李旺林， 劉夢鰲， 曹 杰， 楊 平， 鄭曉彬， 董博業(yè)， 盧嘉寶

(廣州醫(yī)科大學附屬廣州市第一人民醫(yī)院胃腸外科，廣東 廣州 510180)

TLR4在LPS誘導的結腸炎癥恢復中的作用*

李旺林△， 劉夢鰲▲， 曹 杰△， 楊 平， 鄭曉彬， 董博業(yè)， 盧嘉寶

(廣州醫(yī)科大學附屬廣州市第一人民醫(yī)院胃腸外科，廣東 廣州 510180)

目的： 研究Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)在結腸炎癥中的作用，探討LPS在炎癥性腸病中的治療作用。方法: 取正常腸上皮細胞進行體外脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)干預培養(yǎng)。采用慢病毒轉染技術，構建TLR4低表達、正常表達及高表達的腸上皮細胞亞組。正常表達組(normal組)及高表達組(high組)培養(yǎng)基中加入LPS誘導細胞炎癥，刺激時間分別為0、2、4 h。Western blot法檢測TLR4的表達；收集細胞上清液，ELISA檢測各亞組細胞炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-8的水平。收集細胞，qPCR檢測細胞因子TNF-α、IL-6、IL-8、IL-10和IL-1β mRNA的表達水平。劃痕試驗觀察對比2組細胞的遷移能力。結果: LPS干預培養(yǎng)細胞后，TLR4的表達量顯著增加(P<0.05)。ELISA和qPCR檢測高表達組與正常表達組組間細胞因子TNF-α、IL-6、IL-8、IL-10和IL-1β的蛋白和mRNA水平的差異均有統計學意義(P<0.05)。劃痕試驗提示TLR4高表達組的細胞遷移能力明顯高于正常對照組。結論: LPS影響TLR4炎癥通路的活化，促進前炎癥因子及輔助刺激分子的釋放，起到調節(jié)炎癥反應的作用。

炎癥性腸?。?Toll樣受體4； 脂多糖

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)是一種多因素導致的腸道非可控性炎癥，近年來在國人中發(fā)病率日益攀升。IBD目前被認為是一種自身免疫性疾病，腸道自身免疫狀況的失控可導致IBD的發(fā)生；反之，腸道免疫狀況的調整也有助于炎性腸病的恢復[1]。TLR4是人體炎癥發(fā)生發(fā)展過程中非常重要的一個受體，諸多研究表明，Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)對炎癥和免疫微環(huán)境有調控的作用[2-3]。TLR4信號轉導通路是目前發(fā)現的重要的炎癥通路之一，與許多疾病的發(fā)生及發(fā)展過程相關。我們的一些前期工作表明，腸道細菌耗竭的小鼠不能從硫酸葡聚糖鈉(dextran sodium sulphate， DSS)誘導的結腸炎癥中恢復。但我們給小鼠補充正常的大腸埃希氏菌后，小鼠能夠從炎癥中恢復過來[4]。證明大腸埃希氏菌有促進結腸炎癥恢復的作用，是結腸炎癥恢復的必需條件之一。內毒素/脂多糖是大腸埃希氏菌胞壁的主要成分，TLR4是介導內毒素/脂多糖 (Lipopolysaccharide，LPS) 應答的最主要受體[5-6]。由此，我們推測TLR4受體在結腸炎癥恢復過程中起著一定的作用。本課題通過體外實驗，研究TLR4對炎癥因子的分泌及結腸上皮遷移能力的影響，探討TLR4在結腸炎癥恢復中的作用及機理。

材 料 和 方 法

1 試劑

抗體(Abcam)；質粒構建(權陽生物)；LPS(Sigma)；DMEM basic培養(yǎng)基(Gibco)；胎牛血清(Gibco)；2×蛋白上樣緩沖液、山羊抗小鼠Ⅱ抗和兔Ⅱ抗(中杉公司)；ELISA試劑盒(上海源葉生物科技公司)。

2 方法

2.1 實驗分組和細胞培養(yǎng) 采用慢病毒轉染技術，構建TLR4低表達(轉染TLR4 siRNA的正常腸上皮細胞，low組)、正常表達(穩(wěn)定轉染空載質粒的正常腸上皮細胞，normal組)及高表達(穩(wěn)定轉染TLR4高表達質粒的正常腸上皮細胞，high組)的腸上皮細胞亞組。正常表達組及高表達組培養(yǎng)基中加入LPS刺激細胞2和4 h。24 h后收集細胞及細胞培養(yǎng)液用于后續(xù)實驗。LPS濃度設定參考前期實驗選用1 mg/L。

2.2 Western blot法檢測TLR4的表達 棄去培養(yǎng)基，PBS洗2～3次，根據細胞量加入500～1 000 μL 1×sample buffer冰上裂解細胞，收蛋白，分光光度儀測濃度；加蛋白變性液98 ℃加熱7 min。電泳分離總蛋白，轉移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，洗膜后放入TLR4抗體(1∶500)中4 ℃過夜。洗膜，放入 Ⅱ 抗(1∶1 000)37 ℃孵育2 h后顯影。

2.3 qPCR檢測TLR4的表達及細胞因子TNF-α、IL-6、IL-8、IL-10、IL-1β 的表達水平 分離純化各組細胞的RNA:棄去培養(yǎng)基，PBS洗2～3次，根據細胞量加入500～1 000 μL TRIzol，刮取收集細胞RNA。加氯仿200 μL,振蕩30 s，冰上靜置5 min，4 ℃、13 000 r/min離心10～15 min，吸上清，每管加異丙醇500 μL，上下顛倒混勻，-20 ℃靜置30 min, 4 ℃、13 000 r/min離心10～15 min，倒掉上清，每管加75%乙醇500 μL，4 ℃、13 000 r/min離心10 min，倒掉上清，4 ℃、13 000 r/min離心1 min，吸去殘余乙醇，放通風櫥晾干至半透明，DEPC水溶解，測濃度。提純RNA后PCR儀上逆轉錄得到cDNA，總反應體積40.0 μL，其中5×buffer 8.0 μL，Primer Mix(引物序列見表1) 2.0 μL，Enzyme Mix 2.0 μL，DEPC H2O 20.0 μL， RNA 4 μL (2.0 μg)。擴增條件為：37 ℃逆轉錄60 min，98 ℃ 5min。加樣至96孔板，加SYBR Green及TLR4、TNF-α、IL-6、IL-8、IL-10、IL-1β、內參照GAPDH引物，置于qPCR儀上檢測。擴增條件為：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s；60 ℃ 1 min, 40個循環(huán)。

F: forward; R: reverse.

2.4 ELISA法檢測TNF-α、IL-6和IL-8的水平 培養(yǎng)液中TNF-α、IL-6和IL-8的檢測均按照ELISA試劑盒說明書進行操作。分別設立空白孔、標準孔、待測樣品孔，加樣后酶標板覆膜，37 ℃孵育90 min，棄液體加生物素化抗體37 ℃溫育1 h，洗板3次加酶結合物工作液37 ℃溫育30 min，洗板5次加底物溶液37 ℃孵育15 min左右加終止液，用酶標儀在450 nm波長測量各孔的吸光度(A)值。制作曲線計算相應炎癥因子的濃度。

2.5 劃痕實驗 將細胞接種于6孔板中。第2天用垂直槍頭比著直尺劃十字。用PBS洗細胞3次，去除劃下的細胞，加入2%血清培養(yǎng)基，放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。按30 min、4 h、16 h、40 h和60 h取樣，拍照。

3 統計學處理

ImageJ和GraphPad Prism 5.0分析軟件進行蛋白顯影后圖像分析及數據處理，SPSS 16.0軟件進行統計學分析，數據用均數±標準差(mean±SD)表示，各組間數據分析采用t檢驗，單因素方差分析或Kruskal-Wallis檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 慢病毒感染

本研究采用的病毒載體，利用抗Puro基因進行篩選，利用增強型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)的表達觀察、評估感染效率為96%。用倒置熒光顯微鏡觀察到感染5 d時EGFP表達達到預期，見圖1。

Figure 1.The cell infection rate of the intestinal epithelial cells was up to 96% (×400).

圖1 慢病毒感染細胞感染率

2 TLR4蛋白表達檢測結果

低表達組、正常組和高表達組的TLR4表達量遞增；LPS干預培養(yǎng)后，normal+LPS組高于正常組，high+LPS組高于高表達組，見圖2、3。

3 qPCR檢測TLR4的mRNA表達量

低表達組、正常組和高表達組TLR4的mRNA表達呈明顯遞增趨勢。LPS干預培養(yǎng)后，normal+LPS組TLR4的mRNA表達量隨刺激時間0 h、2 h和4 h遞增，high+LPS組隨刺激時間0 h、2 h和4 h遞增且高于正常組，見圖4。

4 qPCR檢測細胞因子TNF-α、IL-6、IL-8、IL-10和IL-1β 的mRNA表達結果

在未加LPS刺激時，正常組、低表達組和高表達組的促炎細胞因子TNF-α、IL-6、IL-8和IL-1β的mRNA表達量均表現為低表達組高于高表達組，抑炎細胞因子IL-10低表達組低于高表達組。LPS干預處理后，TNF-α、IL-6、IL-8和IL-1β的mRNA表達量整體表現為normal+LPS組高于high+LPS組，IL-10的表達量則相反；且normal+LPS組與high+LPS組促炎細胞因子TNF-α、IL-6、IL-8和IL-1β的表達量隨著LPS刺激時間的延長整體表現為遞減趨勢，抑制炎癥反應的細胞因子IL-10呈遞增趨勢，見圖5～9。

Figure 2.The protein expression of TLR4 in the intestinal epithelial cells determined by Western blot. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsnormal.

圖2 Western blot 檢測TLR4的表達量

Figure 3.The protein expression of TLR4 in the intestinal epithelial cells stimulated by LPS for different duration determined by Western blot. Mean±SD.n=6.△P<0.05vsnormal+LPS 0 h;#P<0.05vshigh+LPS 0 h;▲P<0.05vsnormal+LPS 2 h;□P<0.05vsnormal+LPS 4 h.

圖3 Western blot 檢測 LPS不同刺激時長對TLR4表達量的影響

Figure 4.The TLR4 mRNA expression in normal group, low expression group and high expression group, and the effects of LPS stimulation for different duration on the mRNA expression of TLR4 detected by qPCR. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsnormal;△P<0.05vsnormal+LPS 0 h;#P<0.05vshigh+LPS 0 h;▲P<0.05vsnormal+LPS 2 h;□P<0.05vsnormal+LPS 4 h.

圖4 qPCR檢測正常組、低表達組和高表達組3組間TLR4 mRNA 表達量以及LPS不同刺激時長對TLR4 mRNA表達量的影響

Figure 5.The TNF-α mRNA expression in normal group, low expression group and high expression group, and the effects of LPS stimulation for different duration on the TNF-α mRNA expression detected by qPCR. Mean±SD.n=6.*P<0.05vshigh;△P<0.05vsnormal+LPS 0 h;#P<0.05vshigh+LPS 0 h;▲P<0.05vsnormal+LPS 2 h;□P<0.05vsnormal+LPS 4 h.

圖5 qPCR檢測正常組、低表達組和高表達組3組間TNF-α mRNA表達量以及LPS不同刺激時長對TNF-α mRNA 表達量的影響

Figure 6.The IL-6 mRNA expression in normal group, low expression group and high expression group, and the effects of LPS stimulation for different duration on the IL-6 mRNA expression detected by qPCR. Mean±SD.n=6.*P<0.05vshigh;△P<0.05vsnormal+LPS 0 h;#P<0.05vshigh+LPS 0 h;▲P<0.05vsnormal+LPS 2 h;□P<0.05vsnormal+LPS 4 h.

圖6 qPCR檢測正常組、低表達組和高表達組3組間IL-6 mRNA表達量以及LPS不同刺激時長對IL-6 mRNA表達量的影響

5 ELISA法檢測炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-8的蛋白表達結果

在未加LPS刺激時正常組、低表達組和高表達組TNF-α、IL-6和IL-8的表達量均表現為低表達組高于高表達組。LPS干預處理后，TNF-α和IL-6、IL-8的蛋白表達量整體表現為normal+LPS組高于high+LPS組，且normal+LPS組與high+LPS組TNF-α、IL-6和IL-8的表達量多少與LPS刺激時間長短無明顯關聯，見圖10～12。

Figure 7.The IL-8 mRNA expression in normal group, low expression group, high expression group, and the effects of LPS stimulation for different duration on the IL-8 mRNA expression detected by qPCR. Mean±SD.n=6.*P<0.05vshigh;△P<0.05vsnormal+LPS 0 h;#P<0.05vshigh+LPS 0 h;▲P<0.05vsnormal+LPS 2 h;□P<0.05vsnormal+LPS 4 h.

圖7 qPCR檢測正常組、低表達組和高表達組3組間IL-8 mRNA表達量以及LPS不同刺激時長對IL-8 mRNA表達量的影響

Figure 8.The IL-10 mRNA expression in normal group, low expression group and high expression group, and the effects of LPS stimulation for different duration on the IL-10 mRNA expression detected by qPCR. Mean±SD.n=6.*P<0.05vshigh;△P<0.05vsnormal+LPS 0 h;#P<0.05vshigh+LPS 0 h;▲P<0.05vsnormal+LPS 2 h;□P<0.05vsnormal+LPS 4 h.

圖8 qPCR檢測正常組、低表達組和高表達組3組間IL-10 mRNA 表達量以及LPS mRNA不同刺激時長對IL-10 mRNA表達量的影響

Figure 9.The IL-1β mRNA expression in normal group, low expression group and high expression group, and the effects of LPS sti-mulation for different duration on the IL-1β mRNA expression detected by qPCR. Mean±SD.n=6.*P<0.05vshigh;△P<0.05vsnormal+LPS 0 h;#P<0.05vshigh+LPS 0 h;▲P<0.05vsnormal+LPS 2 h;□P<0.05vsnormal+LPS 4 h.

圖9 qPCR檢測正常組、低表達組和高表達組3組間IL-1β mRNA 表達量以及LPS不同刺激時長對IL-1β mRNA 表達量的影響

5 劃痕實驗結果

劃痕試驗結果提示TLR4高表達組的細胞遷移能力明顯高于對照組，表明TLR4在結腸恢復中具有一定的促進作用，見圖13。

討 論

IBD目前被認為是一種自身免疫性疾病，腸道自身免疫狀況的失控可導致IBD的發(fā)生；反之，腸道

Figure 10.The TNF-α protein expression in normal group, low expression group and high expression group, and the effects of LPS stimulation for different duration on the TNF-α protein expression detected by ELISA. Mean±SD.n=6.*P<0.05vshigh;△P<0.05vsnormal+LPS 0 h;#P<0.05vshigh+LPS 0 h;▲P<0.05vsnormal+LPS 2 h;□P<0.05vsnormal+LPS 4 h.

圖10 ELISA檢測正常組、低表達組和高表達組3組間TNF-α蛋白表達量以及和LPS不同刺激時長對TNF-α蛋白表達量的影響

Figure 11.The IL-6 protein expression in normal group, low expression group and high expression group, and the effects of LPS stimulation for different duration on the IL-6 protein expression detected by ELISA. Mean±SD.n=6.*P<0.05vshigh;△P<0.05vsnormal+LPS 0 h;#P<0.05vshigh+LPS 0 h;▲P<0.05vsnormal+LPS 2 h;□P<0.05vsnormal+LPS 4 h.

圖11 ELISA檢測正常組、低表達組和高表達組3組間IL-6蛋白表達量以及LPS不同刺激時長對IL-6蛋白表達量的影響

Figure 12.The IL-8 protein expression in normal group, low expression group and high expression group, and the effects of LPS stimulation for different duration on the IL-8 protein expression detected by ELISA. Mean±SD.n=6.*P<0.05vshigh;△P<0.05vsnormal+LPS 0 h;#P<0.05vshigh+LPS 0 h;▲P<0.05vsnormal+LPS 2 h;□P<0.05vsnormal+LPS 4 h.

圖12 ELISA檢測正常組、低表達組和高表達組3組間IL-8蛋白表達量以及LPS不同刺激時長對IL-8蛋白表達量的影響

免疫狀況的調整也有助于炎性腸病的恢復。TLR4是人體炎癥發(fā)生發(fā)展過程中非常重要的一個受體，諸多研究表明，TLR4對炎癥和免疫微環(huán)境有調控的作用。啟動獲得性免疫應答需要雙信號，特異性抗原的刺激和來自抗原提呈細胞的共刺激信號。生理情況下，腸上皮細胞與腸道高濃度的細菌保持共生狀態(tài)。保護宿主不受其侵害的機制存在于多種層次，首要的是腸黏膜屏障的通透性，腸上皮細胞通過

Figure 13.The results of wound healing assay (×50). Mean±SD.n=6.*P<0.05vsnormal.

圖13 劃痕實驗結果

分泌炎癥細胞因子、化學因子、抗菌肽等參與腸道免疫反應[7]。人類和基因突變小鼠模型的研究顯示：腸腔細菌是啟動和加重腸道炎癥的必要因素。腸上皮通過表達Toll樣受體參與對病原體的天然免疫反應[8-9]。由 TLRs 介導不正常的免疫反應可以觸發(fā)或者加重炎癥性疾病的發(fā)生和發(fā)展[10]。TLR信號途徑最終激活核因子κB，調節(jié)血液炎癥介質和細胞因子的表達，起到抗炎免疫調節(jié)的作用[11-12]。盡管該機制對于保護宿主十分重要，但如果過度激活，可能對宿主造成破壞性的后果。炎癥本身是機體組織受損傷時所發(fā)生的一系列保護性應答。因此，在炎癥狀態(tài)下，TLR4引發(fā)的一系列炎癥和免疫反應，可能對機體來說是有利的，可能是促進機體炎癥恢復的有利因素之一。而且，我們的一些前期工作也提示，TLR4受體可能在炎性腸病的恢復中起著一定的作用，TLR4激活劑LPS可能可用于炎性腸病的治療。

本研究通過qPCR法檢測細胞因子TNF-α、IL-6、IL-8和IL-1β 的mRNA表達變化及ELISA法檢測炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-8的蛋白水平發(fā)現，在未加LPS誘導時正常組、低表達組、高表達組的表達量均表現為低表達組高于高表達組，抑制炎癥反應的細胞因子IL-10的表達量呈低表達組低于高表達組。表明在未予以LPS刺激時TLR4表達量增加一定程度上起到了抑制炎癥的作用。進一步研究發(fā)現，LPS誘導處理后，高表達組與對照組均表現為TLR4的表達量隨著LPS刺激時間的延長呈遞增趨勢，表明LPS可以激活TLR4并使其表達量增加。炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-8的表達量整體均表現為高表達組+LPS組低于正常+LPS組，表明LPS在一定程度上影響TLR4炎癥通路的活化表現為抑制炎癥的進展，并且在TLR4表達量較高時更為明顯。正常+LPS組與高表達+LPS組qPCR結果提示促進炎癥反應的細胞因子TNF-α、IL-6、IL-8、IL-1β和INF-γ 的表達量隨著LPS刺激時間的延長整體表現為遞減趨勢，抑制炎癥反應的細胞因子IL-10呈遞增趨勢。而ELISA結果TNF-α、IL-6和IL-8的表達量隨著LPS刺激時間的延長表現的趨勢并不統一，表明LPS對炎癥進展的作用是隨著其用量及作用時長的變化而變化的。腸上皮損傷修復可能包括2個不同的過程。腸黏膜損傷修復包括細胞增殖、遷移、分化等環(huán)節(jié)，首先是損傷的腸上皮脫落，臨近區(qū)域的完好細胞向損傷區(qū)遷移。然后細胞通過增殖補償損傷脫落的細胞使腸上皮維持正常的厚度，細胞遷移是腸黏膜損傷修復的重要環(huán)節(jié)，腸黏膜損傷修復早期主要依賴于細胞遷移以重新封閉表面的損傷[13-14]。TLR4高表達組的細胞遷移能力明顯高于對照組，而遷移能力的增強是有利于腸上皮恢復的,表明TLR4在結腸恢復中具有一定的促進作用。研究發(fā)現TLR4受體在結腸炎癥恢復過程中起著一定的作用，TLR4受體引發(fā)的一系列炎癥和免疫反應，可能對機體來說是有利的，可能是促進機體炎癥恢復的有利因素之一。

本研究證實，LPS影響TLR4炎癥通路的活化，促進促炎因子及輔助刺激分子的釋放，起到調節(jié)炎癥反應的作用，并且在一定程度上起到了促進炎癥恢復的作用。但研究僅在體外環(huán)境下進行，人體內的復雜環(huán)境是否對TLR4活性產生影響，并且現在對TLR4信號通路機制的認識仍有許多不明之處，因此還需要大量研究來證明。

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(責任編輯： 林白霜， 羅 森)

Role of TLR4 in process of colonic inflammation recovery induced by LPS

LI Wang-lin, LIU Meng-ao, CAO Jie, YANG Ping, ZHENG Xiao-bin, DONG Bo-ye, LU Jia-bao

(GastrointestinalSurgeryDepartment,GuangzhouFirstPeople’sHospital,GuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou510180,China.E-mail: 421255910@qq.com)

AIM: To study the roles of Toll-like receptor 4 (TLR4) and TLR4 activator lipopolysaccharide (LPS) in colonic inflammation recovery. METHODS: Normal intestinal epithelial cells were cultured with LPSinvitro. The subgroups of the intestinal epithelial cells with differential expression of TLR4 (low, normal and high) were constructed by the technique of lentivirus transfection. The cells with normal and high expression of TLR4 were induced by LPS for 0 h, 2 h and 4 h. Inflammatory cytokines TNF-α, IL-6 and IL-8 in the culture supernatant were detected by ELISA. The mRNA levels of TNF-α, IL-6, IL-8, IL-10 and IL-1β were detected by qPCR. The cell mobility was also monitored by wound healing assay. RESULTS: The protein expression of TLR4 was significantly higher after LPS treatment than that in control groups of both cells with TLR4 normal and high expression (P<0.05). The inflammatory cytokines TNF-α, IL-6, IL-8 and IL-1β at mRNA and protein levels were also significantly increased after LPS treatment compared with control group (P<0.05). The protein levels of TNF-α, IL-6 and IL-8 between the 2 groups were also different with statistical significance (P<0.05). Higher mobility was observed in the cells with TLR4 high expression compared to control cells. CONCLUSION: LPS induction might play a role in the activation of TLR4-mediated inflammatory pathways by up-regulating the expression of inflammatory cytokines at both transcriptional and translational levels.

Inflammatory bowel disease; Toll-like receptor 4; Lipopolysaccharide

1000- 4718(2017)02- 0336- 08

2016- 09- 09

2016- 12- 30

廣州市科技計劃(No. 2014Y2-00074)； 廣東省自然科學基金資助項目(No. 2015A030313729)

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.02.023

雜志網址： http://www.cjpp.net

△通訊作者 Tel: 020-81048253; E-mail: 421255910@qq.com

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