGGTAT-3′，R2為5′-TTGGTGAGGGCTGGAAAT-3′。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系為25 μL，包括50 ng基因組DNA，10 pmol/L 的上、下游引物，200 μmol/L 的dNTPs，1.5 mmol/L MgCl2，1.5 UTaq酶。樣品經(jīng)94 ℃變性3 min后，按下列程序進(jìn)行擴(kuò)增：94 ℃變性30 s，59 ℃退火30 s，最后72 ℃延伸30 s，33個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

利用SSCP的方法鑒定BBOX1基因3′UTR區(qū)的遺傳變異。取2 μL PCR 產(chǎn)物和5 μL上樣緩沖液[98%甲酰胺、0.025%溴酚藍(lán)、0.025%二甲苯氰、10 mmol/L EDTA(pH值8.0)、10%甘油]置于PCR 管中，離心混勻，98 ℃變性10 min，迅速插入冰中，放置10 min，使之保持變性狀態(tài)。樣品用12%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。電泳結(jié)束后，進(jìn)行銀染顯帶。用凝膠成像系統(tǒng)拍照,進(jìn)行基因型分析并記錄結(jié)果。然后分別選擇2個(gè)不同電泳條帶的純合基因型個(gè)體的PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆測(cè)序，用NCBI 中的BLAST程序及DNAStar軟件比較它們之間的核苷酸變異。應(yīng)用RegRNA 2.0程序(http://regrna2.mbc.nctu.edu.tw/)預(yù)測(cè)BBOX1基因3′UTR區(qū)的miRNA結(jié)合位點(diǎn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛BBOX1基因APA變異體

牛BBOX1基因3′ RACE的產(chǎn)物通過(guò)2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，獲得了條帶清晰、特異性好的2條帶，片段長(zhǎng)度與預(yù)期的相符(圖1)。進(jìn)一步將大小不同的2個(gè)3′ RACE產(chǎn)物進(jìn)行克隆測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果表明，3′ RACE產(chǎn)物是BBOX1基因3′ UTR的不同APA變異體，且發(fā)現(xiàn)了3個(gè)不同長(zhǎng)度的APA變異體(圖2)。通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)，變異體Ⅰ利用的是近端加尾信號(hào)PAS1，而變異體Ⅱ和Ⅲ分別利用遠(yuǎn)端加尾信號(hào)PAS3和PAS4。加尾信號(hào)PAS2功能未知，需進(jìn)一步研究。以加poly(A)位點(diǎn)為終點(diǎn)，短的APA變異體3′ UTR長(zhǎng)度為229 bp(變異體Ⅰ)，加尾信號(hào)與其加尾位點(diǎn)之間為15 bp，較長(zhǎng)的APA變異體3′ UTR長(zhǎng)度為664 bp(變異體Ⅱ)和678 bp(變異體Ⅲ)，加尾信號(hào)PAS3、PAS4與各自的加尾位點(diǎn)之間的距離分別是11 bp和7 bp。而且，PAS3中的堿基T突變?yōu)閴A基C(c.650T>C)，導(dǎo)致變異體Ⅲ的出現(xiàn)。

M.DL2000 DNA Marker； 1—3.3′ RACE擴(kuò)增產(chǎn)物圖1 魯西黃牛BBOX1基因3′ RACE產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

帶有雙下劃線(xiàn)的“TGA”為終止密碼子，終止密碼子后的第1個(gè)堿基記為“+1”；矩形方框內(nèi)的“AATAAA”為多聚腺苷酸加尾信號(hào)，依次為PAS1、PAS2、PAS3和PAS4；帶單下劃線(xiàn)的堿基位置為pol(A)加尾位點(diǎn)，并代表不同的剪切變異體，依次為變異體Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ圖2 牛BBOX1基因不同多聚腺苷酸化位點(diǎn)的3′ UTR序列

2.2 牛BBOX1基因3′UTR的SNPs鑒定

在魯西黃牛和草原紅牛的研究群體中，通過(guò)SSCP與測(cè)序相結(jié)合的方法，在BBOX1基因3′UTR中共檢測(cè)到10個(gè)多態(tài)性(表1)，其中7個(gè)為SNPs，分別為c.12T>C、c.100A>G、c.241T>C、c.480T>C、c.557T>C、c.606T>C和c.650T>C；3個(gè)為插入或缺失突變，分別為c.28_29insC、c.434_435delGT和c.512_513insTGC。SNP c.650T>C落在Poly(A)加尾信號(hào)PAS3中，使加尾信號(hào)序列AAUAAA突變成AACAAA。這些多態(tài)性都能造成某種限制性核酸內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)缺失。對(duì)BBOX1基因3′UTR區(qū)的miRNA結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，bta-miR-2451、bta-miR-1343和bta-miR-2454分別定位在c.12T>C、c.512_513insTGC、c.557T>C突變區(qū)域內(nèi)。

表1 牛BBOX1基因3′ UTR區(qū)的遺傳變異

注：SNPs位置以mRNA序列(NM_001101881.2)為參考序列，以終止密碼子下游的第1個(gè)堿基定為“1”。

3 結(jié)論與討論

多聚腺苷酸化位點(diǎn)的選擇決定著mRNA的3′UTR的長(zhǎng)度，3′UTR調(diào)控序列的呈現(xiàn)或缺失最終可能會(huì)影響蛋白質(zhì)表達(dá)水平。mRNA 3′UTR的不同長(zhǎng)度可能會(huì)導(dǎo)致mRNA不同的穩(wěn)定性或翻譯能力。更長(zhǎng)的3′UTR包含更多的與miRNA和/或RNA結(jié)合蛋白等結(jié)合的順式作用元件，從而影響mRNA的穩(wěn)定性、定位和翻譯[11-12]。研究表明，大約有54%的人基因和52%的小鼠基因存在APA[13-14]。本研究鑒定了3個(gè)不同長(zhǎng)度的3′ UTR，每個(gè)多聚腺苷酸化位點(diǎn)前都包含至少1個(gè)加尾信號(hào)(AATAAA)，但在加尾過(guò)程中具體使用的加尾信號(hào)需進(jìn)一步研究確定。一般情況下，加尾信號(hào)位于切割位點(diǎn)上游10～30 bp。由此推測(cè)，這些加尾信號(hào)可能都起到一定的作用。許多加尾信號(hào)下游的切割位點(diǎn)是不精確的，且常包含著多個(gè)切割位點(diǎn)。這樣的情況在22%的嚙齒動(dòng)物轉(zhuǎn)錄本中也有發(fā)現(xiàn)，而且在最近的研究中發(fā)現(xiàn)，大約47%的鼠科動(dòng)物基因中存在這種異質(zhì)性[15]。目前，在人類(lèi)中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有2個(gè)不同的3′ UTR變異體，1個(gè)長(zhǎng)的和1個(gè)短的3′ UTR變異體，每個(gè)加尾信號(hào)后的切割位點(diǎn)也不精確，存在多個(gè)切割位點(diǎn)[9]。在小鼠中鑒定出5個(gè)不同長(zhǎng)度的3′UTR變異體，4個(gè)較短的3′ UTR變異體，1個(gè)長(zhǎng)的3′UTR變異體，其中最短的3′UTR變異體包含2個(gè)加尾切割位點(diǎn)[10]。本研究通過(guò)3′ RACE試驗(yàn)，在牛中鑒定了3個(gè)不同長(zhǎng)度的3′ UTR變異體，1個(gè)短的和2個(gè)長(zhǎng)的3′UTR變異體，都與人類(lèi)的相似性較高，而與小鼠的差別較大。

SNPs是指在基因組上單個(gè)核苷酸的變異，包括轉(zhuǎn)換、顛換、缺失和插入，但通常所說(shuō)的SNPs并不包括后2種情況。SNPs形成的遺傳標(biāo)記，其數(shù)量很多，多態(tài)性豐富。SNPs 是指變異頻率大于1%的單核苷酸變異，在人類(lèi)基因組中大概每1 000個(gè)堿基就有1個(gè)SNP。因此，SNPs成為第3代遺傳標(biāo)志，人體許多表型差異、對(duì)藥物或疾病的易感性等都可能與SNPs有關(guān)[16-18]。本研究在牛BBOX1基因的3′UTR中檢測(cè)到了10個(gè)多態(tài)性，如此高的多態(tài)性數(shù)量可能與3′UTR區(qū)變異程度較高有關(guān)。其中,c.650T>C定位在Poly(A)加尾信號(hào)中，使加尾信號(hào)序列AAUAAA突變成AACAAA，推測(cè)該SNP可能對(duì)APA的形成及基因的表達(dá)有影響。另外，bta-miR-2451、bta-miR-1343和bta-miR-2454分別位于c.12T>C、c.512_513insTGC、c.557T>C突變區(qū)域內(nèi)，推測(cè)這些突變位點(diǎn)可能是成因性突變，對(duì)基因的表達(dá)調(diào)控及基因的功能有重要影響。通過(guò)對(duì)牛BBOX1基因的APA變異體的鑒定及3′UTR的SNPs檢測(cè)，可以為牛BBOX1基因的功能研究奠定基礎(chǔ)，也為牛肉質(zhì)及脂肪沉積的研究提供了分子生物學(xué)素材。

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Cloning of 3′UTR Isoforms and Polymorphisms in Bovine BBOX1 Gene

SONG Yufei,GUO Yan,XIN Youzhi,CUI Jianwei,ZHOU Guoli*

(College of Life Science,Liaocheng University,Liaocheng 252059,China)

The objective of this study was to identify isoforms of 3′UTR and polymorphisms in 3′UTR regions of bovineBBOX1 gene.Three different alternative polyadenylation(APA) isoforms of 3′UTR in theBBOX1 gene were identified by 3′RACE.Their lengths were 229,664,678 bp,respectively.Ten polymorphisms loci were identified in 3′UTR ofBBOX1 gene by single strand conformation polymorphism(SSCP) and sequencing.There were seven SNPs,including c.12T>C,c.100A>G,c.241T>C,c.480T>C,c.557T>C,c.606T>C,and c.650T>C.Three were deletion/insertion mutations,including c.28_29insC,c.434_435delGT,and c.512_513insTGC.SNP c.650T>C was located in polyadenylation signals sequence PAS3.Moreover,the mutation changed AAUAAA into AACAAA,resulting in presence of 678 bp isform of 3′UTR in bovineBBOX1 gene.

cattle;BBOX1 gene; APA; polymorphisms; 3′UTR

2016-08-20

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31571274)；山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(ZR2015CM025)；聊城大學(xué)博士啟動(dòng)基金項(xiàng)目(31805)

宋雨霏(1993-)，女，山東菏澤人，在讀碩士研究生，研究方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)。 E-mail：448953745@qq.com

*通訊作者：周?chē)?guó)利(1975-)，男，內(nèi)蒙古赤峰人，副教授，博士，主要從事動(dòng)物遺傳與功能基因遺傳調(diào)控研究。 E-mail:glzhou1975@163.com

S813.2

A

1004-3268(2017)02-0120-04