吳 建李小鵬賀志雄焦金真譚支良?

（1.中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)過程重點實驗室，湖南省畜禽健康養(yǎng)殖工程技術(shù)中心，農(nóng)業(yè)部中南動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)觀測實驗站，長沙 410125；2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049）

妊娠后期營養(yǎng)限制對母羊胃腸道葡萄糖轉(zhuǎn)運載體相關(guān)基因表達的影響

吳 建1，2李小鵬1，2賀志雄1焦金真1譚支良1?

（1.中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)過程重點實驗室，湖南省畜禽健康養(yǎng)殖工程技術(shù)中心，農(nóng)業(yè)部中南動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)觀測實驗站，長沙 410125；2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049）

本研究旨在研究妊娠后期營養(yǎng)限制對母羊胃腸道葡萄糖轉(zhuǎn)運載體相關(guān)基因表達的影響。選取20只同期受孕的湘東黑山羊，隨機分為2組，即對照組（自由采食）和限飼組（40%采食量限制），每組10只。預(yù)試期15 d（妊娠81～95 d），正試期39 d（妊娠96～135 d）。正試期結(jié)束后，屠宰并采取瘤胃、十二指腸、空腸、回腸以及盲腸的黏膜樣品，利用實時定量PCR技術(shù)，檢測Na+-葡萄糖共轉(zhuǎn)運載體1（SGLT1）、Na+-葡萄糖共轉(zhuǎn)運載體3（SGLT3）、易化葡萄糖轉(zhuǎn)運載體2（GLUT2）和易化葡萄糖轉(zhuǎn)運載體5（GLUT5）基因表達量。結(jié)果表明：限飼組與對照組相比，SGLT1基因表達量在瘤胃顯著降低（P＜0.05），在空腸和回腸中有降低趨勢（0.05≤P＜0.10）；GLUT5基因表達量在盲腸顯著降低（P＜0.05）；而其他葡萄糖轉(zhuǎn)運載體基因胃腸道表達量在限飼組和對照組差異均不顯著（P＞0.05）。由此可見，母羊妊娠后期營養(yǎng)限制對胃腸道中葡萄糖轉(zhuǎn)運載體基因表達有不同程度的影響，進而引起母羊機體內(nèi)葡萄糖轉(zhuǎn)運的改變。

妊娠后期；營養(yǎng)限制；山羊；葡萄糖轉(zhuǎn)運載體

碳水化合物是動物維持生長代謝和生產(chǎn)性能不可或缺的營養(yǎng)物質(zhì)。反芻動物擁有與單胃動物截然不同的復(fù)胃生理結(jié)構(gòu)，其體內(nèi)碳水化合物的利用方式主要分為以下2種：一是碳水化合物在瘤胃內(nèi)被微生物發(fā)酵代謝形成揮發(fā)性脂肪酸（volatile fatty acid，VFA），從而被瘤胃上皮細(xì)胞吸收利用；二是碳水化合物在腸道內(nèi)被降解為小分子的葡萄糖等單糖被腸道上皮細(xì)胞吸收利用［1］。葡萄糖對于反芻動物具有重要的生理功能，是機體主要的供能物質(zhì)，是合成乳糖的前體物質(zhì)。因此，葡萄糖在胃腸道中的吸收轉(zhuǎn)運對于維持反芻動物健康，保證生產(chǎn)性能具有重要的意義。相關(guān)研究表明，在皺胃中注射葡萄糖或者淀粉可以使葡萄糖轉(zhuǎn)運載體的活性迅速增加［2］。如果長時間的營養(yǎng)限制，動物體內(nèi)的葡萄糖轉(zhuǎn)運載體表達將做出相應(yīng)的調(diào)整，從而使機體來適應(yīng)這種低營養(yǎng)狀態(tài)［3］。然而，目前已有的研究并不能很好地解釋反芻動物在營養(yǎng)限制條件下對機體葡萄糖轉(zhuǎn)運的變化。同時，由于我國草原畜牧業(yè)受季節(jié)性影響嚴(yán)重，放牧家畜從枯草期到返青期失重高達30%［4］。特別是在枯草期，家畜將會受到較嚴(yán)重的低營養(yǎng)水平的限制，這就必然會引起反芻動物在該時期的營養(yǎng)失衡和生產(chǎn)性能的降低［5］。反芻動物的營養(yǎng)代謝紊亂是造成生產(chǎn)性能下降的主要原因，在低營養(yǎng)條件下，對母羊妊娠后期的影響尤為嚴(yán)重，但是這方面的生產(chǎn)實踐較多，研究營養(yǎng)對胃腸道葡萄糖轉(zhuǎn)運載體的影響極少。因此，本研究針對在營養(yǎng)物質(zhì)水平限制條件下，研究妊娠后期瀏陽黑山羊胃腸道葡萄糖轉(zhuǎn)運載體基因表達的變化，以期為妊娠期山羊科學(xué)合理的飼喂和管理提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

飼養(yǎng)試驗于2015年1—6月在中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所瀏陽黑山羊營養(yǎng)代謝技術(shù)創(chuàng)新試驗基地進行。

1.1 試驗動物

試驗動物均有創(chuàng)新試驗基地提供。選擇年齡相似［（2.0±0.3）歲］、第2胎次、體況良好、體重相近［（25.0±1.0）kg］、發(fā)情期相近的湘東黑山羊母羊60只。采取同期發(fā)情、人工授精和B超檢查技術(shù)保證母羊同期受孕。從妊娠母羊中選取20只懷有1胎的作為試驗對象。

1.2 試驗設(shè)計

采用單因素隨機分組試驗設(shè)計。于妊娠81 d將選取的20只試驗?zāi)秆螂S機分配到2組：對照組（control group，CG）（自由采食）、限飼組（restricted group，RG）（40%采食量限制），每組10只。預(yù)試期15 d（妊娠81～95 d），用于適應(yīng)新環(huán)境，期間記錄日采食量；正試期為39 d（妊娠96～135 d）。

1.3 飼養(yǎng)管理

妊娠0～80 d，將全部用于試驗的母羊集中飼養(yǎng)，自由放牧。

妊娠81～95 d將選取的母羊飼養(yǎng)在通風(fēng)良好、溫度和濕度適宜的單欄畜舍內(nèi)，記錄母羊編號，適應(yīng)新環(huán)境15 d。飼喂精粗比為60∶40的飼糧，飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1，其中粗料為瀏陽當(dāng)?shù)厣缴系男迈r芒草，粉碎后飼喂。母羊每天在08：30和17：00飼喂，自由飲水。飼喂量隨著母羊妊娠日齡的增加而逐步增加，每7 d調(diào)整1次。調(diào)整增加量以對照組自由采食量為基礎(chǔ)，但限飼組第1周飼喂量為限飼組適應(yīng)期采食量的60%。

1.4 樣品采集及相關(guān)指標(biāo)的測定

正試期結(jié)束后，屠宰采樣。每組隨機挑選6只母羊進行屠宰，采取頸動脈放血法，待動物停止呼吸后解剖采樣。分別采取母羊瘤胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸這5個部位的組織樣品，用生理鹽水沖洗干凈，然后用載玻片將黏膜刮下來，迅速用滅菌過的錫箔紙將黏膜包裹放入液氮保存。待屠宰試驗結(jié)束后，樣品放入-80℃冰箱凍存，以備后續(xù)檢測使用。

檢測葡萄糖轉(zhuǎn)運載體相關(guān)基因的表達量，第1類是Na+-葡萄糖共轉(zhuǎn)運載體（SGLTs）基因，包括Na+-葡萄糖共轉(zhuǎn)運載體1（sodium/glucose cotransporter member 1，SGLT1）和Na+-葡萄糖共轉(zhuǎn)運載體 3（sodium/glucosecotransportermember3，SGLT3），第2類是易化葡萄糖轉(zhuǎn)運載體（GLUTs）基因，包括易化葡萄糖轉(zhuǎn)運載體2（facilitated glucose transporter member 2，GLUT2）和易化葡萄糖轉(zhuǎn)運載體 5（facilitated glucose transporter member 5，GLUT5）。

表1 飼糧組成及營養(yǎng)水平（干物質(zhì)基礎(chǔ)）Table1 Composition and nutrient levels of the diet（DM basis） %

1.5 樣品分析

1.5.1 主要儀器

常規(guī)手術(shù)器械（手術(shù)刀、手術(shù)剪、手術(shù)鑷子等），高壓滅菌鍋（Tomy SX-500，日本），超凈工作臺（SW-CJ-IFD，蘇凈集團安泰空氣技術(shù)有限公司），日立冷凍超速離心機（Hitachi CR22GⅡ，日本），中央純水系統(tǒng)（ELAG LAB Water CENTRA200，英國），超微量紫外分光光度計（NnaoDroND2000，美國），實時定量 P CR儀（Roche Light Cycler 480Ⅱ，瑞士），凝膠成像系統(tǒng)（Ultro-Violet，英國），電泳儀（ECP3000，北京市六一儀器廠），電泳槽（DYCP-34A，北京市六一儀器廠）。

1.5.2 主要試劑

0.9%生理鹽水，氯仿，異丙醇，焦碳酸二乙酯（DEPC）水，75%乙醇（DEPC水配制），RNAios Plus（9109，日本TaKaRa，），反轉(zhuǎn)錄試劑盒Prime-ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（RR047A，日本TaKaRa），Premix TaqTM（Ex TaqTMversion 2.0 plus dye）（RR902A，日本 T aKaRa），SYBRPremix Ex TaqTMⅡ（RR802A，日本TaKa-Ra），溴化乙錠（ethidium bromide，EB），50×TAE（ST716，碧云天生物技術(shù)有限公司），瓊脂糖（GelPilot LE Agarose D40724，德國QIAGEN）。

1.5.3 總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄

使用RNAios Plus試劑提取總RNA，并且使用超微量紫外分光光度計測定總RNA的純度和濃度。OD260nm/OD280nm在1.8～2.2的總 RNA純度較好。將純度較好的總RNA經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳后，以28S rRNA和18S rRNA的灰度值比2∶1為依據(jù)，評判提取RNA的質(zhì)量。

使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒對提取的總RNA進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.5.4 實時定量PCR

根據(jù)Genbank上的山羊的相關(guān)基因序列，以Primer premier 5.0軟件設(shè)計葡萄糖轉(zhuǎn)運載體相關(guān)基因（SGLT1、SGLT3、GLUT2、GLUT5）的引物，并選取甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）作為內(nèi)參基因。用Blast（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi？LINK_LOC＝BlastHome）工具進行引物特異性分析。本研究所用引物均由上海生工工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，引物序列見表2。

表2 葡萄糖轉(zhuǎn)運載體相關(guān)引物序列Table 2 Primers sequence used for PCR of glucose transporters

10 μL的實時定量 PCR反應(yīng)體系包括：5.0 μL SYBRPremix Ex TaqTMⅡ，0.2 μL上游引物（10 μmol/L），0.2 μL下游引物（10 μmol/L），3.6 μL RNase Free dH2O和1.0 μL cDNA。反應(yīng)程序：95℃ 5 s變性，60℃ 30 s延伸，共40個循環(huán)；溶解程序，95℃ 15 s，60℃ 15 s，95℃ 5 s。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

實時定量PCR數(shù)據(jù)采用2-△△Ct法［6］對基因表達進行相對定量。所有數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件進行獨立樣本t檢驗（t-test）法驗證差異顯著性，其中P＜0.05表示組間差異顯著，0.05≤P＜0.10表示有降低或者升高的趨勢。結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié) 果

2.1 妊娠后期營養(yǎng)限制對母羊胃腸道中SGLTs基因表達的影響

由表3可知，與對照組相比，母羊妊娠后期在營養(yǎng)限制條件下盲腸中的SGLT1基因表達量顯著降低（P＜0.05）；而瘤胃、十二指腸、空腸和回腸中SGLT1基因表達量差異均不顯著（P＞0.05），但是在空腸和回腸中SGLT1基因表達量則有降低趨勢（0.05≤P＜0.10），較對照組分別降低了54.5%和63.7%。

表3 妊娠后期營養(yǎng)限制對母羊胃腸道中SGLT1基因表達量的影響Table 3 Effects of nutritional restriction during late gestation on expression level ofSGLT1 gene in gastrointestinal tract of ewes

由表4可知，與對照組相比，母羊妊娠后期在營養(yǎng)限制條件下SGLT3基因在胃腸道不同部位的表達量變化均不顯著（P＞0.05）。

表4 妊娠后期營養(yǎng)限制對母羊胃腸道中SGLT3基因表達量的影響Table 4 Effects of nutritional restriction during late gestation on expression level ofSGLT3 gene in gastrointestinal tract of ewes

2.1 妊娠后期營養(yǎng)限制對母羊胃腸道中GLUTs基因表達的影響

由表5可知，與對照組相比，母羊妊娠后期在營養(yǎng)限制條件下GLUT2基因表達量在瘤胃、十二指腸、空腸、回腸和盲腸中差異均不顯著（P＞0.05），但在十二指腸略有升高，較對照組提高了41.6%。

表5 妊娠后期營養(yǎng)限制對母羊胃腸道中GLUT2基因表達量的影響Table 5 Effects of nutritional restriction during late gestation on expression level ofGLUT2 gene in gastrointestinal tract of ewes

由表6可知，與對照組相比，母羊妊娠后期在營養(yǎng)限制條件下GLUT5基因表達量在盲腸中顯著降低（P＜0.05），但在瘤胃、十二指腸、空腸和回腸中變化不顯著（P＞0.05）。

3 討 論

根據(jù)葡萄糖轉(zhuǎn)運載體轉(zhuǎn)運方式的不同，可分為 2個家族：SGLTs家族和 GLUTs家族［7］。SGLTs主要在細(xì)胞膜的頂端表達，可以轉(zhuǎn)運葡萄糖和半乳糖［8］。而GLUTs大部分在細(xì)胞膜的基底側(cè)表達，可以轉(zhuǎn)運果糖，并且當(dāng)葡萄糖濃度較低時GLUTs能夠通過負(fù)反饋調(diào)節(jié)機體葡萄糖的平衡［9］?？傊?，葡萄糖轉(zhuǎn)運載體在動物的生長發(fā)育和機體葡萄糖吸收轉(zhuǎn)運中發(fā)揮重要作用。

表6 妊娠后期營養(yǎng)限制對母羊胃腸道中GLUT5基因表達量的影響Table 6 Effects of nutritional restriction during late gestation on expression level ofGLUT5 gene in gastrointestinal tract of ewes

3.1 SGLTs家族

據(jù)研究表明，無論是蔗糖還是淀粉分解得到的葡萄糖主要是通過 SGLT1進入腸腔上皮細(xì)胞［10-11］，而SGLT1基因在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的表達量受采食量和晝夜節(jié)律的調(diào)節(jié)［12］。哺乳動物在剛出生后未斷奶這個階段中，SGLT1基因在腸道中的表達較強，對己糖的攝取能力強。斷奶后，SGLT1基因的表達量明顯減少，對己糖的吸收也減少［7］。Bauer等［13］試驗研究發(fā)現(xiàn)，灌注 α-葡萄糖可以使牛和綿羊空腸中的SGLT1活性顯著提高，從而顯著提高了葡萄糖的吸收效率。也有研究揭示了營養(yǎng)限制仔豬采食量會使得SGLT1和GLUT2的基因表達量降低［14］。本研究結(jié)果顯示，與對照組相比，限飼組母羊SGLT1基因的表達量在空腸和回腸中均有降低趨勢，并且SGLT1基因的表達量在盲腸中顯著降低。這一結(jié)果可能是由于母羊妊娠后期營養(yǎng)限制造成胃腸道內(nèi)葡萄糖濃度有所降低，從而引起胃腸道中SGLT1基因表達量的降低，以此滿足母羊機體正常需求并避免不必要的體內(nèi)能量損失和飼糧營養(yǎng)物質(zhì)的浪費。

在人類醫(yī)學(xué)研究中表明，SGLT3可引起Na+電流變化，但不參與葡萄糖的轉(zhuǎn)運［15］。而在動物模型中，如小鼠，SGLT3有2個亞型基因組成，包括mSGLT3a和mSGLT3b，目前為止mSGLT3a功能尚不明確，而有研究已證實mSGLT3b可以引起Na+電流變化，但其不轉(zhuǎn)運葡萄糖［16］。由此可知，SGLT3基因編碼的蛋白有可能是感應(yīng)體，而非轉(zhuǎn)運載體［12］。本研究結(jié)果指出，母羊妊娠后期在營養(yǎng)限制條件下，SGLT3基因表達量在十二指腸升高了25.6%，但在后腸道部位沒有升高。這一結(jié)果也可能是由于食糜從皺胃中流出，經(jīng)過的第1段腸道即為十二指腸，SGLT3作為感應(yīng)體可第一時間感應(yīng)到胃腸道內(nèi)葡萄糖的變化，從而引起了其表達量升高。同時也意味著通過判斷SGLT3基因表達量的變化，機體可以更加精確地感應(yīng)食糜中的葡萄糖含量，調(diào)控機體后腸道部分葡萄糖轉(zhuǎn)運載體和葡萄糖代謝的變化，以避免機體能量不必要的消耗和飼糧中營養(yǎng)成分的丟失。

3.2 GLUTs家族

有研究指出SGLT1和GLUT2不僅是葡萄糖轉(zhuǎn)運載體，也可能是葡萄糖感應(yīng)受體，它可刺激并引起胃腸激素的分泌［17-20］。當(dāng)人造糖精刺激刷狀緣膜時，可以通過提高GLUT2基因的表達量來增加葡萄糖的吸收效率［20］。本研究中GLUT2基因表達量未受營養(yǎng)限制的影響，且其在十二指腸中的表達量最高。與本研究結(jié)果相似，Yoshikawa等［11］的研究結(jié)果也表明，胃腸道前段（瘤胃和十二指腸）是GLUT2發(fā)揮作用的主要場所。另外，有研究指出當(dāng)刷狀膜緣SGLT1活性達到飽和時，GLUT2能短暫的移動到頂端以節(jié)約能量，從而緩解因 SGLT1活性變化而產(chǎn)生的 Na+梯度的降低［12］。故本研究結(jié)果顯示了，營養(yǎng)限制可能引起胃腸道后段（空腸、回腸和盲腸）內(nèi)葡萄糖濃度降低，從而造成其上皮細(xì)胞中SGLT1活性未達到飽和狀態(tài)，進而使胃腸道后段中GLUT2基因表達量有所降低。

在細(xì)胞模型中，如腸道上皮L型細(xì)胞系，在果糖刺激條件下，GLUT5基因的表達量較高［21］，揭示了果糖在腸道中吸收轉(zhuǎn)運可能是通過GLUT5進行的。這在動物模型進一步得到證實，如敲除GLUT5基因的小鼠無法吸收果糖，說明果糖的吸收轉(zhuǎn)運必須通過GLUT5［22］。鑒于GLUT5基因表達量的升高預(yù)示著果糖轉(zhuǎn)運能力的提升，本研究的結(jié)果其在十二指腸中表達量最高，可以推斷GLUT5轉(zhuǎn)運果糖的主要場所是十二指腸。同時，本研究結(jié)果也揭示了，即使?fàn)I養(yǎng)水平受到限制，GLUT5基因在前段腸道中表達量依然較高，故導(dǎo)致GLUT5基因在盲腸中的表達量顯著降低?？傊?，母羊妊娠后期營養(yǎng)限制將對胃腸道葡萄糖轉(zhuǎn)運載體產(chǎn)生不同程度的影響，故我們可以結(jié)合實際生產(chǎn)需求調(diào)配最佳的飼糧配方，從而提高其生產(chǎn)性能。

4 結(jié) 論

母羊妊娠后期營養(yǎng)限制對胃腸道中葡萄糖轉(zhuǎn)運載體基因表達有不同程度的影響，進而引起母羊機體內(nèi)葡萄糖轉(zhuǎn)運的改變。

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Effects of Nutritional Restriction during Late Gestation on Gene Expressions of Glucose Transporters in Gastrointestinal Tract of Ewes

WU Jian1，2LI Xiaopeng1，2HE Zhixiong1JIAO Jinzhen1TAN Zhiliang1?
（1.Key Laboratory for Agro-Ecological Processes in Subtropical Region，Hunan Provincial Engineering Research Center for Healthy Livestock and Poultry Production，South-Central Experimental Station of Animal Nutrition and Feed Science in Ministry of Agriculture，Institute of Subtropical Agriculture，Chinese Academy of Sciences，Changsha410125，China；2.Graduate University of Chinese Academy of Sciences，Beijing100049，China）

This experiment was conducted to investigate the effects of nutritional restriction during late gestation on gene expressions of glucose transporters in gastrointestinal tract of ewes.TwentyXiangdongblack pregnant goats were chose and randomly assigned to 2 groups：control group（ad libtum）and restricted group（40%restriction of feed intake），and each group had 10 ewes.The pre-trial lasted for 15 d（81 to 95 d of gestation），and the trial lasted for 39 d（96 to 135 d of gestation）.After the trial，ewes were slaughtered to collected mucosa samples of rumen，duodenum，jejunum，ileum and cecum.Real-time PCR analysis was used to determine the gene expression levels of sodium/glucose cotransporter member 1（SGLT1），sodium/glucose cotransporter member 3（SGLT3），facilitated glucose transporter member 2（GLUT2）and facilitated glucose transporter member 5（GLUT5）.The results showed as follows：compared with control group，the expression level ofSGLT1 gene in rumen of restricted group was significantly decreased（P＜0.05），and there was a decreased tendency for that in jejunum and ileum（0.05≤P＜0.10）.The expression level ofGLUT5 gene was significantly decreased in cecum（P＜0.05）；while the expression levels of other glucose transporter genes in gastrointestinal tracts were not significantly different between restricted group and control group（P＞0.05）.Collectively，nutritional restriction has different effects on the expressions of glucose transporter genes located on gastrointestinal tracts，thereby leading to the changes of glucose transport.［Chinese Journal of Animal Nutrition，2017，29（2）：645-651］

late gestation；nutritional restriction；goat；glucose transporter

S826

A

1006-267X（2017）02-0645-07

10.3969/j.issn.1006-267x.2017.02.034

（責(zé)任編輯 王智航）

2016-08-24

中科院外籍青年科學(xué)家計劃（2013Y2GA0010）；國家自然科學(xué)基金（31402105）

吳 建（1991—），男，河北邯鄲人，碩士研究生，從事動物營養(yǎng)與飼料學(xué)研究。E-mail：ibelieveyoucanfly＠163.com

?通信作者：譚支良，研究員，博士生導(dǎo)師，E-mail：zltan＠isa.ac.cn

?Corresponding author，professor，E-mail：zltan＠isa.ac.cn