方麗媛,李代宗,肖勤

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)海洋學(xué)院，河北 滄州061100)

貝類(lèi)毒素及其檢測(cè)方法研究進(jìn)展

方麗媛,李代宗,肖勤*

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)海洋學(xué)院，河北 滄州061100)

貝類(lèi)所含的毒素是由其攝食的微藻或菌類(lèi)所產(chǎn)生的，這些毒素在貝類(lèi)的體內(nèi)積聚，通過(guò)被人類(lèi)攝取而在人體中釋放，使人體產(chǎn)生相應(yīng)的食源中毒癥狀，嚴(yán)重威脅著人類(lèi)健康。本文綜述了貝類(lèi)毒素及種類(lèi)，并針對(duì)其近年來(lái)研發(fā)的小鼠生物測(cè)定法、高效液相色譜法、免疫學(xué)測(cè)定法、毛細(xì)電泳法、生物傳感器法等檢測(cè)方法進(jìn)行了詳細(xì)介紹，分析了各方法的原理、優(yōu)缺點(diǎn)和適用范圍等，最后對(duì)貝類(lèi)毒素檢測(cè)方法的未來(lái)發(fā)展趨勢(shì)進(jìn)行了展望。[中國(guó)漁業(yè)質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn)，2017,7(1):41-49]

貝類(lèi)毒素；檢測(cè)方法；高效液相色譜法；酶聯(lián)免疫法；生物傳感器

貝類(lèi)毒素是由海洋中有毒藻類(lèi)產(chǎn)生的天然有機(jī)物，貝類(lèi)濾食這些有毒微藻后，經(jīng)過(guò)生物累積和放大轉(zhuǎn)化為貝類(lèi)毒素。海洋藻毒素已經(jīng)成為影響貝類(lèi)水產(chǎn)品食用安全的重要污染物之一。貝類(lèi)毒素一般積存于貝類(lèi)(蛤類(lèi)、螺類(lèi)、鮑類(lèi))的肝臟或消化腺中，尤其雙殼貝類(lèi)如牡蠣、扇貝和貽貝中含有貝類(lèi)毒素的風(fēng)險(xiǎn)更高。這些毒素在貝類(lèi)體內(nèi)積聚，通過(guò)被人類(lèi)攝食而在人體中得以釋放，使人體產(chǎn)生相應(yīng)的食源中毒癥狀。據(jù)報(bào)道,2012年10月廣東省深圳市某酒店發(fā)生一起食用響螺(Neptuneacumingicrosse)導(dǎo)致的食物中毒事件，中毒人數(shù)18人，患者主要癥狀有腹痛、腹瀉、惡心、嘔吐、發(fā)熱。2016年5月，河北省秦皇島市某醫(yī)療機(jī)構(gòu)先后接診9例因食用海虹(Mytilusedulis)引起食物中毒的病例，病例初期癥狀為口唇、手腳麻木，后期伴有惡心嘔吐、頭暈等癥狀，重癥患者呼吸困難、四肢無(wú)力、伴有昏迷[1]。2016年6月新西蘭初級(jí)產(chǎn)業(yè)部(MPI)發(fā)布貝類(lèi)毒素風(fēng)險(xiǎn)警告，建議民眾勿食用旺阿帕勞阿半島(Whangaparaoa peninsula)南部海域附近貝類(lèi)，因?qū)υ摵Ｓ蜇愵?lèi)的取樣檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，其麻痹性貝類(lèi)毒素(paralytic shellfish poisoning, PSP)超出安全限量，達(dá)1.0×10-6。貝類(lèi)毒素引起的食物中毒反應(yīng)快、毒性大且無(wú)適宜解毒劑，因此引起了人們特別是食品安全部門(mén)的極大關(guān)注，對(duì)這些有害毒素的檢測(cè)方法也逐漸受到廣大專(zhuān)家的重視。對(duì)于貝類(lèi)毒素的檢測(cè)方法有很多，主要包括小鼠生物測(cè)定法、高效液相色譜法、免疫學(xué)測(cè)定法、毛細(xì)電泳法、生物傳感器法等。貝類(lèi)毒素的檢測(cè)在目前乃至今后相當(dāng)長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)，都將是國(guó)內(nèi)外共同關(guān)注的熱點(diǎn)。

1 貝類(lèi)毒素分類(lèi)及簡(jiǎn)介

國(guó)際上，由聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織(FAO)、世界衛(wèi)生組織(WHO)和政府間海洋學(xué)委員會(huì)(IOC)共同組建的雙殼類(lèi)軟體生物毒素工作組于2004年3月在關(guān)于貝類(lèi)生物毒素會(huì)議中將貝類(lèi)毒素按照化學(xué)結(jié)構(gòu)分為8組，包括石房蛤毒素(saxitoxin, STX)組、大田軟海綿酸(okadaic acid, OA)毒素組、氮雜螺環(huán)酸(azaspiracid, AZAs)毒素組、軟骨藻酸(domoic acid, DA)毒素組、環(huán)亞胺類(lèi)(cyclic imines, CI)毒素組、短裸甲藻毒素(brevetoxin, BTX)組、扇貝毒素(pectenotoxin, PTXs)組和蝦夷扇貝毒素(yessotoxin, YTXs)組。

1.1 石房蛤毒素組

STX組屬于氨基甲酸酯類(lèi)化合物(carbamate toxins)。它是由石房蛤(Saxidomusgiganteus)濾食亞歷山大藻(Alexandriumsp.)和裸甲藻(Gymnodiniumsp.)后在體內(nèi)蓄積的一種毒素[2]。過(guò)去人們一直認(rèn)為麻痹性貝類(lèi)毒素的致毒機(jī)理主要是將細(xì)胞內(nèi)鈉離子通道阻斷，使神經(jīng)系統(tǒng)傳導(dǎo)發(fā)生障礙，從而產(chǎn)生麻痹作用。然而最近發(fā)現(xiàn)，STX還可以與鈣和鉀離子通道蛋白、神經(jīng)元型一氧化氮合酶、STX代謝酶等轉(zhuǎn)鐵蛋白家族結(jié)合，從而影響神經(jīng)傳導(dǎo)[3]。其毒性非常強(qiáng)，0.5 mg 即可使人斃命，在國(guó)際條約中已被列為化學(xué)武器。

1.2 大田軟海綿酸毒素組

OA毒素組是聚醚類(lèi)化合物，主要包括OA、鰭藻毒素(dinophysistoxin, DTX)及其C7位羥基與脂肪酸發(fā)生?；磻?yīng)生成的7-O-?；セ?7-O-acyl esters, 統(tǒng)稱(chēng)為 DTX3)[4]，常見(jiàn)于牡蠣、淡菜、日月貝等貝類(lèi)。其主要致毒機(jī)理是抑制絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶(PPs)的活性。此外，OA毒素組還具有促腫瘤作用，且具有一定的遺傳毒性，易形成DNA加合物[5]。

1.3 氮雜螺環(huán)酸毒素組

AZAs是最早在歐洲發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)聚醚類(lèi)毒素，目前已確定其產(chǎn)毒甲藻主要有具刺環(huán)胺藻(Azadiniumspinosum)、腹孔環(huán)胺藻(Azadiniumpoporum)和肥胖環(huán)胺藻(Azadiniumobesum)[6]。研究表明，AZAs毒素的中毒癥狀與腹瀉性貝毒(diarrhetic shellfish poisoning, DSP)引起的癥狀非常相似，為惡心、嘔吐、嚴(yán)重腹瀉和胃腸部痙攣等[7]。AZAs毒性高于OA毒素[8]，且十分穩(wěn)定，常規(guī)烹飪和加工處理方法無(wú)法將其去除。至今未發(fā)現(xiàn)有效治療方法和藥物。其致毒機(jī)理目前沒(méi)有明確說(shuō)法，但有研究發(fā)現(xiàn)AZAs毒素不會(huì)顯著改變鈉離子或鈣離子電壓門(mén)控通道的流量[9]，即此毒素不通過(guò)細(xì)胞鈉或鈣離子通道影響神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。

1.4 軟骨藻酸毒素組

DA毒素組主要來(lái)自于海洋硅藻(Diatoms)中的擬菱形藻(Pseudo-nitzschia)，如尖刺擬菱形藻(Pseudo-nitzschiapungens)、多列擬菱形藻(Pseudo-nitzschiamultiseries)和擬柔弱擬菱形藻(Pseudo-nitzschiapseudodelicatissima)等。它具有強(qiáng)烈的神經(jīng)毒性作用，可以導(dǎo)致短期記憶功能的長(zhǎng)久性損害。DA及其異構(gòu)體iso-domoic acids A-F等可以作為一種研究神經(jīng)退化性疾病的工具[10]。

1.5 環(huán)亞胺類(lèi)毒素組

CI毒素組具有相同的大環(huán)和生物活性基團(tuán)結(jié)構(gòu)。其致毒機(jī)理較為獨(dú)特，可在中樞與外周神經(jīng)系統(tǒng)包括神經(jīng)肌肉接頭處阻斷乙酰膽堿受體功能[11]。目前，CI毒素組中研究最多的是螺環(huán)內(nèi)酯毒素(spirolides, SPX)。這類(lèi)毒素雖然也具有神經(jīng)性毒害作用，但大部分毒性較低，對(duì)人類(lèi)危害不大，故至今還未制定相關(guān)的限量標(biāo)準(zhǔn)[5]。

1.6 短裸甲藻毒素組

BTX組是耐熱的高度脂溶性毒素，結(jié)構(gòu)為多環(huán)聚醚化合物。它是貝類(lèi)毒素中唯一的可以通過(guò)吸入導(dǎo)致神經(jīng)性中毒的毒素。其毒理是作用于鈉通道，引起鈉離子內(nèi)流，導(dǎo)致肌肉和神經(jīng)細(xì)胞去極化[12]。BTX毒素還可致使染色體體外斷裂，具有遺傳毒性，但現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)太少，不足以建立急性參考劑量[13]，有待進(jìn)一步研究。

1.7 扇貝毒素組和蝦夷扇貝毒素組

PTXs組和YTXs組是從傳統(tǒng)分類(lèi)的腹瀉性貝毒類(lèi)型中被劃分出來(lái)的，各自單獨(dú)作為一類(lèi)毒素存在。PTXs毒素常伴隨OA毒素中毒事件一起出現(xiàn)，但關(guān)于其致毒機(jī)理目前尚不明確[4]。YTXs毒素不同于OA毒素組，不會(huì)抑制絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶(PPs)的活性。因其毒性相對(duì)較弱，迄今為止還未發(fā)現(xiàn)有相關(guān)中毒事件的報(bào)道。

關(guān)于這些毒素組的分布，OA毒素組幾乎遍布全球近岸海域，CI和YTXs毒素組在世界多個(gè)地區(qū)貝類(lèi)或微藻中發(fā)現(xiàn)。AZAs、BTX和PTXs毒素組近年來(lái)也逐步擴(kuò)散，分布范圍越來(lái)越廣[5]，但AZAs毒素組尚未在歐洲發(fā)現(xiàn)[14]。除STX和DA毒素組外，其他6組均為脂溶性貝毒(lipophilic shellfish toxins, LST)。目前，中國(guó)沿海分布的產(chǎn)毒藻或染毒貝類(lèi)樣品中曾檢出的LST主要包括OA、PTXs、YTXs、AZAs毒素組以及CI組中的Gymnodimine(GYM)毒素，且OA、PTXs和YTXs毒素組在貝類(lèi)中的檢出率較高[4]。

另外，因人體產(chǎn)生食源中毒癥狀不同，可將貝類(lèi)毒素分為麻痹性貝類(lèi)毒素(paralytic shellfish poisoning, PSP)、失憶性貝類(lèi)毒素(amnesic shellfish poisoning, ASP)、神經(jīng)性貝類(lèi)毒素(neurotoxic shellfish poisoning, NSP)和腹瀉性貝類(lèi)毒素(diarrhetic shellfish poisoning, DSP)四大類(lèi)(表1)。

2 貝類(lèi)毒素檢測(cè)方法

有關(guān)貝類(lèi)毒素的檢測(cè)方法主要有小鼠生物測(cè)定法、高效液相色譜法(高效液相色譜-熒光檢測(cè)器法、高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法)、免疫測(cè)定法(酶聯(lián)免疫法、免疫層析法)、毛細(xì)電泳法以及生物傳感器法等。

2.1 小鼠生物測(cè)定法

小鼠生物測(cè)定(mouse bioassay, MBA)法是一種傳統(tǒng)的貝類(lèi)毒素檢測(cè)方法，可用于所有貝類(lèi)毒素的檢測(cè)。該方法的原理主要是使用適宜的溶劑將樣品中毒素提取出來(lái)，稀釋后以腹腔注射的方式使小鼠染毒，通過(guò)觀(guān)察小鼠的中毒癥狀以及平均致死時(shí)間來(lái)定性、定量毒素毒性大小。該方法已被列入美國(guó)分析化學(xué)協(xié)會(huì)(Association Official Analytical Chemists, AOAC)標(biāo)準(zhǔn)方法，是國(guó)際海產(chǎn)品貿(mào)易中貝類(lèi)毒素常用的測(cè)定方法。

表1 貝類(lèi)毒素分類(lèi)與簡(jiǎn)介

Harwood等[17]應(yīng)用此法檢測(cè)了塔斯馬尼亞鮑(Abalone)中的麻痹性貝毒，包括罕見(jiàn)的脫氧脫氨甲?；?lèi)毒素(deoxydecarbamoyl STX, doSTX)，結(jié)果顯示通過(guò)腹腔注射doSTX的小鼠半數(shù)致死量(LD50)為1 069 nmol/kg(95%置信區(qū)間為983 ～ 1 100 nmol/kg)，表明doSTX毒性大約比STX低40倍。Pérez-Gómez等[18]利用原代培養(yǎng)的鼠小腦神經(jīng)元研究YTXs毒素對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元存活和功能的影響，發(fā)現(xiàn)其主要對(duì)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)有明顯的毒性作用。對(duì)于YTXs來(lái)說(shuō)，神經(jīng)組織是一個(gè)脆弱的生物靶。

小鼠生物測(cè)定法作為幾種檢測(cè)方法中運(yùn)用范圍最廣的檢測(cè)方法，不需要專(zhuān)門(mén)的檢測(cè)儀器，可以測(cè)定出貝類(lèi)樣品的綜合毒性，但在多種毒素同時(shí)存在的情況下容易使定量結(jié)果偏差較大，或因高溫、金屬離子、不飽和脂肪酸的存在等情況下引起假陽(yáng)性結(jié)果[6,19]。由于小鼠的個(gè)體大小以及小鼠個(gè)體情況的不同，容易造成靈敏度低，準(zhǔn)確性差。另有實(shí)驗(yàn)表明，MBA法測(cè)量結(jié)果與溫度變化也有關(guān)[19]。此外，小鼠生物法操作過(guò)程相對(duì)較復(fù)雜，檢測(cè)時(shí)間偏長(zhǎng)，并且只能確定貝類(lèi)中毒素的有無(wú)及是否超標(biāo)，不能準(zhǔn)確地確定貝類(lèi)中所含有的毒素是哪些類(lèi)型。因此，需要探究其他檢測(cè)方法。

2.2 高效液相色譜法

近年來(lái)，高效液相色譜(HPLC)法在測(cè)定貝類(lèi)毒素上發(fā)展很快。根據(jù)歐盟(EC)指令No 15/2011規(guī)定，自2015年起，HPLC法開(kāi)始取代小鼠生物測(cè)定法，成為檢測(cè)6類(lèi)脂溶性貝類(lèi)毒素的官方標(biāo)準(zhǔn)方法。按傳統(tǒng)分類(lèi)，HPLC法則主要應(yīng)用于PSP、DSP和ASP的檢測(cè)上[19]。與其他方法相比，HPLC法檢測(cè)時(shí)間相對(duì)較短，靈敏度高，檢出限低，并且可以完成大批量的檢測(cè)任務(wù)。它可以定量測(cè)定貝類(lèi)毒素，但此方法需要專(zhuān)門(mén)的檢測(cè)儀器，成本較高，需要較強(qiáng)的操作能力。

2.2.1 高效液相色譜-熒光檢測(cè)器法

高效液相色譜-熒光檢測(cè)器(HPLC - FLD)法目前是國(guó)內(nèi)外檢測(cè)PSP和DSP的常用方法。其主要原理是用適宜溶劑提取待測(cè)物質(zhì)，除雜后加入衍生化試劑，通過(guò)衍生作用使待測(cè)化合物在一定波長(zhǎng)的激發(fā)光照射下產(chǎn)生熒光，利用熒光強(qiáng)度計(jì)算含量，以便進(jìn)一步進(jìn)行定性、定量研究[15]。此方法的靈敏度非常高，用時(shí)短，對(duì)儀器的穩(wěn)定性依賴(lài)小，并且選擇性好。但此法適用范圍有一定的局限性，只適用于有熒光基團(tuán)和衍生化之后有熒光基團(tuán)的化合物，定量分析時(shí)線(xiàn)性范圍較窄，并且對(duì)檢測(cè)結(jié)構(gòu)相似、保留時(shí)間基本相似的貝類(lèi)毒素檢測(cè)準(zhǔn)確性較差。

張曉玲等[20]采用3-(2-呋喃甲?；?-喹啉-2-羰醛(FQ)為熒光衍生試劑，利用超高效液相色譜(UPLC)和柱前衍生熒光檢測(cè)技術(shù)，建立了貝類(lèi)中3種高毒性PSP毒素成分(STX、GTX1及neoSTX)的檢測(cè)方法。結(jié)果表明，在優(yōu)化后的最佳實(shí)驗(yàn)條件下，3種PSP毒素成分線(xiàn)性方程的相關(guān)系數(shù)(r)均大于0.998，檢測(cè)限為7～14 μg/kg，回收率為82%～92%，RSD值小于5.2%，說(shuō)明此法可用于STX、GTX1及neoSTX的日常分析檢測(cè)。Cho等[21]采用高效液相色譜法，通過(guò)柱后熒光衍生，分析了單個(gè)日本塔瑪亞歷山大藻(Alexandriumtamarense)中麻痹性貝毒C-toxin 2(C2)含量。優(yōu)化后，當(dāng)信噪比(S/N)為2時(shí)，可最低檢測(cè)出1 fmol的C2毒素，檢測(cè)靈敏度可達(dá)單細(xì)胞藻類(lèi)的水平，也證實(shí)了該方法靈敏性高，具有可靠性。

目前國(guó)標(biāo)(GB/T 23215—2008)中規(guī)定，貝類(lèi)中多種麻痹性貝類(lèi)毒素含量的HPLC - FLD法測(cè)定方法的檢出限：STX為14.5 μg/kg；dcSTX為12.5 μg/kg；neoSTX為15.7 μg/kg；GTX1為50.7 μg/kg；GTX2為19.6 μg/kg；GTX3為6.5 μg/kg；GTX4為16.7 μg/kg；dcGTX2為17.3 μg/kg；dcGTX3為4.8 μg/kg；B1為31.9 μg/kg；合麻痹性貝類(lèi)毒素總量(STXeq)為125 μg/kg[22]。

2.2.2 高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法

高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC - MS/MS)法目前已被廣泛應(yīng)用于貝類(lèi)毒素檢測(cè)工作中。劉仁沿等[23]通過(guò)HPLC - MS/MS法檢測(cè)了34種沿海貝類(lèi)中脂溶性貝類(lèi)毒素分布及含量，其中扇貝毒素PTX-2Sa檢出率最高，為44%；環(huán)亞胺類(lèi)毒素中的GYM毒素次之，為35.3%。于慧娟等[24]用此法檢測(cè)了10種麻痹性貝類(lèi)毒素，平均回收率為72.3%～91.1%，STX、dcSTX和neoSTX定量限為100 μg/kg，GTX1 - GTX5、dcGTX2和dcGTX3定量限為50.0 μg/kg。陳劍剛等[25]也用同樣方法測(cè)定了貝類(lèi)產(chǎn)品中石房蛤毒素(STX)、新石房蛤毒素(neoSTX)、膝溝澡毒素(GTX1&4)、脫氨甲?；?lèi)毒素(包括dcSTX、dcneoSTX和dcGTX2&3) 8種麻痹性貝類(lèi)毒素。結(jié)果顯示8種麻痹性貝類(lèi)毒素在各自相應(yīng)濃度范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好，檢測(cè)限為10～50 μg/kg，平均加標(biāo)回收率為75.5%～103.0%。吳振興等[26]用HPLC-MS/MS法對(duì)PSP的13種代表性化合物進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示，這些化合物在各自的濃度范圍內(nèi)線(xiàn)性良好，回收率為71.2%～97.5%，檢測(cè)低限范圍為5.2～13.4 μg/kg。Cho等[27]利用親水作用的液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用(HILIC - LC - MS/MS)法檢測(cè)了塔瑪亞歷山大藻中的PSP，發(fā)現(xiàn)此種藻含有罕見(jiàn)的12β- deoxydecarbamoyl saxitoxin毒素，說(shuō)明該方法具有極高的靈敏性。Mattarozzi等[28]經(jīng)過(guò)微萃取及純化等一系列步驟處理樣品后，也用 HILIC檢測(cè)了貽貝中的PSP毒素，測(cè)得檢測(cè)限和定量限分別為 3～159 μg/kg和 7 ～ 436 μg/kg，適用于貝類(lèi)產(chǎn)品中麻痹性貝類(lèi)毒素的定量分析。另外，方曉明等[29]用利用液相色譜-四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜(LC/Q - TOF - MS)檢測(cè)了貝類(lèi)組織中的DSP，對(duì)其中的OA毒素進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示，LOQ為 0.1 μg/g，加標(biāo)樣品的平均回收率為89%～93%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為9%～10%。這說(shuō)明此法具有高分辨率，能進(jìn)行精確測(cè)定而不降低靈敏度。

高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法是一種可以定性、定量、分離范圍很廣的快速分離檢測(cè)方法，具有很高的專(zhuān)屬性、準(zhǔn)確性、靈敏性。其對(duì)AZA毒素中AZA 1的檢測(cè)靈敏度可達(dá)MBA法的80 000倍[30]。但此法也存在一定局限性，如所用儀器昂貴；質(zhì)譜離子源有記憶效應(yīng)且在異構(gòu)體、立體化學(xué)方面區(qū)分能力差；需嚴(yán)格控制操作條件，對(duì)操作人員水平要求較高等。

2.3 免疫測(cè)定法

免疫學(xué)方法是以抗原-抗體特異性反應(yīng)為基礎(chǔ)的檢測(cè)方法。目前已有多種免疫診斷試劑盒和試紙條用于分析不同的貝類(lèi)毒素。

2.3.1 酶聯(lián)免疫法(ELISA法)

黃玉柳等[31]用ELISA快速檢測(cè)試劑盒，測(cè)定了牡蠣及文蛤中的PSP，全部實(shí)驗(yàn)過(guò)程在2 h內(nèi)完成，靈敏度為 0.015 ng/g。與小鼠生物測(cè)定法相比，其檢測(cè)限更低，為 0.02 ng/g。此外，Kim等[32]研究設(shè)計(jì)了一種液相芯片實(shí)驗(yàn)室(SLP-LOC)來(lái)測(cè)定STX(圖1)，由G蛋白耦聯(lián)的磁性粒子作為固相載體，采用競(jìng)爭(zhēng)免疫反應(yīng)方式，通過(guò)包被有STX抗體的磁性微粒子競(jìng)爭(zhēng)性地捕獲樣品中的STX 或HRP標(biāo)記的STX標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行測(cè)定。SLP - LOC可以省略復(fù)雜的液體處理步驟，這或許代表了酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)的一種嶄新應(yīng)用方法。

圖1 SLP - LOC原理示意圖[32]Fig.1 Schematic representation of the principleof the SLP - LOC[32]

ELISA法檢測(cè)時(shí)間短并且使用方便，但免疫檢測(cè)只能根據(jù)待測(cè)物結(jié)構(gòu)表位進(jìn)行測(cè)定，而非針對(duì)其結(jié)構(gòu)，因此其類(lèi)似物有干擾作用，會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性或?qū)Χ拘怨烙?jì)的不準(zhǔn)確[15]。因貝類(lèi)毒素種類(lèi)繁多，目前的商品化試劑盒檢測(cè)貝類(lèi)毒素種類(lèi)較少，故需要對(duì)很多貝類(lèi)毒素的免疫學(xué)方法進(jìn)行開(kāi)發(fā)。

2.3.2 免疫層析法

Kim等[33]將熒光素標(biāo)記的微囊藻毒素- LR抗體固定在硝酸纖維素膜條帶上，通過(guò)熒光強(qiáng)度來(lái)定量測(cè)定微囊藻毒素-LR的含量，最快在15 min內(nèi)即可得出結(jié)果：微囊藻毒素- LR濃度范圍在125～2 000 pg/mL，具有良好的線(xiàn)性關(guān)系，檢測(cè)限為95.38 pg/mL。與固定抗體相比，若將抗原包埋固定后，測(cè)得其檢測(cè)下限僅為47.23 μg/L，檢測(cè)結(jié)果不理想。另Pyo等[34-35]利用膠體金免疫層析法快速檢測(cè)藍(lán)藻毒素中的微囊藻毒素- LR，其費(fèi)用較低，為ELISA法的10%，但不能用于定量分析。關(guān)于免疫膠體金的定量檢測(cè)也有學(xué)者進(jìn)行了研究，劉仁沿等[36]用膠體金標(biāo)記軟海綿酸單克隆抗體，建立了快速檢測(cè)軟海綿酸的免疫層析試紙條方法，其檢出限為12 ng/mL；高利利等[37]用膠體金免疫層析試紙條檢測(cè)貝類(lèi)食品中DA的含量，15 min內(nèi)完成檢測(cè)，靈敏度為20 ng/mL。可見(jiàn)膠體金免疫層析技術(shù)是一種簡(jiǎn)便、快速的檢測(cè)手段。

免疫層析法操作簡(jiǎn)便快速，不需特殊儀器設(shè)備，適合現(xiàn)場(chǎng)實(shí)時(shí)檢測(cè)和批量檢測(cè)。但需要進(jìn)一步提高其檢測(cè)靈敏度和可重復(fù)性。定量和多元檢測(cè)是免疫膠體金技術(shù)未來(lái)的發(fā)展方向之一[38]。

2.4 毛細(xì)電泳法

毛細(xì)電泳(capillary electrophoresis, CE)法主要是根據(jù)各種毒素分子所帶電荷量不同將其分離進(jìn)行檢測(cè)，主要有毛細(xì)管電泳-紫外(CE - UV)檢測(cè)法和毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜(CE - MS)法。李大志等[16]在參考現(xiàn)有CE分離分析方法的基礎(chǔ)上，通過(guò)對(duì)分析條件的優(yōu)化，將軟骨藻酸分離的線(xiàn)性范圍擴(kuò)大到0.2 ～ 50.0 mg/L，方法檢出限為0.063 mg/L (S/N>3)。陳曉燕等[39]以磷酸氫二鈉-檸檬酸為運(yùn)行緩沖液，用高效毛細(xì)管電泳法對(duì)GTX2和GTX3相關(guān)樣品進(jìn)行了快速而又靈敏的定量分析，經(jīng)過(guò)高壓液相法分離后再用CE法得到電泳圖，圖譜顯示，除GTX2和GTX3吸收峰外，還存在至少兩個(gè)雜峰，故其分辨率較傳統(tǒng)的高壓液相法要高出許多。

不過(guò)此方法靈敏度相對(duì)不高，僅為1 mg/L[40]。Li等[41]為提高檢測(cè)靈敏度，將微囊藻毒素轉(zhuǎn)換后用熒光素5 -異硫氰酸酯(FITC)衍生，然后將FITC標(biāo)記的微囊藻毒素直接注入激光誘導(dǎo)熒光監(jiān)測(cè)器(laser-induced fluorescence, LIF)對(duì)微囊藻毒素進(jìn)行示蹤分離。不過(guò)此法目前尚不成熟，但若經(jīng)過(guò)不斷的改善，有望成為操作簡(jiǎn)單、快速的各貝類(lèi)毒素檢測(cè)方法。

2.5 生物傳感器法

目前大多數(shù)用于貝毒檢測(cè)的生物傳感器是以免疫學(xué)為基礎(chǔ)的[42]。在DSP檢測(cè)中，Tang等[43]在PEI耦合方法下，使用石英晶體微天平(QCM)對(duì)晶體表面的活化培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化，對(duì)BSA稀釋因子影響共軛體系和晶體頻率上抗體數(shù)量進(jìn)行研究。用這種方法可使傳感器具有良好的存儲(chǔ)壽命(38 d)。然而，檢測(cè)限(1.9 μg/mL)和傳感器的靈敏度并不理想。若用BSA抗體水凝膠可以使該裝置的性能顯著提高，初步結(jié)果顯示，檢測(cè)限和靈敏度可分別提高524倍和80倍。Berre等[44]通過(guò)生物傳感器法檢測(cè)DSP，利用高親和力抗體檢測(cè)了OA毒素及其衍生物、DTX-1和DTX-2等，檢測(cè)限為22.4 ng/mL，變異系數(shù)(CV)<9.3%，證實(shí)此法簡(jiǎn)便有效，有較高的重現(xiàn)性。Zou等[45]用細(xì)胞阻抗傳感器(cell-based impedance biosensor, CIB)檢測(cè)OA毒素，傳感器芯片模式圖及細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)如圖2所示。HeLa和HepG2兩種細(xì)胞檢測(cè)限值分別為10.2和3.3 g/L，均低于常規(guī)值(21.2和9.8 g/L)，說(shuō)明CIB技術(shù)有較大的應(yīng)用潛力。

圖2 傳感器芯片的電極結(jié)構(gòu)圖(A)和長(zhǎng)期(0—60 h)(B)及短期(0—400 s)(C)典型細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)[45]Fig.2 The electrode structures of sensor chip (A)and the typical cell growth curve in long term(0—60 h)(B) and short term (0—400 s)(C) [45]

Meneely等[46]利用熒光平面波導(dǎo)生物傳感器檢測(cè)PSP(圖3)，檢測(cè)限與檢測(cè)容量分別為12和20 pg/mL，CV為11.3%，平均回收率為106%，這種創(chuàng)新性的平面波導(dǎo)器件具有快速靈敏，便攜易用的特點(diǎn)，15 min內(nèi)可完成檢測(cè)。

圖3 陣列布局設(shè)計(jì)示意圖和陰性(A)和陽(yáng)性(B)圖像[46]Fig.3 Schematic of the array layout design and thenegative (A) and positive (B) images[46]

與高效液相色譜法相比，生物傳感器法適用于貝類(lèi)毒素的快速檢測(cè)，對(duì)儀器操作人員的專(zhuān)業(yè)程度沒(méi)有較高要求，并且其專(zhuān)一性也很強(qiáng)，只對(duì)特定的底物起反應(yīng)，不受顏色與濁度的影響。目前生物傳感器在貝毒檢測(cè)方面的應(yīng)用還只是處于實(shí)驗(yàn)室階段[47]，由于生物活性單元具有不穩(wěn)定性和易變性等缺點(diǎn)，故生物傳感器的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性較差[48]。

2.6 其他方法

Beach等[49]用電噴霧電離串聯(lián)質(zhì)譜(LAESI - MS/MS)法直接檢測(cè)貽貝組織勻漿樣品中的DA，該方法的最大優(yōu)勢(shì)是無(wú)需進(jìn)行萃取、凈化等樣品前處理步驟，分析速度極快，只需10 s。Mattarozzi等[50]采用電噴霧解吸電離高分辨質(zhì)譜(DESI - HRMS)對(duì)蛤蜊(Ruditapesphilippinarum)中麻痹性貝類(lèi)毒素進(jìn)行了篩查，此法操作簡(jiǎn)便，安全有效，可用于高通量分析。Müller等[51]利用修飾有4-氨基苯硫酚的納米銀顆粒作為標(biāo)簽，通過(guò)表面增強(qiáng)拉曼譜(surface - enhanced raman scattering, SERS)對(duì)海水中的DA進(jìn)行了檢測(cè)，其檢測(cè)最低濃度可達(dá)3.3×10-11。據(jù)統(tǒng)計(jì)，自2009年起，經(jīng)過(guò)不斷改良與測(cè)試，此法CV由最初的39 %降低至22 %，逐漸受到越來(lái)越多人的認(rèn)可[52]。另外，還有氣相色譜(GC)法、細(xì)胞毒性檢測(cè)法(又稱(chēng)組織培養(yǎng)分析法)[6,53]等，但應(yīng)用并不廣泛。酶活性抑制檢測(cè)技術(shù)、分子探針技術(shù)、熒光原位雜交技術(shù)、重組質(zhì)粒技術(shù)等也在貝類(lèi)毒素檢測(cè)的過(guò)程中發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用[4]。

3 結(jié)論及展望

貝類(lèi)毒素不但危害人類(lèi)的健康，還會(huì)對(duì)漁業(yè)生產(chǎn)、環(huán)境保護(hù)和近海旅游產(chǎn)業(yè)等產(chǎn)生不良影響。近年來(lái)，貝類(lèi)毒素也愈發(fā)引起國(guó)內(nèi)外科學(xué)界的重視，迫切需要開(kāi)發(fā)一些簡(jiǎn)便、可行的毒素檢測(cè)方法。目前現(xiàn)有的毒素檢測(cè)方法各有其優(yōu)勢(shì)及不足，小鼠生物測(cè)定法與高效液相色譜法應(yīng)用較為普遍，但操作復(fù)雜，成本較高。毛細(xì)電泳法操作簡(jiǎn)便，但靈敏度較低，還需不斷改善。相比之下，免疫試劑盒檢測(cè)操作簡(jiǎn)便、快速，生物傳感器的小型化、自動(dòng)化使即時(shí)檢測(cè)成為可能[54]，有良好的開(kāi)發(fā)利用前景，下一步可將重點(diǎn)轉(zhuǎn)向免疫試劑盒種類(lèi)開(kāi)發(fā)和生物傳感器的應(yīng)用制造。由近幾年貝類(lèi)毒素檢測(cè)方法的發(fā)展情況不難看出，其總的趨勢(shì)一定是向著易操作、低成本、高靈敏度、高重現(xiàn)性、高通量及自動(dòng)化方向發(fā)展的。隨著新的貝類(lèi)毒素不斷被發(fā)現(xiàn)以及科學(xué)研究的進(jìn)一步深入，應(yīng)積極探索和建立更加可靠、有效的新型檢測(cè)方法，使檢測(cè)效果更加理想。

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Advances on shellfish posioning toxins and their detection technologies

FANG Liyuan, LI Daizong, XIAO Qin*

(College of Ocean,Hebei Agricultural University，Cangzhou 061100, China)

Shellfish posioning toxins, mainly produced from microalgaes, were accumulated in shellfish body by feeding. Afterwards, they were released in human body by shellfish intake and caused corresponding food poisoning symptoms. These shellfish posioning toxins potentially threaten human health. Therefore, in the review, shellfish posioning toxins and their species were summarized, their detection technologies were introduced in detail such as mouse bioassay, HPLC, immunoassay, capillary electrophoresis, biosensor and so on, and all kinds of methods were also analyzed. Finally, the future development trend of detection technologies of shellfish posioning toxins were prospected in the paper. [Chinese Fishery Quality and Standards, 2017, 7(1):41-49]

shellfish posioning toxins; detection technology; high performance liquid chromatography(HPLC); enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA); biosensor

XIAO Qin, qinxiao669@163.com

10.3969/j.issn.2095-1833.2017.01.007

2016-09-05；接收日期：2016-10-26

河北省高等學(xué)?？茖W(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(ZD2015119)；河北省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(12276712D)

方麗媛(1994-)，女，研究方向?yàn)樗a(chǎn)品安全檢測(cè)，437510621@qq.com 通信作者：肖勤，副教授，研究方向?yàn)樗a(chǎn)動(dòng)物病害防治及檢測(cè)，qinxiao669@163.com

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2095-1833(2017)01-0041-09