陳 君， 焦德敏， 唐夏莉， 王 劍， 李 優(yōu)， 陳清勇

(中國人民解放軍第一一七醫(yī)院呼吸內(nèi)科，浙江 杭州 310004)

姜黃素通過下調(diào)nectin-4抑制肺癌PC-9細胞的遷移和侵襲*

陳 君， 焦德敏， 唐夏莉， 王 劍， 李 優(yōu)， 陳清勇△

(中國人民解放軍第一一七醫(yī)院呼吸內(nèi)科，浙江 杭州 310004)

目的： 探討姜黃素對肺癌PC-9細胞遷移和侵襲的抑制作用及其與nectin-4表達的關系。方法: 用MTT、劃痕修復和Transwell小室實驗檢測姜黃素對肺癌PC-9細胞活力、遷移和侵襲能力的影響；用Western blot技術檢測姜黃素對nectin-4表達及AKT通路的影響；經(jīng)siRNA干擾nectin-4后觀察姜黃素對PC-9細胞活力、遷移、侵襲及AKT通路的影響。結(jié)果:姜黃素能抑制PC-9細胞活力，10、20 μmol/L姜黃素組與對照組相比,劃痕修復率降低，穿膜細胞數(shù)目顯著下降。姜黃素作用肺癌PC-9細胞24 h后,nectin-4表達下調(diào)。轉(zhuǎn)染siNectin-4 48 h和72 h后，siNectin-4組比對照組的細胞活力顯著降低(P<0.01)，劃痕修復率及穿膜細胞數(shù)目顯著下降(P<0.01)。姜黃素與siNectin-4均抑制了PC-9細胞AKT通路的激活。姜黃素與siNectin-4聯(lián)用時，細胞活力降低(P<0.01)，劃痕修復率、細胞侵襲能力及AKT磷酸化水平下降。結(jié)論: 在肺癌PC-9細胞中，姜黃素通過下調(diào)nectin-4表達、調(diào)控下游AKT通路來抑制細胞遷移和侵襲。

姜黃素； 肺癌； 細胞遷移； 細胞侵襲； Nectin-4

肺癌的發(fā)病率和死亡率居于惡性腫瘤的首位，近50年來肺癌的發(fā)生率和死亡率均明顯升高。肺癌轉(zhuǎn)移是引起肺癌患者死亡的主要原因，如何抑制肺癌轉(zhuǎn)移是目前肺癌治療需要解決的重要問題。姜黃素(curcumin, Cur)是一種姜黃根莖中分離提取出來的天然小分子多酚化合物，具有廣泛的藥理作用。近年來，大量文獻報道姜黃素對多種癌細胞均有抑制其增殖、遷移和侵襲的作用[1-4]。我們以往的研究也發(fā)現(xiàn)姜黃素可調(diào)節(jié)抑制Rho家族的Cdc42和Rac通路影響肺癌細胞骨架重排，抑制肺癌細胞的侵襲和遷移[5-6]。Nectin家族屬于免疫球蛋白細胞黏附分子，nectins和afadin組成的細胞間黏附系統(tǒng)在腫瘤細胞的粘附和侵襲中發(fā)揮重要作用。近年來的研究發(fā)現(xiàn)外源性nectin-4的表達將通過激活Rac通路提高COS-7 和 NIH-3T3細胞的絲狀偽足形成率和侵襲能力，且非小細胞肺癌患者血清中的nectin-4含量比健康人高，nectin-4可作為肺癌的發(fā)展轉(zhuǎn)移過程中新型的血清學和組織學標志物[7]。但是nectin-4是否參與姜黃素對肺癌轉(zhuǎn)移的抑制過程尚不清楚。

本研究以肺癌PC-9 細胞為研究對象，通過不同濃度姜黃素處理和nectin-4 RNA干擾技術來檢測兩者抑制肺癌PC-9 細胞的遷移和侵襲的能力，并從中尋找兩者的關系。

材 料 和 方 法

1 材料

肺腺癌細胞株PC-9購自ATCC細胞庫；姜黃素、MTT和二甲基亞砜(DMSO)均購自Sigma；小牛血清購自Gibco；1640培養(yǎng)基和牛血清白蛋白購自杭州吉諾公司；轉(zhuǎn)染試劑采用Lipofectamine 2000購自Invitrogen；BCA試劑盒購自凱基生物；抗nectin-4抗體購自R&D；抗磷酸化及總AKT抗體購自CST；抗GAPDH抗體購自Abcam；HRP標記的II抗購自Jackson ImmunoResearch；ECL化學發(fā)光試劑盒購自Pierce。蛋白質(zhì)電泳和轉(zhuǎn)膜設備和酶標儀購自Bio-Rad。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 細胞在含有10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。采用0.25% 胰酶+0.02% EDTA溶液消化細胞。選用生長情況良好的對數(shù)生長期細胞進行實驗。Nectin-4 siRNA (siNectin-4)由上海吉瑪公司合成，經(jīng)前期實驗[8]，選用干擾效果最佳序列，上游序列為5’-CAGCAGAUGACCCAGAAAUTT-3’，下游序列為3’-AUUUCUGGGUCAUCUGCUGTT-5’。

2.2 MTT實驗測試細胞活力 將對數(shù)生長期細胞經(jīng)胰酶消化后配成4×107/L濃度的細胞懸液，每孔100 μL接入96孔板。細胞24 h貼壁后，進行實驗，復孔5個。檢測時，每孔換液加入100 μL 5 g/L MTT，37 ℃孵育4 h，棄上清，每孔加入150 μL DMSO，振蕩使沉淀充分溶解，酶標儀490 nm檢測吸光度(A)值。

2.3 Western blot實驗 處理完成的細胞用裂解液提取蛋白，使用BCA試劑盒按說明書測試蛋白濃度并配制樣品，上樣20 μg。SDS-PAGE及轉(zhuǎn)膜，用含5%牛血清白蛋白的TBST封閉目的蛋白，常溫封閉2 h，TBST洗膜。 I 抗按抗體說明書使用碧云天 I 抗稀釋液稀釋后4 ℃孵育過夜，TBST洗膜5 min×3次， II 抗用封閉液稀釋合適比例后37 ℃孵育2 h，TBST洗膜3次后用ECL法對目的蛋白進行發(fā)光，在凝膠成像系統(tǒng)中拍照，GAPDH作為內(nèi)參照。用ImageJ軟件測試目的蛋白條帶的灰度值進行分析。

2.4 劃痕修復實驗 處理過的細胞在12孔板中培養(yǎng)，第2天用10 μL槍頭沿直線在孔底劃線，PBS清洗2次，加入含相應姜黃素濃度或不含姜黃素的2.5%血清的新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)，在倒置顯微鏡下拍照(×100)，在劃痕邊緣等距量取距離，培養(yǎng)24 h后，再拍照同樣位置量取距離。劃痕修復率(%)=(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。

2.5 Transwell小室實驗 加藥或轉(zhuǎn)染后的細胞用無血清培養(yǎng)基消化配成1.5×108/L的細胞懸液，鋪好Matrigel的上室中每孔加入200 μL細胞懸液，下室加入700 μL含有相應濃度藥物的1640培養(yǎng)基(10%血清)。培養(yǎng)箱內(nèi)培育12 h后，PBS清洗小室2次，冰甲醇固定細胞20 min后風干，1‰ 結(jié)晶紫染色30 min，清水清洗小室3次，棉簽輕輕吸干上室水分，倒置顯微鏡下拍照(×100)。用ImageJ計算細胞數(shù)目。

3 統(tǒng)計學處理

所有實驗均重復3 次，實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，采用SPSS Statistics 22進行數(shù)據(jù)分析。使用GraphPad Prism 5制圖。多組間比較應用單因素方差分析，組間兩兩比較應用Bonferroni 檢驗，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 姜黃素抑制PC-9細胞活力、遷移和侵襲

姜黃素處理PC-9細胞72 h后，MTT實驗結(jié)果顯示10～40 μmol/L姜黃素均能抑制PC-9細胞的生長，抑制率分別是(23.93±1.82)%、(58.97±3.21)%、(76.19±5.61)%和(76.44+3.47)%，隨著給藥劑量的增加，姜黃素對肺癌細胞的生長抑制作用顯著增強(P<0.01)，見圖1A。劃痕修復實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，姜黃素10 μmol/L和20 μmol/L組劃痕愈合率分別下降了(13.32±4.40)%和(47.22±2.71)%(P<0.05)，表明姜黃素能抑制PC-9細胞的遷移，見圖1B。Transwell小室實驗結(jié)果顯示，對照組、姜黃素10 μmol/L組和姜黃素20 μmol/L組侵襲至Transwell小室濾膜下表面的細胞數(shù)分別為110±6、69±3和51±4，姜黃素10 μmol/L和20 μmol/L組較對照組細胞穿膜數(shù)目顯著下降(P<0.01)，表明姜黃素能抑制PC-9細胞的侵襲，見圖1C。

Figure 1. The growth inhibition rate, migration and invasion of PC-9 cells treated with curcumin (Cur). A: the growth inhibition rate of PC-9 cells after curcumin treatment; B: the migration of PC-9 cells after curcumin 10 μmol/L and 20 μmol/L treatment; C: the invasion of PC-9 cells after curcumin 10 μmol/L and 20 μmol/L treatment. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol.

圖1 姜黃素對PC-9細胞活力、遷移和侵襲的作用

2 姜黃素下調(diào)nectin-4蛋白的表達

Western blot檢測結(jié)果顯示，10、20、30和40 μmol/L姜黃素作用肺癌PC-9細胞24 h后，nectin-4蛋白的表達均顯著下降(P<0.01)，見圖2。

3 干擾nectin-4抑制PC-9細胞活力、遷移和侵襲

通過前期實驗[8]，我們選取干擾效果最佳的基因片段，構(gòu)建siNectin-4。Western blot檢測結(jié)果顯示,與對照組相比，siNectin-4組的nectin-4蛋白表達明顯下降(P<0.01),見圖3A。MTT實驗結(jié)果顯示siNectin-4分別轉(zhuǎn)染PC-9細胞6 h、24 h、48 h和72 h后，細胞活力與對照組相比分別下降了(2.98±5.11)%、(4.59±11.46)%、(29.31±9.73)%和(90.66±19.02)%，轉(zhuǎn)染48 h和72 h后，siNectin-4組與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，表明干擾nectin-4能抑制PC-9細胞活力，見圖3B。劃痕修復實驗結(jié)果顯示,與對照組相比，siNectin-4組的劃痕愈合率下降了(28.76±5.66)%，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，表明siNectin-4能抑制PC-9細胞的遷移，見圖3C。Transwell小室實驗結(jié)果顯示,與對照組相比，siNectin-4組侵襲至Transwell小室濾膜下表面的細胞數(shù)顯著下降(P<0.01)，表明siNectin-4能抑制PC-9細胞的侵襲，見圖3D。

Figure 2. The protein levels of nectin-4 in the PC-9 cells after curcumin (Cur) treatment. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol.

圖2 姜黃素作用對PC-9細胞中nectin-4蛋白表達的影響

4 姜黃素和干擾nectin-4均能抑制AKT通路

10～40 μmol/L濃度姜黃素均能抑制PC-9細胞AKT的磷酸化(P<0.01)，siNectin-4也抑制了PC-9細胞的AKT磷酸化(P<0.01)，總AKT表達無明顯差異，見圖4。

5 姜黃素與siNectin-4聯(lián)合對PC-9細胞活力、遷移、侵襲及AKT通路的影響

siNectin-4與姜黃素合用后，細胞活力、劃痕修復率、細胞遷移及侵襲能力均較單用姜黃素組下降(P<0.01)。同時檢測它們AKT通路磷酸化的變化，發(fā)現(xiàn)與姜黃素單用組比較，siNectin-4與姜黃素合用明顯抑制AKT通路磷酸化，見圖5。

Figure 3. The viability, migration and invasion of the PC-9 cells transfected with siNectin-4. A: the protein levels of nectin-4 in the PC-9 cells transfected with siNectin-4; B: the viability of the PC-9 cells transfected with siNectin-4; C: the migration of PC-9 cells transfected with siNectin-4; D: the invasion of the PC-9 cells transfected with siNectin-4. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsNC.

圖3 干擾nectin-4的表達對PC-9細胞活力、遷移和侵襲作用的影響

Figure 4.The phosphorylation level of AKT in the PC-9 cells treated with curcumin (Cur) or transfected with siNectin-4. A: the protein levels of p-AKT in the PC-9 cells after curcumin treatment; B: the protein levels of p-AKT in the PC-9 cells transfected with siNectin-4. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsNC.

圖4 姜黃素與siNectin-4分別對PC-9細胞AKT磷酸化水平的影響

討 論

姜黃素具有抗氧化、抗衰老及抗腫瘤的作用。以往的研究從多個方面闡釋了姜黃素的抗腫瘤機制[9]，例如在肺癌H460、A427和A549細胞中，姜黃素通過激活p53上調(diào)miR-192-5p和miR-215表達，下調(diào)靶基因XIAP，從而促進細胞凋亡[10]；姜黃素能通過抑制Rac1/PAK1信號通路降低MMP-2和MMP-9表達，抑制肺癌801D細胞的遷移和侵襲[5]；姜黃素還可通過抑制AKT/mTOR/p70S6K通路誘導自噬和抑制細胞毒性[11]。在乳腺癌MDA-MB-231細胞中，Soung等[12]發(fā)現(xiàn)姜黃素抑制了由EGF引起的整合素α6β4位置的變化，從而抑制了細胞的增殖和絲狀偽足形成。本實驗結(jié)果表明，姜黃素能下調(diào)細胞黏附分子nectin-4表達并通過AKT途徑抑制肺癌PC-9細胞的活力、遷移和侵襲。

Nectins是Ca2+依賴的免疫球蛋白樣細胞間黏附分子，該家族成員通過afadin和細胞骨架聯(lián)系，調(diào)控細胞運動[13]。Nectin-4是該家族研究較為清楚的一個分子，nectin-4與nectin-1可通過V域相互傳動作用[14]。Honda等[15]報道nectins通過激活Cdc42和Rac使JNK通路活化。 Kanzaki等[16]也發(fā)現(xiàn)nectins可以調(diào)控血小板源性生長因子受體(platelet-derived growth factor receptor,PDGFR)及其下游通路，影響成纖維細胞的生長過程。我們前期實驗[8]表明，降低nectin-4的表達將抑制肺癌A549和PC-9細胞的遷移和侵襲能力，說明nectin-4在肺癌細胞生長中起到關鍵作用，nectin-4可成為預測肺癌轉(zhuǎn)移的生物標志物。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)nectin-4 參與PC-9細胞的生長和遷移過程。因此，nectins作為調(diào)控細胞黏附的重要分子，可能是腫瘤細胞的遷移和侵襲的重要靶點。

為進一步明確姜黃素與nectin-4之間的關系，還需要通過動物水平來研究nectin-4抑制腫瘤的功能。目前，Pavlova等[17]已證實干擾nectin-4能抑制小鼠體內(nèi)腫瘤生長，乳腺癌SUM190細胞中nectin-4促進了不貼壁細胞中的細胞間接觸組裝，與整合素 β4相互作用并持續(xù)激活了Src家族激酶。Dipon等[18]則進一步研究nectin-4與5-FU耐藥的關系，發(fā)現(xiàn)nectin-4通過PI3K-AKT通路增強結(jié)腸癌細胞對5-FU的耐藥性，而該通路與肺癌細胞的增殖、遷移和侵襲緊密相關[19]。與該機制類似，我們通過Western blot實驗發(fā)現(xiàn)姜黃素抑制了nectin-4蛋白的表達，且同時抑制了肺癌PC-9細胞的活力、遷移、侵襲及AKT通路的磷酸化，與干擾nectin-4后的表現(xiàn)一致。進一步我們發(fā)現(xiàn)姜黃素與干擾nectin-4聯(lián)用時，細胞活力、遷移、侵襲能力及AKT磷酸化水平更低，這些結(jié)果說明姜黃素抑制肺癌PC-9細胞生長、遷移的細胞機制與下調(diào)nectin-4有關，姜黃素可能是通過下調(diào)nectin-4來抑制細胞活力、遷移、侵襲。

不過，本研究發(fā)現(xiàn)在肺癌PC-9細胞中，干擾nectin-4不僅能抑制細胞活力，而且可以抑制細胞遷移與侵襲，這個結(jié)果與Pavlova等[17]提出在乳腺癌SUM190細胞中nectin-4未引起EMT變化和轉(zhuǎn)移變化的結(jié)果有所不同，我們認為不同的結(jié)果可能與不同細胞有關。

Figure 5. The effects of curcumin (Cur) treatment and transfection with siNectin-4 on the viability, migration, invasion and AKT phosphorylation in the PC-9 cells. A: the viability of the PC-9 cells transfected with siNectin-4 and treated with curcumin; B: the migration of the PC-9 cells transfected with siNectin-4 and treated with curcumin; C: the invasion of the PC-9 cells transfected with siNectin-4 and treated with curcumin; D: the protein levels of p-AKT in the PC-9 cells transfected with siNectin-4 and treated with curcumin. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsNC+Cur 10 μmol/L;##P<0.01vsNC+Cur 20 μmol/L.

圖5 姜黃素與干擾Nectin-4聯(lián)合應用對PC-9細胞的活力、遷移、侵襲及AKT磷酸化水平的影響

總之，本研究發(fā)現(xiàn)了姜黃素與干擾nectin-4具有同樣的抑制肺癌PC-9細胞活力、遷移、侵襲和AKT磷酸化的能力，姜黃素能降低nectin-4蛋白的表達，姜黃素與干擾nectin-4聯(lián)合應用使細胞活力、遷移、侵襲能力及AKT磷酸化水平更低，推測姜黃素抑制細胞活力、遷移、侵襲與下調(diào)nectin-4有關，nectin-4可能是姜黃素抑制腫瘤的途徑之一。研究結(jié)果為姜黃素抑制腫瘤細胞生長的機制提供了新思路，為nectin-4作為新的肺癌轉(zhuǎn)移治療的靶向分子提供了實驗證據(jù)。

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(責任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Curcumin inhibits migration and invasion of lung cancer PC-9 cells via down-regulation of nectin-4 expression

CHEN Jun, JIAO De-min, TANG Xia-li, WANG Jian, LI You, CHEN Qing-yong

(DepartmentofRespiratoryMedicine,The117thHospitalofPLA,Hangzhou310004,China.E-mail:cqyong117@163.com)

AIM: To investigate the effects of curcumin on the abilities of migration and invasion in the lung cancer PC-9 cells, and to observe the relationship between curcumin and nectin-4 expression. METHODS: The viability, migration and invasion of lung cancer PC-9 cells treated with curcumin or transfected with siNectin-4 were measured by MTT assay, wound healing test and Transwell assay, respectively. The protein levels of nectin-4, p-AKT and AKT in the PC-9 cells treated with curcumin or transfected with siNectin-4 were detected by Western blot. RESULTS: Curcumin inhibited the viability of PC-9 cells. The wound healing rates and the numbers of the transmembrane cells in curcumin 10 μmol/L and 20 μmol/L groups were decreased compared with control group without curcumin treatment. The expression level of nectin-4 was reduced after curcumin treatment for 24 h. The viability of the PC-9 cells was significantly inhibited after transfected with siNectin-4 for 48 h or 72 h (P<0.01), and the wound healing rates was decreased in siNectin-4 group compared with NC group (P<0.01). The numbers of the transmembrane cells in siNectin-4 group was significantly reduced (P<0.01). Curcumin and knockdown of nectin-4 suppressed the activation of AKT pathway in PC-9 cells. In siNectin-4+curcumin group, the cell viability reduced compared with curcumin group, and wound healing rates, cell invasive ability and AKT phosphorylation levels were decreased. CONCLUSION: Curcumin inhibits migration and invasion of the lung cancer PC-9 cells via down-regulation of nectin-4 expression and inhibition of AKT pathway.

Curcumin; Lung cancer; Cell migration; Cell invasion; Nectin-4

1000- 4718(2017)02- 0271- 07

2016- 08- 20

2016- 10- 19

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計劃(No.2011KYA139)；浙江省科技廳公益性技術應用研究計劃(No.2014C33277)；杭州市科技發(fā)展計劃(No.20130633B29; No.20140633B40)；浙江省自然科學基金資助項目(No.LY12H16001)

R730.23

A

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