潘金春，任柏樺,閔凡貴，陳瑞愛，王希龍*，王林川*，王鳳國，羅書明，葉健聰，劉 玲，黃鵬華

(1.廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測所，廣東廣州 510663；2.廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510663；3.廣東溫氏大華農(nóng)生物科技有限公司，廣東新興 527400; 4.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院， 廣東廣州 510642)

巴馬小型豬對高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒的敏感性評價(jià)

潘金春1,2△，任柏樺3,4△,閔凡貴1,2，陳瑞愛3,4，王希龍1,2*，王林川3,4*，王鳳國3，羅書明3，葉健聰3，劉 玲3，黃鵬華3

(1.廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測所，廣東廣州 510663；2.廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510663；3.廣東溫氏大華農(nóng)生物科技有限公司，廣東新興 527400; 4.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院， 廣東廣州 510642)

為評價(jià)巴馬小型豬對高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒(HP-PRRSV)的敏感性，本研究選擇PRRSV抗體陰性的16頭巴馬小型豬和17頭本地二元雜交豬作為研究對象，分別分為低劑量接毒組、高劑量接毒組、對照組1和對照組2，低劑量、高劑量接毒組肌肉注射接種PRRSV NVDC-JXA1強(qiáng)毒株，對照組1和接毒組混合飼養(yǎng)，對照組2分開飼養(yǎng)作為空白對照。接毒后每天測量體溫，觀察精神、食欲、死亡等情況，死亡動(dòng)物剖檢病變，攻毒后每隔7 d采血用RT-PCR法檢測病原，連續(xù)觀察21 d。結(jié)果絕大部分豬體溫升高到41℃以上，且有3個(gè)以上溫次，所有接種及混養(yǎng)動(dòng)物都死亡，巴馬小型豬死亡時(shí)間在8 d～17 d，二元雜交豬在7 d～13 d，死亡動(dòng)物出現(xiàn)肺充血、出血、實(shí)變，扁桃體、淋巴結(jié)、肝臟、腎臟、皮下有出血等癥狀，病原RT-PCR檢測為陽性，說明攻毒動(dòng)物死于HP-PRRS，表明巴馬小型豬對PRRSV NVDC-JXA1強(qiáng)毒株非常敏感，可用于PRRS活疫苗的檢驗(yàn)。

巴馬小型豬；高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒；敏感性評價(jià)

豬繁殖與呼吸綜合征(Procine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是20世紀(jì)80年代出現(xiàn)的一種新豬病，1987年美國與加拿大首次報(bào)道該病，隨后歐洲也報(bào)道了類似疾病[1]。2006年5月份以來，我國江西、河南、河北、山東、北京及廣東等地豬群出現(xiàn)了高熱不退、體表發(fā)紅、呼吸困難、高發(fā)病率及病死率為主要特征的疫情[2]，后經(jīng)實(shí)驗(yàn)室診斷確診為高致病性PRRS(Highly pathogenic PRRS，HP-PRRS)，是由PRRSV變異株(NVDC-JXA1株)引起的[3]。

PRRS給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的損失，但卻沒有特異的治療方法，目前疫苗免疫仍是最主要的預(yù)防措施[4]。其中，弱毒疫苗的免疫效果要好于滅活疫苗[5]。根據(jù)農(nóng)業(yè)部第1548號(hào)公告[6]，需要用對HP-PRRSV NVDC-JXA1強(qiáng)毒株易感的豬對PRRS活疫苗進(jìn)行安全檢驗(yàn)和效力檢驗(yàn)，目前常用的檢驗(yàn)用豬為本地二元雜豬。

與普通家豬相比，小型豬因體型較小而便于操作和飼養(yǎng)管理，成本較低，遺傳選擇、遺傳控制也更符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的要求[7]。為了選擇一種合適的易感小型豬，本研究前期對藍(lán)塘豬、蕨麻小型豬、巴馬小型豬、五指山小型豬等幾種小型豬種進(jìn)行了HP-PRRSV初步攻毒試驗(yàn)[8]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)巴馬小型豬和五指山小型豬白系對PRRSV NVDC-JXA1株強(qiáng)毒的敏感性較高，可能適合于HP-PRRS活疫苗檢驗(yàn)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證及評價(jià)巴馬小型豬對PRRSV NVDC-JXA1株強(qiáng)毒的敏感性，本研究進(jìn)一步開展攻毒試驗(yàn)，以驗(yàn)證其敏感性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)用動(dòng)物 巴馬小型豬16頭，來源于廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測所和廣東溫氏大華農(nóng)生物科技有限公司合作建立的小型豬繁育基地，體重7.1 kg～12.5 kg，55日齡～70日齡；二元雜交豬17頭，從本地購得，體重8.6 kg～12.2 kg，40日齡左右。各豬種雌雄不限。試驗(yàn)前采血清用ELISA方法檢測PRRSV抗體均呈陰性。1.1.2 毒株 HP-PRRSV NVDC-JXA1毒株(JXA1-R株)由中國動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心提供，用Marc-145細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，測得TCID50為104.5/mL。1.1.3 試劑盒及儀器 PRRSV抗體ELISA檢測試劑盒，IDEXX公司產(chǎn)品；PRRSV RT-PCR檢測試劑盒，世紀(jì)元亨公司產(chǎn)品；PCR儀為Eppendorf產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 分組及接種 將試驗(yàn)豬按表1進(jìn)行分組，共分8組，2種試驗(yàn)豬的分組方法一樣，都分成4組，包括低劑量接毒組，接種劑量為高劑量組的1/10；高劑量接毒組，接種劑量為3×104.5TCID50/mL，此劑量為常規(guī)疫苗檢驗(yàn)中使用的攻毒劑量；對照組1，與攻毒動(dòng)物混養(yǎng)，檢驗(yàn)病毒的傳播情況；對照組2，與攻毒豬分開飼養(yǎng)，作為整個(gè)試驗(yàn)的空白對照。

1.2.2 觀察檢測內(nèi)容 1.2.2.1 一般觀察及體溫測量 接毒后每天觀察試驗(yàn)豬精神、食欲和死亡等情況，死亡動(dòng)物解剖觀察病變。試驗(yàn)周期21 d，存活豬只在21 d處死剖檢。1.2.2.2 體溫測量 接毒后每天定時(shí)(上午8點(diǎn)～10點(diǎn))測量肛溫，并記錄每日體溫情況。

表1 試驗(yàn)豬分組

1.2.3 PRRSV RT-PCR檢測 攻毒后每7 d前腔靜脈叢采血5 mL，分離血清，采用PRRSV RT-PCR檢測試劑盒檢測PRRSV，主要步驟如下：病毒RNA抽提→RT-PCR擴(kuò)增(42℃ 45 min；95℃ 3 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，共35次循環(huán)；72℃ 7 min)→電泳。結(jié)果判定：陽性樣品出現(xiàn)436 bp擴(kuò)增帶，陰性樣品無帶出現(xiàn)。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)方法 試驗(yàn)豬死亡情況用SPSS16.0軟件制作成生存曲線，體溫?cái)?shù)據(jù)輸入Excel軟件中制作變化曲線。

2 結(jié)果

2.1 一般觀察

低劑量接毒組、高劑量接毒組、對照組1動(dòng)物都出現(xiàn)精神沉郁、食欲下降現(xiàn)象，部分豬表現(xiàn)氣喘、呼吸困難；對照組2動(dòng)物在整個(gè)試驗(yàn)周期都表現(xiàn)正常。

2.2 死亡情況

接毒后各組動(dòng)物生存曲線見圖1，2種試驗(yàn)豬的低劑量組、高劑量組、對照組1的動(dòng)物全部死亡，巴馬小型豬在攻毒后8 d～17 d死亡，二元雜豬在攻毒后7 d～13 d死亡，對照組2動(dòng)物在整個(gè)試驗(yàn)周期均未死亡(數(shù)據(jù)不包含在圖1中)。

2.3 病理剖檢

病死豬剖檢可見肺臟充血、出血、實(shí)變(圖2)，病變主要出現(xiàn)在肺心葉和尖葉。另外，還可見扁桃體腫大、出血，腹股溝淋巴結(jié)腫大、充血，皮下、肝臟、腎臟可見出血點(diǎn)或出血斑等病變。

2.4 體溫

試驗(yàn)豬體溫變化曲線(各組平均值)見圖3，低劑量組、高劑量組和對照組1試驗(yàn)豬在攻毒后第1天大部分就出現(xiàn)體溫升高(40℃左右)，其中巴馬小型豬都在39.5℃以上，二元雜交豬則各組有1頭～2頭不超過39.5℃；從第2天開始體溫有所波動(dòng)，但大部分試驗(yàn)豬體溫都超過39.5℃，并達(dá)到41℃以上，且有3個(gè)以上溫次。在整個(gè)試驗(yàn)周期中，對照組2動(dòng)物都未出現(xiàn)體溫升高(小于39.5℃)。

2.5 RT-PCR檢測結(jié)果

如圖4所示，接種后第7天低劑量組、高劑量組和對照組1試驗(yàn)豬樣品都出現(xiàn)436 bp的陽性條帶，對照組2動(dòng)物樣品檢測結(jié)果為陰性。接種后14 d存活動(dòng)物的樣品仍可見436 bp的陽性條帶，對照組2動(dòng)物樣品檢測結(jié)果仍為陰性。

圖1 攻毒后各組生存曲線

A、B.巴馬小型豬肺正反兩面圖；C、D.二元雜豬肺正反兩面圖

圖3 試驗(yàn)豬接種后體溫變化曲線

A.1.陰性對照；2.陽性對照(436 bp條帶)；3.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；4～18.分別為二元雜豬低劑量組(5頭)、高劑量組(5頭)、對照組1(5頭)

B.1.陽性對照(436 bp條帶)；2.陰性對照；3.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；4～17.分別為巴馬小型豬低劑量組(5頭)、高劑量組(5頭)、對照組1(4頭)；18、19.二元雜豬對照組2(2頭)；20、21.巴馬小型豬對照組2(2頭)

A.1.Negative control;2.Positive control (436 bp); 3.DNA Marker DL 2 000; 4-18.Lower dose group (5),higher dose group (5),and control group 1 (5) in binary hybrid pigs

B.1.Positive control (436 bp);2.Negative control;.3.DNA Marker DL 2 000;4-17.Lower dose group (5),higher dose group (5),and control group 1 (4) in Bama minipigs;18,19.Control group 2 (2) in binary hybrid pigs;20,21.Control group 2 (2) in Bama minipigs

圖4 RT-PCR檢測電泳圖

Fig.4 The electrophortic patterns of RT-PCR

3 討論

HP-PRRS具有發(fā)病急、傳播快、發(fā)病率高、病死率高等特點(diǎn)，以妊娠母豬和1月齡以內(nèi)的仔豬最易感，40日齡以內(nèi)的仔豬病死率高達(dá)100%，育肥豬病死率約為50%；在一些地區(qū)的豬場，發(fā)病率接近100%，病死率在30%～50%，甚至部分豬場的病死率可達(dá)80%以上[9]。HP-PRRS還是一種高度接觸性傳染病，并可持續(xù)性感染，是對養(yǎng)豬業(yè)的一個(gè)重大威脅，會(huì)造成重大經(jīng)濟(jì)損失。因此，加強(qiáng)對HP-PRRS的防控非常重要。

根據(jù)農(nóng)業(yè)部《高致病性豬藍(lán)耳病防治技術(shù)規(guī)范》規(guī)定，符合臨床病理指標(biāo)，同時(shí)HP-PRRSV分離鑒定陽性或HP-PRRSV反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測陽性，即可確診為HP-PRRS感染。本研究中，攻毒豬出現(xiàn)精神沉郁、食欲下降，氣喘、呼吸困難等癥狀，死亡豬剖檢可見肺臟充血、出血、實(shí)變，扁桃體、淋巴結(jié)、肝臟、腎臟、皮下有出血，體溫升高到41℃以上，符合HP-PRRS臨床病理特征；同時(shí)，接毒豬血清的PRRSV RT-PCR檢測為陽性，說明接毒豬都感染了HP-PRRSV，并發(fā)病表現(xiàn)臨床癥狀，直至死亡。

根據(jù)農(nóng)業(yè)部第1548號(hào)公告規(guī)定[6]，HP-PRRS敏感的豬種攻毒后21 d死亡率要達(dá)到40%(2/5)以上，本研究中巴馬小型豬和二元雜豬死亡率都為100%，能夠滿足其敏感性要求，可以用于HP-PRRS活疫苗的檢驗(yàn)。本研究中高劑量接毒組的接種劑量為3×104.5TCID50/mL，此劑量為常規(guī)疫苗檢驗(yàn)中使用的攻毒劑量，而低劑量接毒組的接種劑量是高劑量組的1/10，但動(dòng)物死亡率都為100%，說明巴馬小型豬和二元雜豬對HP-PRRSV的敏感性都非常高。本研究中對照組1動(dòng)物未接種病毒，而與攻毒豬一起混養(yǎng)，但該組動(dòng)物死亡率也為100%，說明攻毒豬接種后很快就可以排毒，并且容易通過接觸傳播。

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[7] 孫 倩.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)基礎(chǔ)[M].北京：北京科學(xué)技術(shù)出版社，2005.

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Susceptibility Evaluation of Highly Pathogenic Procine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus in Bama Minipigs

PAN Jin-chun1,2,REN Bo-hua3,4,MIN Fan-gui1,2,CHEN Rui-ai3,4, WANG Xi-long1,2,WANG Lin-chuan3,4,WANG Feng-guo3, LUO Shu-ming3,YE Jian-cong3,LIU Ling3,HUANG Peng-hua3

(1.GuangdongLaboratoryAnimalsMonitoringInstitute,Guangzhou，Guangdong，510663，China; 2.GuangdongProvincialKeyLaboratoryofLaboratoryAnimals,Guangzhou,Guangdong，510663，China; 3.GuangdongWensDahuanongBiotechnologyCo.,Ltd.,Xinxing,Guangdong，527400,China; 4.CollegeofVeterinaryMedicine,SouthChinaAgriculturalUniversity,Guangzhou,Guangdong，510642,China)

To evaluate the sensibility to highly pathogenic procine reproductive and respiratory syndrome virus (HP-PRRSV) in Bama minipigs,16 Bama minipigs and 17 local binary hybrid pigs,whose PRRSV antibodies were negative,were divided into lower dose group,higher dose group,control group 1 and control group 2,respectively.Pigs in lower dose group and higher dose group were injected intramuscularly with virulent strain NVDC-JXA1 of PRRSV,pigs in control group 1 were mixed with inoculated groups,and in control group 2 were segregated as blank control.Animals were continuously taken temperatures and observed for 21 days on mental condition,appetite,survival after inoculation.The dead pigs were examined by autopsy.Blood was collected for detecting virus by RT-PCR every 7 days.As a result,body temperatures of most pigs were raised above 41 ℃,and the hyperthermias were recorded more than 3 times.All inoculated and mixed animals were dead,and the dead time was 8 to 17 days in Bama minipigs,as well as 7 to 13 days in binary hybrid pigs.The dead animals showed hemorrhages and consolidations in lungs,and hemorrhages in tonsils,lymph glands,livers,kidneys and subcutaneous tissues.The testing results of RT-PCR were positive.Above all,the inoculated animals died of HP-PRRSV.In conclusion,Bama minipigs were sensitive to virulent strain NVDC-JXA1 of PRRSV,and should be used for the inspection of HP-PRRS live vaccine.

Bama minipig; Highly pathogenic procine reproductive and respiratory syndrome virus; susceptibility evaluation

2015-04-07

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2015A030302028，2015A030303004，2015A030302035)；廣東省教育部產(chǎn)學(xué)研結(jié)合項(xiàng)目(2012B091100466)

潘金春(1979-)，男，江蘇寶應(yīng)人，助理研究員，碩士，主要從事比較醫(yī)學(xué)、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)化和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量監(jiān)測研究?！魍蓉暙I(xiàn)作者 *通訊作者

S852.659.6

A

1007-5038(2017)01-0056-05