韋珍珍，毋瑞華，魏小春，楊 妍，田保明，位 芳*，師恭曜，曹剛強(qiáng)，張曉偉

(1．鄭州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 河南 鄭州 450001； 2．河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 園藝研究所，河南 鄭州 450002)

白菜同源多倍體減數(shù)分裂期聯(lián)會(huì)復(fù)合體蛋白ZYP1的細(xì)胞學(xué)分析

韋珍珍1，毋瑞華1，魏小春2，楊 妍1，田保明1，位 芳1*，師恭曜1，曹剛強(qiáng)1，張曉偉2

(1．鄭州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 河南 鄭州 450001； 2．河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 園藝研究所，河南 鄭州 450002)

為解析多倍體植物減數(shù)分裂期同源染色體的正常配對(duì)和聯(lián)會(huì)的細(xì)胞學(xué)機(jī)制，以白菜同源多倍體為研究對(duì)象，利用免疫熒光分析技術(shù)，解析了聯(lián)會(huì)復(fù)合體相關(guān)蛋白ZYP1在減數(shù)分裂前期I過(guò)程中的細(xì)胞學(xué)行為。結(jié)果表明：與二倍體相比，白菜同源多倍體減數(shù)分裂期同源染色體聯(lián)會(huì)、配對(duì)及分離過(guò)程基本正常，聯(lián)會(huì)復(fù)合體蛋白ZYP1抗體熒光信號(hào)變化趨勢(shì)基本一致，但ZYP1免疫熒光信號(hào)顯著增強(qiáng)。因此，與二倍體相比，同源多倍體植物很可能通過(guò)增強(qiáng)聯(lián)會(huì)復(fù)合體蛋白ZYP1的表達(dá)水平，以協(xié)調(diào)同源染色體的正常聯(lián)會(huì)與配對(duì)，進(jìn)而保證多倍體植物的正常減數(shù)分裂過(guò)程。

減數(shù)分裂； 聯(lián)會(huì)復(fù)合體； ZYP1； 同源四倍體； 白菜

多倍體植物在自然界中廣泛存在。有研究表明，多倍體化是促使植物進(jìn)化的重要?jiǎng)恿1]。同源多倍體來(lái)自內(nèi)部一個(gè)或單個(gè)物種種群之間的多倍化事件，隨著基因組加倍的進(jìn)行，單個(gè)或者多個(gè)基因的功能會(huì)有所改變，調(diào)控系統(tǒng)中的一些基因數(shù)量也會(huì)增加，這就需要一個(gè)系統(tǒng)有規(guī)律的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[2]。減數(shù)分裂過(guò)程在有性生殖物種代代相傳歷程中是一個(gè)重要的環(huán)節(jié)，在整個(gè)減數(shù)分裂過(guò)程中，前期 Ⅰ 相對(duì)復(fù)雜一些，會(huì)發(fā)生同源染色體間的相互配對(duì)、聯(lián)會(huì)和重組，這個(gè)過(guò)程的正常進(jìn)行，對(duì)于之后二價(jià)體能否正確形成和同源染色體能否精確分離起著非常重要的作用[3]。

與二倍體相比，同源多倍體植物由于染色體數(shù)目加倍，減數(shù)分裂過(guò)程中要維持同源染色體的正常聯(lián)會(huì)、配對(duì)及分離，需要在調(diào)控機(jī)制方面有所改變，以適應(yīng)由于同源染色體數(shù)目增加而引起的紊亂[4]。聯(lián)會(huì)復(fù)合體SC 在細(xì)線期出現(xiàn)，偶線期逐步組裝，粗線期趨于成熟，而從雙線期開(kāi)始解體。若其出現(xiàn)異常，將直接導(dǎo)致減數(shù)分裂不能正常進(jìn)行，甚至不育[5-6]。ZYP1是擬南芥中最早鑒定的參與調(diào)控同源染色體配對(duì)與聯(lián)會(huì)的橫向細(xì)絲蛋白，若ZYP1缺失，聯(lián)會(huì)復(fù)合體SC則不能正常形成，且減數(shù)分裂前期Ⅰ推遲[7-8]。ZYP1蛋白信號(hào)出現(xiàn)在細(xì)線期，偶線期逐漸增多，粗線期達(dá)到最大，終變期幾乎消失[9-10]。在擬南芥zyp1突變體中，交叉頻率比野生型減少了70%[11]；而水稻zep1突變體中，交叉頻率較野生型有所增加[12]。在RNA干擾的大麥中，只有不到一半的同源染色體配對(duì)形成二價(jià)體，同時(shí)能觀察到許多單價(jià)體的出現(xiàn)，導(dǎo)致染色體不分離甚至不育[13-14]。因此，選取白菜二倍體、同源四倍體為研究材料，通過(guò)免疫熒光技術(shù)，分析了聯(lián)會(huì)復(fù)合體蛋白ZYP1在減數(shù)分裂過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化，并對(duì)其細(xì)胞學(xué)行為進(jìn)行了研究。將獲得的ZYP1蛋白多克隆抗體進(jìn)行免疫熒光染色，以解析多倍體植物減數(shù)分裂期同源染色體的正常配對(duì)和聯(lián)會(huì)的細(xì)胞學(xué)機(jī)制，為多倍體植物基因組的遺傳穩(wěn)定性提供細(xì)胞學(xué)理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

白菜品種Yellow sarson二倍體和同源四倍體，由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所提供，種植于河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)示范基地。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 擬南芥ZYP1蛋白多克隆抗體的制備 通過(guò)克隆擬南芥ZYP1 基因片段，構(gòu)建重組載體pET-28a(+)- ZYP1 ，優(yōu)化大腸桿菌(Escherichiacoli)誘導(dǎo)表達(dá)體系，將親和層析純化后的ZYP1融合蛋白免疫新西蘭大白兔(Oryctolaguscuniculus)，制備ZYP1蛋白的多克隆抗體，并通過(guò)Western blot和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)確定抗血清的特異性和效價(jià)。具體方法參考文獻(xiàn)[15]。

1.2.2 細(xì)胞學(xué)制片與觀察 將未開(kāi)放的白菜花蕾置于固定液(V乙醇︰V冰乙酸=3︰1)中固定5～6 h，然后用清水沖洗干凈，在解剖鏡下用解剖針將花苞剝開(kāi)挑取花藥，放入酶解液(5%的果膠酶與1%的纖維素酶)中37 ℃ 酶解30 min,然后將花藥置于干凈的玻片上，用解剖針敲碎，滴加100 μL 40%的乙酸，均勻涂布、烘干。滴加10 μL碘化丙啶(PI)染液(50 μg/mL)，蓋上玻片，鏡檢。

1.2.3 免疫熒光分析 將鏡檢過(guò)的玻片置于4%多聚甲醛中固定5 min；用PBS緩沖液洗3次，每次5 min；然后取100 μL 0.1%TritonX-100滴加于玻片上，室溫下孵育30 min；PBS緩沖液漂洗3次，每次5 min，室溫下晾干。每張玻片上滴加200 μL 5%BSA，37 ℃孵育2 h；PBS緩沖液漂洗3次，每次10 min；室溫下晾干后滴加一抗工作液4 ℃孵育過(guò)夜。次日，PBS緩沖液漂洗3次，每次10 min；滴加熒光二抗工作液，37 ℃孵育2 h。用PBS緩沖液再次重復(fù)漂洗3次，每次10 min，避光晾干后滴加PI染液(50 μg/mL)，抗熒光淬滅劑封片后觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 白菜二倍體和同源四倍體減數(shù)分裂過(guò)程觀察

圖1所示，白菜二倍體和同源四倍體減數(shù)分裂過(guò)程中，細(xì)線期時(shí)，染色體開(kāi)始凝集(圖1A和A′)，但仍以細(xì)線狀形式存在；偶線期時(shí)染色質(zhì)繼續(xù)凝集(圖1B和B′)，同源染色體開(kāi)始發(fā)生聯(lián)會(huì)配對(duì)；粗線期時(shí)已完成聯(lián)會(huì)的2條染色體互相緊靠，纏繞在一起，成為短而粗的染色體(圖1C和C′)；雙線期時(shí)同源染色體相互分開(kāi)，出現(xiàn)交叉現(xiàn)象(圖1D和E，圖1D′和E′)；終變期時(shí)，染色體開(kāi)始向核靠近，緊密凝集(圖1F和F′)；減數(shù)第Ⅰ次分裂后期，同源染色體從赤道板向兩極分離開(kāi)來(lái)(圖1G和G′)；減數(shù)第Ⅱ次分裂后期，姐妹染色單體都相互分開(kāi)，有四分體出現(xiàn)(圖1H和H′)。結(jié)果表明，白菜二倍體和同源四倍體減數(shù)分裂過(guò)程中，染色體行為基本一致，同源四倍體白菜減數(shù)分裂后期、末期均無(wú)異常，能產(chǎn)生包含正常染色體數(shù)目的配子。

A和A′：白菜二倍體和同源四倍體細(xì)線期；B和B′：白菜二倍體和同源四倍體偶線期；C和C′：白菜二倍體和同源四倍體粗線期；D和E，D′和E′：白菜二倍體和同源四倍體雙線期；F和F′：白菜二倍體和同源四倍體終變期；G和G′：白菜二倍體和同源四倍體后期Ⅰ；H和H′：白菜二倍體和同源四倍體后期Ⅱ圖1 白菜二倍體和同源四倍體減數(shù)分裂基本過(guò)程

2.2 白菜二倍體和同源四倍體中ZYP1蛋白的免疫熒光分析

本研究使用的材料為二倍體、同源四倍體白菜，用細(xì)胞懸液制片法制備處于減數(shù)分裂期細(xì)胞的玻片，依次孵育抗血清(一抗)和熒光二抗，經(jīng)充分漂洗之后用PI染液壓片觀察。紅色為PI染液染色后的染色體，綠色代表ZYP1蛋白抗體熒光信號(hào)，ZYP1蛋白抗體熒光信號(hào)在二倍體、同源四倍體白菜中的變化趨勢(shì)基本一致，綠色熒光信號(hào)均在減數(shù)分裂細(xì)線期出現(xiàn)，偶線期逐漸增多，其中,部分以線狀形式沿染色體軸排布，粗線期時(shí)達(dá)到最大，雙線期逐步減少，到終變期幾乎消失。將二倍體及同源四倍體中ZYP1蛋白抗體熒光信號(hào)進(jìn)行比較，如圖2所示，ZYP1蛋白抗體綠色熒光信號(hào)在細(xì)線期開(kāi)始出現(xiàn)，此時(shí)在二倍體及同源四倍體中均較少；到偶線期時(shí),二倍體及同源四倍體中ZYP1蛋白熒光信號(hào)均有所增加，但同源四倍體增加更多，比相對(duì)應(yīng)的二倍體中含量多；粗線期時(shí),二倍體及同源四倍體中ZYP1蛋白抗體熒光信號(hào)含量均達(dá)到最高水平，但同源四倍體中的含量仍比二倍體中的多；雙線期時(shí)，信號(hào)均開(kāi)始減少，直至消失。同源四倍體中ZYP1蛋白抗體熒光信號(hào)的增多代表ZYP1蛋白表達(dá)量的增加，由于染色體加倍，聯(lián)會(huì)配對(duì)頻率提高，同源四倍體減數(shù)分裂時(shí)期對(duì)ZYP1蛋白的需求也相應(yīng)提高，因此，ZYP1蛋白在同源四倍體減數(shù)分裂時(shí)期聯(lián)會(huì)配對(duì)時(shí)的表達(dá)量更高。

A和 A′：PI染液染色后處于細(xì)線期、偶線期、粗線期、雙線期的二倍體白菜和同源四倍體白菜細(xì)胞；B和B′：免疫熒光染色后處于細(xì)線期、偶線期、粗線期、雙線期的二倍體白菜細(xì)胞和同源四倍體白菜細(xì)胞中的ZYP1蛋白；C和C′：分別為A、B疊加和A′、B′疊加后的細(xì)胞圖2 白菜二倍體和同源四倍體減數(shù)分裂前期Ⅰ過(guò)程中ZYP1蛋白動(dòng)態(tài)觀察

3 結(jié)論與討論

有關(guān)聯(lián)會(huì)復(fù)合體蛋白ZYP1在減數(shù)分裂中的表達(dá)時(shí)期及其作用方面的研究已經(jīng)很多[16-17]，本試驗(yàn)將同源多倍體中ZYP1的分子細(xì)胞學(xué)行為與相對(duì)應(yīng)的二倍體進(jìn)行比較，這為探究多倍體聯(lián)會(huì)配對(duì)調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。本研究通過(guò)觀察二倍體、同源四倍體白菜在減數(shù)分裂不同時(shí)期染色體的一些變化特征發(fā)現(xiàn)，同源四倍體細(xì)胞中染色體在加倍后減數(shù)分裂仍能正常進(jìn)行，整個(gè)過(guò)程與二倍體材料染色體行為變化一致，但前期Ⅰ聯(lián)會(huì)配對(duì)頻率明顯提高。而ZYP1聯(lián)會(huì)配對(duì)中起著一定的調(diào)控作用，多倍體中ZYP1表達(dá)量也會(huì)發(fā)生相應(yīng)的變化，因此，對(duì)多倍體中ZYP1蛋白的研究有助于探索多倍體聯(lián)會(huì)配對(duì)頻率提高的內(nèi)在機(jī)制。

同源多倍體由于染色體加倍，與二倍體相比要有更復(fù)雜的聯(lián)會(huì)方式，聯(lián)會(huì)頻率也會(huì)提高，要維持多倍體中同源染色體穩(wěn)定的聯(lián)會(huì)配對(duì)，需要一定的調(diào)控機(jī)制，而ZYP1蛋白直接參與聯(lián)會(huì)配對(duì)這一活動(dòng)。將二倍體與同源四倍體白菜減數(shù)分裂前期Ⅰ各時(shí)期的熒光信號(hào)進(jìn)行比較，直接清楚地了解減數(shù)分裂前期多倍體中ZYP1蛋白的表達(dá)量，并且結(jié)合ZYP1蛋白的功能，從而在細(xì)胞水平上闡明了同源四倍體白菜中ZYP1蛋白表達(dá)量提高的機(jī)制，有助于鞏固同源染色體的聯(lián)會(huì)和配對(duì)過(guò)程，以保證多倍體植物減數(shù)分裂過(guò)程正常，產(chǎn)生有功能的雌雄配子，保證多倍體植物正常繁衍。

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Cytological Analysis of Synaptonemal Complex Protein ZYP1 during Meiosis in Autopolyploid Brassica rapa

WEI Zhenzhen1,WU Ruihua1,WEI Xiaochun2,YANG Yan1,TIAN Baoming1,WEI Fang1*,SHI Gongyao1,CAO Gangqiang1,ZHANG Xiaowei2

( 1.School of Life Sciences,Zhengzhou University,Zhengzhou 450001,China; 2.Institute of Horticulture,Henan Academy of Agricultural Sciences,Zhengzhou 450002,China)

To understand the cytological mechanism of pairing and synapsis of homologous chromosomes in polyploid plants,the synaptonemal complex protein ZYP1 was cytologically analysed using immunostaining during meiotic prophase Ⅰ in autopolyploidBrassicarapain comparison with diploid counterparts.The results showed that,compared with diploids,autopolyploids showed a regular meiosis course including normal pairing,synapsis and separation of homologous chromosomes,and a similar dynamic behavior of ZYP1 protein.However,the fluorescence signal of ZYP1 revealed by their specific antibody was significantly enhanced in autopolyploids in contrast with diploids.Therefore,the present study indicated that autopolyploids probably increased the expression level of ZYP1 protein to coordinate pairing and synapsis of homologous chromosomes,to ensure a normal meiosis behavior in polyploid plants.

meiosis; synaptonemal complex; ZYP1; autoteraploid;Brassicarapa

2016-10-24

NSFC-河南人才培養(yǎng)聯(lián)合基金項(xiàng)目(U1204308)；河南省教育廳高等學(xué)校重點(diǎn)科研項(xiàng)目(13A180437)

韋珍珍(1992-)，女，山西長(zhǎng)治人，在讀碩士研究生，研究方向：植物細(xì)胞遺傳學(xué)。E-mail：1114242391@qq.com

*通訊作者：位 芳(1981-)，男，河南項(xiàng)城人，副教授，博士，主要從事植物分子細(xì)胞遺傳學(xué)方面的研究。 E-mail：fangwei@zzu.edu.cn

S634

A

1004-3268(2017)02-0078-05