任安立， 李靖凱， 周冬冬

(焦作市人民醫(yī)院胸外科， 河南 焦作 454002)

程序化細胞死亡因子5對缺氧/復氧誘導的心肌細胞凋亡和自噬的影響及機制

任安立△， 李靖凱， 周冬冬

(焦作市人民醫(yī)院胸外科， 河南 焦作 454002)

目的： 探討程序化細胞死亡因子5(PDCD5)對缺氧/復氧(H/R)誘導的心肌細胞凋亡和自噬的影響及其作用機制。方法：以H9c2心肌細胞系為研究對象，建立H/R損傷模型，采用RNA干擾方法抑制PDCD5的表達，MTT法檢測心肌細胞的存活率，TUNEL顯色法檢測細胞凋亡率，RT-qPCR和Western blot法分別檢測mRNA和蛋白的表達水平。結果：H/R損傷的H9c2心肌細胞中，PDCD5表達水平升高，同時細胞的存活率降低，細胞凋亡率和自噬水平增加。而PDCD5沉默能夠增加細胞存活率，同時減少細胞凋亡率，促進Bax表達，且抑制抑Bcl-2、LC3-II/LC3-I及自噬相關蛋白beclin-1的表達。此外，沉默PDCD5可通過降低p-P65的蛋白水平抑制NF-κB通路。結論：沉默PDCD5通過阻斷NF-κB信號通路而抑制H/R損傷誘導的心肌細胞凋亡和自噬，從而保護心肌細胞。

心肌細胞； 缺氧/復氧損傷； 程序化細胞死亡因子5； 細胞凋亡； 自噬

心肌缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)損傷是缺血性心臟病臨床治療中最常見的一種病理損害，可加重心肌結構破壞和心功能障礙，是影響缺血性心臟病臨床治療及預后的重要因素[1]。細胞的凋亡和自噬存在于心肌I/R過程中，在缺血初期主要起保護作用，再灌注期則加重細胞損傷，導致細胞死亡[2]。細胞凋亡和自噬被認為與心肌I/R損傷密切相關[3-4]。

程序化細胞死亡因子5(programmed cell death 5，PDCD5)是來自于TF21細胞克隆的基因，能夠促進不同凋亡誘導因素觸發(fā)的細胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，PDCD5與心血管系統(tǒng)多種疾病相關，在心肌梗死[5]、心肌細胞氧化應激[6]及大鼠心肌I/R[7]等病理生理過程中表達明顯上調。有研究報道PDCD5通過抑制心肌重塑而改善心臟功能[8]。然而PDCD5在心肌細胞缺氧/復氧(hypoxia/reoxygenation，H/R)損傷誘導的凋亡和自噬中的作用及機制目前尚未見報道。本實驗建立體外心肌細胞H/R模擬在體心肌細胞I/R，觀察PDCD5對H/R誘導的心肌細胞自噬和凋亡的影響及其可能機制，為后期研究心臟缺血、缺氧狀態(tài)下心肌細胞凋亡和自噬的相互關系奠定基礎。

材 料 和 方 法

1 材料

大鼠H9c2心肌細胞系(北京協(xié)和細胞庫)；PDCD5小干擾RNA系列(si-PDCD5)和陰性對照(negative control,NC)小干擾RNA系列(si-NC)和PCR引物由上海生物工程有限公司合成；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清(HyClone)； LipofectamineTM2000轉染試劑(Invitrogen)；TRIzol試劑盒、RT-PCR試劑盒和SYBR Green Premix Ex TaqTM(TaKaRa)；RIPA裂解液、BCA蛋白質定量試劑盒(碧云天生物技術有限公司)；PVDF膜(Millipore)；增強化學發(fā)光(enhanced chemiluminescence，ECL)試劑盒(Santa Cruz)；MTT和DMSO(Sigma)；TUNEL檢測試劑盒(Promega)。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng) H9c2細胞置于10% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(37 ℃ 、5%CO2)中培養(yǎng)。細胞每2～3 d換液1次。當細胞匯合至約90%時，用2.5 g/L胰蛋白酶消化傳代，采用第3～4代細胞進行實驗。

2.2 H/R模型建立及實驗分組 用5% CO2和95% N2混合氣飽和1 h的模擬缺氧液(無糖無血清的DMEM培養(yǎng)基)置換H9c2心肌細胞正常培養(yǎng)基，在含5% CO2和95% N2的37 ℃密閉培養(yǎng)箱中缺氧培養(yǎng)4 h，再將5% CO2和95%空氣飽和的模擬復氧液(含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基)置換缺氧液，置于正常條件下培養(yǎng)4 h即復氧。將H9c2心肌細胞隨機分為正常對照(control)組(細胞正常培養(yǎng)，不做任何處理)、H/R組(細胞缺氧4 h復氧4 h處理)、H/R+ si-NC組(細胞轉染陰性對照siRNA后經H/R處理)和H/R+si-PDCD5組(細胞轉染PDCD5 siRNA后經H/R處理)。

2.3 siRNA轉染 H9c2細胞接種于6孔板中，待細胞生長達60%～70%匯合時，采用LipofectamineTM2000根據(jù)操作步驟將si-PDCD5和si-NC轉染至H9c2細胞，6 h后換成正常培養(yǎng)基培養(yǎng)。48 h后收集細胞，通過Western blot實驗檢測PDCD5蛋白水平來驗證干擾細胞株的構建是否成功。

2.4 RT-qPCR實驗 采用TRIzol提取細胞總RNA，酶標儀檢測RNA的濃度。用反轉錄試劑盒合成cDNA，以cDNA為模板，應用ABI 7500型定量PCR儀，通過SYBR Green試劑檢測目的基因的表達水平。PDCD5的上游引物序列為5’-GGAAGCAG-AAATGAGAACAG-3’，下游引物為5’-TTAGTAATCA-TCATCTTCATC-3’；GAPDH的上游引物為5’-CCACAGTCCATGCCATCACT-3’，下游引物為5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3’。反應參數(shù)為：94 ℃ 2 min；94 ℃ 45 s、62.2 ℃ 45 s、72 ℃ 2 min，40個循環(huán)；72 ℃ 8 min。每組設置3個復孔，以GAPDH作為內參照，目的基因的相對表達水平根據(jù)2-ΔΔCt法計算。

2.5 Western blot實驗檢測蛋白水平 收集各組細胞，RIPA裂解液裂解細胞，離心提取總蛋白，BCA試劑盒檢測蛋白濃度。10% SDS-PAGE分離蛋白。將蛋白轉移至PVDF膜，5%脫脂奶粉緩沖液封閉液室溫封閉2 h，漂洗后分別加入對應Ⅰ抗(PDCD5、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Bax、Bcl-2、beclin-1、p-P65、P65和GAPDH抗體)，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜5 min、3次， Ⅱ抗室溫孵育1 h，TBST洗膜，使用ECL顯色試劑顯影、掃描，采用軟件Quantity One V4.62分析。

2.6 MTT法檢測細胞存活率 取對數(shù)生長期細胞接種于96孔板中，接種密度為1×108/L，每組設5個復孔。處理結束后向每孔分別加入20 μL的MTT溶液，于CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h。棄上清，每孔加入150 μL的DMSO震蕩培養(yǎng)10 min，待藍色結晶體充分溶解，用酶標儀測定490 nm波長處吸光度值。

2.7 脫氧核糖核酸末端轉移酶介導的缺口末端標記(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling，TUNEL)法檢測心肌細胞凋亡 各組心肌細胞于4%甲醛固定，采用TUNEL凋亡試劑盒檢測凋亡心肌細胞，陰性對照不加TDT酶，以核陽性(細胞核呈黃褐色)為判定標準。顯微鏡下觀察，各組隨機選取10個高倍視野計數(shù)，分別統(tǒng)計每個視野細胞核總數(shù)及凋亡陽性細胞核數(shù)，最后計算心肌細胞凋亡指數(shù)(apoptotic index，AI)：AI(%)=凋亡陽性細胞核數(shù)/總細胞核數(shù)×100%。

3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 16.0 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，應用Graph Pad Prism 5 軟件作圖。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 H/R對H9c2細胞中PDCD5表達水平的影響

RT-qPCR和Western blot檢測結果顯示H9c2細胞經H/R處理后，PDCD5的mRNA和蛋白水平均明顯增加(P<0.05)。由此表明PDCD5在H/R損傷的H9c2細胞中高表達，此結果與前期研究結果一致[7]。為研究PDCD5在心肌細胞H/R損傷中的作用，采用RNA干擾的方法沉默PDCD5基因，結果發(fā)現(xiàn)轉染si-PDCD5后，PDCD5蛋白表達的水平顯著下降(P<0.05)，提示si-PDCD5能夠有效沉默H9c2細胞PDCD5基因，見圖1。

Figure 1.The expression of PDCD5 in H/R-induced H9c2 cells. The mRNA (A) and protein (B) expression of PDCD5 was detected by RT-qPCR and Western blot, respectively. The transfection efficiency of si-PDCD5 (C) was determined by Western blot. Mean±SD.n=4.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsH/R+si-NC.

圖1 H/R對H9c2細胞中PDCD5表達水平的影響

2 PDCD5對H/R誘導的心肌細胞存活率的影響

采用MTT法檢測心肌細胞存活率，結果如圖2所示。H/R損傷后細胞存活率明顯降低(P<0.05)，沉默PDCD5可顯著提高細胞的存活率(P<0.05)，提示敲減PDCD5可以減輕H/R誘導的H9c2細胞損傷。

3 PDCD5對H/R誘導的心肌細胞凋亡的作用

進一步采用TUNEL檢測心肌細胞凋亡率，結果顯示，H/R組相比對照組凋亡率明顯升高(P<0.05)，而PDCD5下調能夠降低H/R誘導的心肌細胞凋亡率(P<0.05)。采用Western blot實驗檢測凋亡相關蛋白Bax和Bcl-2的表達水平顯示，H/R損傷的心肌細胞中，促凋亡蛋白Bax的表達明顯上升，抑凋亡蛋白Bcl-2明顯下調。沉默PDCD5可顯著抑制Bax的表達，同時促進Bcl-2表達。綜合以上結果說明敲減PDCD5抑制H/R誘導的心肌細胞凋亡，見圖3。

Figure 2.Silence ofPDCD5 suppressed H/R-induced cell viability in the H9c2 cells detected by MTT assay. Mean±SD.n=4.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsH/R+si-NC.

圖2 沉默PDCD5的可抑制H/R誘導的心肌細胞損傷

Figure 3.Knockdown ofPDCD5 inhibited H/R-induced cell apoptosis in the H9c2 cells. A: the TUNEL assay was used to determine the apoptosis of H9c2 cells; B: the protein expression of Bax and Bcl-2 was detected by Western blot. Mean±SD.n=4.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsH/R+si-NC.

圖3 沉默PDCD5可抑制H/R誘導的心肌細胞凋亡

4 PDCD5對H/R誘導心肌細胞自噬的作用

通過Western blot實驗檢測細胞中LC3-II和LC3-I的表達比例及自噬相關蛋白beclin-1表達水平判斷心肌細胞的自噬情況，結果如圖4所示。H/R誘導的心肌細胞中LC3-II/LC3-I及beclin-1蛋白水平顯著升高，而沉默PDCD5可明顯降低LC3-II/LC3-I比值并下調beclin-1的表達，由此表明敲減PDCD5能夠抑制H/R誘導的心肌細胞的自噬水平。

Figure 4.Knockdown ofPDCD5 decreased H/R-induced cell autophagy in the H9c2 cells. The protein expression of LC3-II/LC3-I and beclin-1 was determined by Western blot. Mean±SD.n=4.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsH/R+si-NC.

圖4 沉默PDCD5可抑制H/R誘導的心肌細胞自噬

5 PDCD5對H/R誘導心肌細胞中NF-κB通路的影響

Western blot結果顯示H/R損傷的細胞中p-P65的蛋白水平上調，而沉默PDCD5則明顯抑制p-P65的蛋白水平。以上結果表明沉默PDCD5可抑制NF-κB通路，見圖5。

Figure 5.Knockdown ofPDCD5 prevented the activity of NF-κB signaling in the H9c2 cells under H/R injury. The protein level of p-P65 and P65 was determined by Western blot. Mean±SD.n=4.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsH/R+si-NC.

圖5 沉默PDCD5可抑制H/R誘導的心肌細胞中的NF-κB通路

討 論

I/R誘導的心肌損傷是一種復雜的多因素病理生理過程，往往伴隨著心肌細胞的壞死、凋亡以及自噬。心肌細胞H/R可在一定程度上模擬心肌I/R損傷，研究證實H/R可誘導心肌細胞凋亡和自噬。

心肌細胞凋亡增加和生存率降低是I/R誘導的心肌損傷、梗死后病理性心肌重塑、心力衰竭等疾病發(fā)生的重要機制。本實驗的結果表明H/R抑制心肌細胞的生存率，誘導細胞凋亡；PDCD5沉默使得細胞生存率升高，降低細胞凋亡率。I/R心肌細胞凋亡的發(fā)生是在多種凋亡相關基因的調控下進行的，目前bcl-2和bax被認為是最重要的細胞凋亡相關基因[9]。已有研究表明Bcl-2蛋白通過抑制caspase-3的活性從而抑制細胞凋亡。而Bax蛋白雖為Bcl-2家族蛋白成員，其功能卻與Bcl-2蛋白相反，具有促凋亡作用[10]。進一步檢測PDCD5對凋亡相關蛋白表達的影響，結果顯示H/R損傷的心肌細胞中Bax表達上調，Bcl-2表達下調。抑制PDCD5表達能夠降低H/R誘導的Bax的表達，同時升高Bcl-2表達水平。上述結果表明H/R可誘導心肌細胞凋亡，沉默PDCD5的表達能夠抑制H/R誘導的心肌細胞凋亡。

隨著研究的深入，研究人員逐漸發(fā)現(xiàn)H/R不僅能夠引起心肌細胞的壞死和凋亡，還可引發(fā)心肌細胞自噬。自噬相關蛋白beclin-1是細胞自噬發(fā)生所必須的蛋白。諸多研究表明，I/R過程中心肌自噬表達增強，并和凋亡之間存在緊密聯(lián)系，如Bcl-2表達下調不僅可以誘發(fā)凋亡，而且可通過激活beclin-1來激活自噬[11]。有研究表明心肌細胞I/R損傷后能夠產生大量的活性氧，從而誘導beclin-1大量表達，進而增加細胞的自噬水平[12]。因而通過抑制beclin-1的表達能夠抑制細胞的自噬作用。本研究發(fā)現(xiàn)，H/R損傷可誘使心肌細胞beclin-1上調，證實H/R可誘發(fā)細胞自噬，而沉默PDCD5的表達能夠抑制beclin-1表達。綜合以上結果表明沉默PDCD5的表達能夠抑制H/R誘導的心肌細胞的自噬。

NF-κB信號通路不僅能夠調節(jié)細胞死亡的2個經典途徑即壞死和凋亡，還與自噬途徑密切相關，同時還可調節(jié)與凋亡相關的蛋白Bcl-2和Bax的表達[13]。NF-κB通路激活能夠導致I/R所誘導的心肌炎證反應、凋亡、壞死及心功能下降[14]。NF-κB通路在自噬和凋亡途徑中具有重要作用[15]。有研究報道NF-κB參與I/R誘導的自噬體的形成，抑制NF-κB的活性對于I/R誘導的自噬過表達及損傷的心肌細胞具有保護作用[13]。本研究結果顯示H/R可激活NF-κB信號通路，而沉默PDCD5能夠阻斷NF-κB通路，進而通過調節(jié)凋亡相關基因bcl-2和bax及自噬相關基因LC3-II/LC3-I和beclin-1的表達水平，從而參與H/R誘導的心肌細胞凋亡及自噬過程。

綜上所述，沉默PDCD5可通過阻斷NF-κB通路抑制H/R誘導的心肌細胞的凋亡和自噬，從而發(fā)揮心肌保護作用，這可能為預防和治療心肌缺血再灌注損傷提供新策略。

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(責任編輯： 陳妙玲， 余小慧)

Effects of PDCD5 on hypoxia/reoxygenation-induced autophagy and apoptosis of cardiomyocytes

REN An-li, LI Jing-kai, ZHOU Dong-dong

(DepartmentofThoracicSurgery,ThePeople’sHospitalofJiaozuoCity,Jiaozuo454002,China.E-mail:anliren66@163.com)

AIM: To investigate the influence of programmed cell death 5 (PDCD5) on apoptosis and autophagy in the cardiomyocytes exposed to hypoxia/reoxygenation (H/R) and its potential mechanism. METHODS: H9c2 cells were exposed to H/R. PDCD5 was downregulated by RNA interference. The cell viability was measured by MTT assay. TUNEL assay was used to detect cell apoptosis. The mRNA and protein levels were determined by RT-qPCR and Western blot. RESULTS: The expression of PDCD5 was upregulated in the cardiomyocytes after H/R injury. Furthermore, H/R injury obviously reduced the cell viability and enhanced the apoptosis and autophagy of the cardiomyocytes. However, knockdown ofPDCD5 increased the cell viability, and attenuated H/R-induced apoptosis, accompany with reduction of Bax and augment of Bcl-2 expression. Additionally, silencingPDCD5 markedly inhibited H/R-induced autophagy by regulating the expression of LC3-II/LC3-I and beclin-1. Moreover, downregulation ofPDCD5 suppressed NF-κB signaling by redu-cing the protein level of p-P65. CONCLUSION: SilencingPDCD5 suppresses H/R-induced H9c2 cells apoptosis and autophagy by blocking NF-κB signaling pathway. The result indicates a new strategy for the prevention and treatment of myocardial I/R injury.

Cardiomyocytes; Hypoxia/reoxygenation; Programmed cell death 5; Apoptosis; Autophagy

1000- 4718(2017)02- 0251- 06

2016- 09- 19

2016- 10- 21

R363； R542.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.02.010

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