韓乾杰張玲玲陳 敏李 慧范小燕楊彩梅，?

（1.浙江農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，臨安 313000；2.浙江萬方生物科技有限公司，安吉 313307）

植物精油與丁酸鈉的體外協(xié)同抑菌效果研究

韓乾杰1張玲玲1陳 敏2李 慧2范小燕2楊彩梅1，2?

（1.浙江農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，臨安 313000；2.浙江萬方生物科技有限公司，安吉 313307）

本試驗(yàn)旨在研究植物精油與丁酸鈉的體外協(xié)同抑菌效果。采用牛津杯法，測定肉桂醛、百里香酚和香蘭素對(duì)于4種細(xì)菌（大腸桿菌、沙門氏菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、乳酸菌）的抑菌效果。并將單方和復(fù)合植物精油分別與丁酸鈉復(fù)配，測定其抑菌效果。結(jié)果表明：3種植物精油均對(duì)大腸桿菌、沙門氏菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌有明顯抑制作用，但對(duì)乳酸菌無抑制作用，在相同濃度下，抑菌效果為肉桂醛＞香蘭素＞百里香酚。肉桂醛與香蘭素復(fù)合植物精油抑菌效果優(yōu)于單方植物精油，當(dāng)肉桂醛與香蘭素的質(zhì)量比為6∶1時(shí)抑菌效果最佳。丁酸鈉沒有顯示出抑菌作用，但丁酸鈉與植物精油復(fù)合可明顯降低植物精油的使用量。綜上所述，不同植物精油的復(fù)合具有協(xié)同作用，植物精油和丁酸鈉之間也存在著協(xié)同作用。

植物精油；丁酸鈉；協(xié)同抑菌效果；最小抑菌濃度

抗生素由于藥物的殘留、病原菌的耐藥性等問題而逐漸被限制在飼料中使用。因此，尋找綠色安全的抗生素替代物成為當(dāng)前動(dòng)物營養(yǎng)研究的熱點(diǎn)。Fang等［1］報(bào)道，將1 g/kg刺五加精油添加到21日齡斷奶仔豬的飼糧中，仔豬腸道大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌的數(shù)量顯著降低。Michiels等［2］研究表明，百里香酚能夠顯著提高仔豬空腸和盲腸中乳酸桿菌的數(shù)量，降低空腸中的厭氧菌、梭菌和鏈球菌的數(shù)量。丁酸鈉在維持細(xì)胞的分化和結(jié)腸上皮的完整性、提高動(dòng)物生產(chǎn)性能方面發(fā)揮著重要作用。Kotunia等［3］在3日齡仔豬人工乳中加入丁酸鈉，發(fā)現(xiàn)丁酸鈉使空腸和回腸絨毛長度和黏膜厚度增加。Manzanilla等［4］研究表明，飼糧中添加丁酸鈉可以增加斷奶仔豬回腸杯狀細(xì)胞的數(shù)量。李丹丹等［5］研究表明，飼糧中添加丁酸鈉能促進(jìn)斷奶仔豬的生長和免疫器官發(fā)育，提高血清免疫球蛋白的含量，刺激機(jī)體腸道黏膜分泌免疫球蛋白A，提高其免疫功能。王純剛［6］研究發(fā)現(xiàn)，在飼糧中添加丁酸鈉可減少仔豬受輪狀病毒感染的應(yīng)激反應(yīng)。植物精油具有抑菌效果，可抑制腸道致病菌的增殖，進(jìn)而促進(jìn)動(dòng)物健康生長。目前對(duì)于植物精油、丁酸鹽的研究大多是對(duì)其單一特性的分析，而對(duì)于植物精油與丁酸鹽的協(xié)同作用方面的研究相對(duì)較少。本試驗(yàn)通過體外抑菌試驗(yàn)尋求抑菌效果最好的植物精油，并且研究植物精油與丁酸鈉的協(xié)同作用，旨在為進(jìn)一步開發(fā)新型綠色飼料添加劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

肉桂醛（淡黃色液體）、百里香酚（無色半透明結(jié)晶）、香蘭素（白色粉末）、丁酸鈉（白色粉末），均由浙江萬方生物科技有限公司提供，試驗(yàn)前置于4℃冰箱、避光條件下保存。

大腸桿菌（ATCC 25922）、沙門氏菌（CICC 21913）、產(chǎn)氣莢膜梭菌（ATCC13124）均購自廣東省菌種保藏中心，乳酸桿菌（ATCC 7469）購自中國工業(yè)微生物菌種保藏中心。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 抑菌試驗(yàn)

抑菌試驗(yàn)采用牛津杯法。培養(yǎng)基表面放5個(gè)滅菌牛津杯，分別加入3種精油（百里香酚、肉桂醛、香蘭素，添加量均為16 mg/mL），并加入95%乙醇做空白對(duì)照，加入硫酸黏桿菌素（1 280 μg/mL）做陽性對(duì)照。每個(gè)菌種做3個(gè)平行，放入37℃的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

1.2.2 最低抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）及復(fù)合植物精油抑菌試驗(yàn)

通過牛津杯篩選獲得初步抑菌效果較佳的植物精油，采用梯度稀釋法測定植物精油的MIC。

復(fù)合植物精油由肉桂醛和香蘭素組成，抑菌試驗(yàn)中肉桂醛和香蘭素按梯度比例（6∶1、4∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶4、1∶6，質(zhì)量比）進(jìn)行復(fù)合制劑的配制，并尋求最佳的比例。

1.2.3 植物精油與丁酸鈉的協(xié)同抑菌試驗(yàn)

按照1.2.1的試驗(yàn)方法，在滅菌牛津杯分別加入 植 物 精 油 （16 mg/mL）、丁 酸 鈉 溶 液（2.2 mg/mL）、植物精油+丁酸鈉（1∶1，質(zhì)量比），并以 95%乙醇做空白對(duì)照，以硫酸黏桿菌素（1 280 μg/mL）做陽性對(duì)照。每個(gè)菌種做3個(gè)平行，然后放入37℃的生化培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)24 h。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Excel 2003進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 3種植物精油單獨(dú)抑菌效果

由表1和圖1可知，肉桂醛和香蘭素對(duì)大腸桿菌、沙門氏菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌都有很強(qiáng)的抑制作用。此外，硫酸黏桿菌素是腸道細(xì)菌敏感的抗生素之一，對(duì)于大腸桿菌、沙門氏菌和乳酸菌都具有敏感性，可抑制其增殖。

表1 3種植物精油對(duì)細(xì)菌的抑菌圈直徑Table 1 Antibacterial circle diameters of three kinds of plant essential oils on bacteria mm

圖1 3種植物精油單獨(dú)抑菌效果Fig.1 Single bacteriostatic effect of three kinds of plant essential oils

2.2 植物精油與丁酸鈉的協(xié)同抑菌效果

由表2和圖2可知，肉桂醛、肉桂醛與丁酸鈉1∶1混合對(duì)大腸桿菌、沙門氏菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌的抑制效果大致相同，表明丁酸鈉與植物精油復(fù)配可以減少至少50%的精油用量。

2.3 不同植物精油的MIC

由表3和圖3可知，肉桂醛對(duì)產(chǎn)氣夾膜梭菌的抑菌作用最強(qiáng)，其次為沙門氏菌，對(duì)大腸桿菌的最低抑菌濃度為312.50 μg/mL；香蘭素對(duì)產(chǎn)氣夾膜梭菌的抑菌作用較強(qiáng)，對(duì)大腸桿菌和沙門氏菌的最低抑菌濃度均為625.00 μg/mL。肉桂醛與香蘭素1∶1復(fù)合時(shí)的抑菌效果優(yōu)于單獨(dú)使用香蘭素。

表2 肉桂醛和肉桂醛與丁酸鈉混合物對(duì)細(xì)菌的抑菌圈直徑Table 2 Antibacterial circle diameters of cinnamaldehyde and mixture of cinnamaldehyde and sodium butyrate on bacteria mm

圖2 植物精油與丁酸鈉的協(xié)同抑菌效果Fig.2 Synergistic bacteriostatic effect of plant essential oil and sodium butyrate

表3 不同植物精粙的最低抑菌濃度Table 3 MIC of different plant essential oils μg/mL

圖3 不同植物精粙的最低抑菌濃度Fig.3 MIC of different plant essential oils

2.4 復(fù)合植物精油的MIC

由表4和圖4可知，在復(fù)合植物精油中，抑菌作用最強(qiáng)的是肉桂醛與香蘭素6∶1的配比，肉桂醛所占比例越大，抑菌效果越佳。

表4 復(fù)合植物精油的最小抑菌濃度Table 4 MIC of compound plant essential oils μg/mL

圖4 復(fù)合植物精油的最小抑菌濃度Fig.4 MIC of compound plant essential oils

2.5 復(fù)合植物精油與丁酸鈉的協(xié)同抑菌效果

由表5和圖5可知，肉桂醛與香蘭素的復(fù)合植物精油和復(fù)合植物精油與丁酸鈉1∶1、1∶2、1∶3混合物對(duì)大腸桿菌、沙門氏菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌的抑制效果大致相同，表明復(fù)合植物精油和丁酸鈉之間也存在協(xié)同作用，在保持相同抑菌效果的前提下，丁酸鈉能夠減少75%的復(fù)合植物精油的使用量。

3 討 論

某些植物精油具有較強(qiáng)的抑菌效果已經(jīng)被很多報(bào)道和研究所證實(shí)，汪中興等［7］檢測了3種可飼植物精油（肉桂油、牛至油和百里香油）在一定配比下對(duì)豬源產(chǎn)腸毒素大腸桿菌K88和霍亂沙門菌A72的體外抑菌作用，結(jié)果表明抑菌效果為：肉桂油＞牛至油＞百里香油。張赟彬等［8］通過對(duì)植物精油的主要化學(xué)成分進(jìn)行分析總結(jié)，發(fā)現(xiàn)許多植物精油的成分中包含苯環(huán)或者共軛雙鍵結(jié)構(gòu)，例如肉桂醛、香蘭素以及檸檬醛等，這種結(jié)構(gòu)通過結(jié)合微生物細(xì)胞膜表面的離子通道蛋白，從而改變細(xì)胞膜的通透性，加速菌體代謝致使細(xì)菌死亡。本試驗(yàn)的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)肉桂醛表現(xiàn)出很強(qiáng)的抑菌作用，香蘭素的抑菌作用次之，百里香酚最弱。

表5 復(fù)合植物精油與丁酸鈉的混合物對(duì)細(xì)菌的抑菌圈直徑Table 5 Antibacterial circle diameters of the mixture of compound plant essential oil and sodium butyrate on bacteria mm

圖5 復(fù)合植物精油與丁酸鈉的協(xié)同抑菌效果Fig.5 Synergistic bacteriostatic effect of compound plant essential oils and sodium butyrate

現(xiàn)有對(duì)于植物精油的協(xié)同性的研究大致體現(xiàn)在2個(gè)方面，其中一方面為不同植物精油之間的協(xié)同。復(fù)合植物精油由于含有不同組分，能夠多途徑、多靶位發(fā)揮協(xié)同效應(yīng)，整體的作用效果一定程度上強(qiáng)于單方植物精油。Imming等［9］枚舉了植物精油進(jìn)入機(jī)體后其所有可能的靶作用點(diǎn)，其中有代謝酶、基質(zhì)、轉(zhuǎn)運(yùn)載體、蛋白質(zhì)、受體、細(xì)胞因子、DNA/RNA等。Galindo等［10］研究發(fā)現(xiàn)，植物精油中的多酚類物質(zhì)，雖然其本身的物理特性較為模糊，卻能夠通過提高主要活性物質(zhì)的溶解度和吸收率來增強(qiáng)整體的作用效果。而醛類物質(zhì)，能夠穿透細(xì)胞膜，與細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的蛋白質(zhì)結(jié)合，從而抑制關(guān)鍵酶的活性，達(dá)到抑菌的效果［11］。 例如，Roldán-Gutiérrez等［12］的研究發(fā)現(xiàn)植物精油的復(fù)合效應(yīng)能夠抵抗大多數(shù)致病細(xì)菌，如單增李斯特菌，這種菌對(duì)所有單一植物精油都有一定的耐受性，復(fù)合植物精油能夠更好地抑制其生長，同時(shí)多種植物精油復(fù)合可以減少植物精油的添加量，并增強(qiáng)其抑菌效果。Bassolé等［13］研究表明，相比于單獨(dú)使用香芹酚（瓦解細(xì)胞外膜）和百里香酚（結(jié)合菌體蛋白）的抑菌效果，綜合了兩者的野薔薇精油的抑菌效果更佳。Bozkurt等［14］研究發(fā)現(xiàn)，將含有香芹酚、百里酚、桉樹腦和檸檬烯的植物精油混合物添加到蛋雞的基礎(chǔ)飼糧中，能夠有效緩解應(yīng)激，降低死亡率。Arczewska-Wlosek等［15］指出，混合植物精油（含百里香酚、大蒜精油）能夠緩解肉雞染艾美爾球蟲病的病情。Rahimi等［16］研究發(fā)現(xiàn)，百里香酚、紫雛菊和大蒜精油的混合物可顯著減少肉仔雞回腸、盲腸中大腸桿菌的數(shù)量。目前發(fā)現(xiàn)的植物精油中有協(xié)同增效作用的成分很多，常見的復(fù)配組合有肉桂醛和香蘭素、紫蘇醛和蓼二醛等，通過復(fù)配都可以降低各自的MIC［17］。植物精油在動(dòng)物腸道健康的保健和治療上的應(yīng)用更為常見，劉容珍等［18］認(rèn)為選對(duì)合適的植物精油組合，可以用最少的劑量達(dá)到最大的收益，同時(shí)能夠減輕或消除潛在的副作用。因此，研究植物精油及其主要成分之間抑菌作用的協(xié)同性有著重要的科學(xué)意義。本試驗(yàn)首次發(fā)現(xiàn)肉桂醛和香蘭素的配比為6∶1時(shí)對(duì)大腸桿菌、沙門氏菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌的抑制效果最強(qiáng)。

植物精油的協(xié)同性研究的另一方面是將復(fù)合植物精油和其他抑菌物質(zhì)聯(lián)用，從而提高其抑菌活性。Bassolé等［13］在野薔薇精油中發(fā)現(xiàn)除主要抑菌物質(zhì)（香芹酚和百里香酚）外，薄荷酮、桉樹腦等也在強(qiáng)化整體的抑菌效果。王繼鳳等［19］發(fā)現(xiàn)，丁酸鈉在一定程度上，在不影響抑菌效果的作用下，能夠減少一部分抗生素的用量，且與抗生素存在協(xié)同效應(yīng)。王帆等［20］的體外試驗(yàn)表明，復(fù)合植物精油與單寧酸進(jìn)行復(fù)配能夠?qū)?種常見致病菌（金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌、腸炎沙門氏菌和單增李斯特菌）均產(chǎn)生較強(qiáng)的抑制作用，且復(fù)配后各成分的MIC都有降低。找到合適的配比，能夠使得復(fù)合植物精油的抗菌活性增強(qiáng)，并且能夠減少的精油的使用量。李凱年［21］研究發(fā)現(xiàn)，飼料添加劑Natesse（含有丁酸鈉和組合精油）可以減少肉雞卵囊的排泄。齊勝利［22］的研究認(rèn)為，在植物精油中添加丁酸有助于增強(qiáng)植物精油中活性成分的抗菌作用。Jerzsele等［23］試驗(yàn)也表明，在肉雞的飼糧中添加香精油或者是丁酸鈉與植物精油的混合物后小腸絨毛長度/隱窩深度值得到極其顯著提高，并且產(chǎn)氣莢膜梭菌的數(shù)量顯著減少。本試驗(yàn)結(jié)果表明，復(fù)合植物精油和丁酸鈉之間存在協(xié)同作用，丁酸鈉的加入能夠減少75%的復(fù)合植物精油（肉桂醛與香蘭素以6∶1的質(zhì)量比復(fù)合）的使用量，同時(shí)淡化了植物精油的濃郁氣味。

4 結(jié) 論

肉桂醛和香蘭素組成的復(fù)合植物精油對(duì)大腸桿菌、沙門氏菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌的抑制作用比單方植物精油更強(qiáng)，2種單方植物精油之間存在協(xié)同效應(yīng)，最適配比為6∶1。丁酸鈉與植物精油之間存在協(xié)同作用，并且能夠減少75%的復(fù)合植物精油（肉桂醛與香蘭素以 6∶1的質(zhì)量比復(fù)合）的使用量。

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Synergistic Bacteriostatic Effect of Plant Essential Oils and Sodium Butyratein Vitro

HAN Qianjie1ZHANG Lingling1CHEN Min2LI Hui2FAN Xiaoyan2YANG Caimei1，2?
（1.College of Animal Science and Technology，Zhejiang A＆F University，Lin’an313000，China；2.Zhejiang Wanfang Biological Technologies Inc，Anji313307，China）

The objective of this study was to evaluate the synergistic bacteriostatic effect of pant essential oils and sodium butyratein vitro.The bacteriostatic effects of three kinds of essential oils（cinnamaldehyde，thymol and vanillin）onEscherichia coli，Salmonella，Clostridium perfringensandLactobacilluswere measured by Oxford cup method.And the bacteriostatic effects of the mixture of singe/compound plant essential oils and sodium butyrate were also measured.The results showed as follows：three kinds of plant essential oils all had obviously inhibiting effects onEscherichia coli，SalmonellaandClostridium perfringens，but had no inhibiting effects onLactobacillus，and the bacteriostatic effects was cinnamaldehyde＞vanillin＞thymol in the same concentration.The bacteriostatic effect of compound plant essential oils of cinnamaldehyde and vanillin was better than single plant essential oil，and the mass ratio of cinnamaldehyde to vanillin＝6∶1 was the best one.Sodium butyrate showed no bacteriostatic effect，while the compound of sodium butyrate and plant essential oil could obviously reduce the consumption of plant essential oil.The results indicate that the different plant essential oils have synergistic effect.There is a synergistic effect between plant essential oil and sodium butyrate.［Chinese Journal of Animal Nutrition，2017，29（2）：712-718］

plant essential oil；sodium butyrate；synergistic bacteriostatic effect；MIC

S482.2；TQ455

A

1006-267X（2017）02-0712-07

10.3969/j.issn.1006-267x.2017.02.041

（責(zé)任編輯 菅景穎）

2016-07-28

浙江省“飼料研發(fā)與安全科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)”項(xiàng)目（2011R50025）；浙江農(nóng)林大學(xué)人才項(xiàng)目（2034020001）

韓乾杰（1993—），男，浙江寧波人，碩士研究生，動(dòng)物科學(xué)專業(yè)。E-mail：373797557＠qq.com

?通信作者：楊彩梅，副教授，碩士生導(dǎo)師，E-mail：yangcaimei2012＠163.com

?Corresponding author，associate professor，E-mail：yangcaimei2012＠163.com