劉建紅 孟慶剛 胡佳卉 石康樂(lè)

(青海大學(xué)，青海 西寧 810016)

黃芪甲苷對(duì)早期骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶-1表達(dá)的影響

劉建紅 孟慶剛1胡佳卉1石康樂(lè)1

(青海大學(xué)，青海 西寧 810016)

目的 探討黃芪甲苷作用于早期骨關(guān)節(jié)炎退變軟骨細(xì)胞后基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-1表達(dá)的變化。方法 采用四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT)檢測(cè)不同濃度黃芪甲苷作用不同時(shí)間關(guān)節(jié)炎退變軟骨細(xì)胞的存活率；qRT-PCR法檢測(cè)黃芪甲苷不同濃度不同作用時(shí)間處理關(guān)節(jié)炎退變軟骨細(xì)胞后MMP-1 基因表達(dá)情況；酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測(cè)黃芪甲苷處理關(guān)節(jié)炎退變軟骨細(xì)胞后細(xì)胞上清液中 MMP-1的表達(dá)；Western印跡檢測(cè)黃芪甲苷處理后MMP-1蛋白表達(dá)。結(jié)果 黃芪甲苷處理后關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞存活率提高，20～100 mmol/L濃度內(nèi)呈劑量依賴，黃芪甲苷用量100 mmol/L效果最佳；隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞的存活率增加，在12 h～3 d內(nèi)，第3天達(dá)到存活率最高。與對(duì)照組未經(jīng)黃芪甲苷處理的軟骨細(xì)胞相比，黃芪甲苷處理后的細(xì)胞中MMP-1基因表達(dá)量下降，黃芪甲苷濃度20～60 mmol/L，培養(yǎng)2 d內(nèi)，MMP-1基因的表達(dá)量與黃芪甲苷的作用濃度與作用時(shí)間呈負(fù)相關(guān)；100 mmol/L時(shí)，第2天時(shí)MMP-1基因表達(dá)量最低。ELISA結(jié)果顯示正常軟骨組織中MMP-1少量表達(dá)，關(guān)節(jié)炎軟骨組織中MMP-1的濃度為正常組織中的2倍，處理后正常軟骨組織中 MMP-1濃度并未發(fā)生變化，黃芪甲苷處理后的關(guān)節(jié)炎軟骨組織中MMP-1濃度降低為處理前的0.5倍，但仍高于正常軟骨組織中MMP-1的濃度。Western印跡檢測(cè)結(jié)果顯示正常軟骨組織中MMP-1蛋白少量表達(dá)，關(guān)節(jié)炎軟骨組織中MMP-1蛋白大量表達(dá)，與對(duì)照組相比，黃芪甲苷處理后軟骨組織中MMP-1蛋白表達(dá)量降低，但仍高于正常骨組織。結(jié)果 黃芪甲苷抑制早期骨關(guān)節(jié)炎退變軟骨細(xì)胞與MMP-1表達(dá)下降相關(guān)。

黃芪甲苷；關(guān)節(jié)炎;退變軟骨細(xì)胞；基質(zhì)金屬蛋白酶-1

膝骨關(guān)節(jié)炎(KOA)是一種慢性退行性骨關(guān)節(jié)病,關(guān)節(jié)軟骨發(fā)生改變、關(guān)節(jié)間隙變小，從而引發(fā)骨質(zhì)增生等疾病〔1〕。關(guān)節(jié)軟骨的胞外基質(zhì)由Ⅱ型膠原組成，主要支持和保護(hù)細(xì)胞〔2〕?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是廣泛存在于軟骨中的蛋白酶家族,能降解關(guān)節(jié)軟骨的胞外基質(zhì),當(dāng)發(fā)生KOA時(shí),軟骨組織局部MMPs表達(dá)量升高，破壞細(xì)胞外基質(zhì)的平衡狀態(tài),導(dǎo)致軟骨逐漸出現(xiàn)糜爛、潰瘍?cè)錾纫幌盗型诵行宰兓?〕。黃芪甲苷屬于豆科草本植物黃芪的干燥提取物，具有抗腫瘤、增強(qiáng)免疫、促進(jìn)生長(zhǎng)等功效。有研究表明黃芪甲苷能夠抑制MMPs活性，延緩KOA的臨床癥狀〔4〕。本文采用不同濃度的黃芪甲苷對(duì)骨關(guān)節(jié)炎(OA)退變軟骨細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，研究黃芪甲苷處理后對(duì)軟骨細(xì)胞MMP-1表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 軟骨細(xì)胞來(lái)自青海大學(xué)附屬醫(yī)院收集的10例早期KOA患者的軟骨組織。試劑及儀器：黃芪甲苷(Solarbio)，胎牛血清(FBS，杭州沃森生物技術(shù)有限公司)，雙抗、DEME(Gibco公司)，MTT(南京都萊生物技術(shù)有限公司)，CO2培養(yǎng)箱(德國(guó)IRM公司)，Annexin-FITC、Propidiuym Iodide(上海勱瑞生物科技有限公司)，二抗：辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記IgG(上海研卉生物科技有限公司)，Triton-100細(xì)胞裂解液膜蛋白試劑盒(TIANGEN公司)，胰蛋白酶(Sigma公司)，MMP-1 ELISA 試劑盒(R&D Systems公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將患者的軟骨組織置于加入雙抗的磷酸鹽緩沖液(PBS)中清洗3次，用無(wú)菌剪刀剪成1 mm3的組織塊，放入培養(yǎng)皿中，加入含10% FBS的DEME培養(yǎng)液中，37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后更換新培養(yǎng)液，待細(xì)胞數(shù)目增殖至80%，除去上層的培養(yǎng)液，用PBS溶液清洗，加入0.25%胰酶溶液，室溫消化5 min終止細(xì)胞生長(zhǎng)，加入DEME培養(yǎng)液后將細(xì)胞吹打混勻，800 r/min離心5 min，收集細(xì)胞，按照1∶3比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2.2 四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT)檢測(cè)軟骨組織細(xì)胞活性 取對(duì)數(shù)期的細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，加入100 μl 10%FBS的DEME培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)分為五組，每三孔為一組，分別接入不同濃度黃芪甲苷進(jìn)行處理：對(duì)照組加入DEME培養(yǎng)液；另外4組分別加入20、40、60、100 mmol/L的黃芪甲苷，均培養(yǎng)1 d。二氧化碳培養(yǎng)箱培育1 d，加入20 μl MTT,37℃反應(yīng)4 h，800 r/min離心5 min，小心吸取上清，加入200 μl二甲基亞砜(DMSO),室溫反應(yīng)10 min，570 nm下進(jìn)行OD值測(cè)定。按照公式：(OD樣品-OD空白)/OD空白×100%計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.2.3 MTT法檢測(cè)軟骨組織細(xì)胞的最佳培養(yǎng)時(shí)間 根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)，選取最佳黃芪甲苷濃度進(jìn)行培養(yǎng)，方法同上，分別培養(yǎng)12 h、1、2、3 d。采用MTT法測(cè)定其細(xì)胞存活率。

1.2.4 采用qRT-PCR法檢測(cè)MMP-1 基因表達(dá)情況 按照黃芪甲苷作用細(xì)胞的最佳濃度及培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行細(xì)胞的培養(yǎng)，對(duì)照組不加黃芪甲苷。反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行細(xì)胞膜RNA的提取，反轉(zhuǎn)錄為cDNA,設(shè)計(jì)MMP-1 基因qRT-PCR引物，上游：AGAGCAAGATGTGGAGATGG，下游：CTTGACAGGTCTGGTGTGTA，以甘油醛-3-磷酶脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參，上游引物：TGATCCATTCATTGACCTCC;下游：GTTCACGCCCATCACAAACA，反應(yīng)體系：SYBRTM Premix Ex TaqⅡ 10 μl，DEPC水8 μl，上游引物0.5 μl，下游引物0.5 μl，各種不同處理的cDNA模板1 μl。在Bio-Red熒光定量PCR儀上按照反應(yīng)程序：94℃ 3 min；95℃ 10 s；60℃ 20 s；72℃ 20 s；40個(gè)循環(huán)進(jìn)行反應(yīng)，采用2-ΔΔCT算法進(jìn)行基因表達(dá)的數(shù)據(jù)分析。

1.2.5 ELISA 法檢測(cè)細(xì)胞上清液中 MMP-1的表達(dá) 將試劑盒中的標(biāo)準(zhǔn)樣品(濃度：10 000 pg/ml) 稀釋2、4、8、16、32倍，同時(shí)將MMPs抗體、過(guò)氧化物酶復(fù)合物稀釋100倍，實(shí)驗(yàn)分為6組，對(duì)照組只加待測(cè)樣品，實(shí)驗(yàn)組為不同梯度的標(biāo)準(zhǔn)品加100 μl的細(xì)胞上清液。37℃反應(yīng)1.5 h，加入MMPs抗體稀釋液100 μl，37℃反應(yīng)1 h，反應(yīng)結(jié)束后加入PBS溶液漂洗3次，加入100 μl ABC工作液，對(duì)照組不加，37℃反應(yīng)30 min，PBS溶液漂洗3次，每孔加入顯色液90 μl，黑暗條件下反應(yīng)20 min，加入四甲基聯(lián)苯胺(TMB)終止顯色液，450 nm測(cè)定OD值。

1.2.6 檢測(cè)黃芪甲苷處理后MMP-1的蛋白表達(dá) 對(duì)反應(yīng)后的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞膜蛋白的提取，采用二喹啉甲酸(BCA)法測(cè)定蛋白濃度，對(duì)照組不加黃芪甲苷處理。配制12.5%分離膠與5%濃縮膠，保證每孔蛋白上樣量保持一致，Marker 2.5 μl，樣品在濃縮膠時(shí)電壓為80 V，進(jìn)入分離膠后電壓調(diào)至120 V，待反應(yīng)結(jié)束后，將蛋白凝膠置于PBS中漂洗3次，每次10 min，在4℃過(guò)夜進(jìn)行NC轉(zhuǎn)膜，反應(yīng)結(jié)束后在含5%脫脂牛奶的PBS中進(jìn)行過(guò)夜封閉，加入 PBS稀釋的一抗，4℃過(guò)夜，PBS洗滌3次，每次約10 min，加入PBS稀釋后的二抗，4℃過(guò)夜，PBS清洗3次，采用熒光掃描儀進(jìn)行掃描，保存實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、Pearson相關(guān)性分析。

2 結(jié) 果

2.1 MTT法檢測(cè)不同濃度黃芪甲苷處理后細(xì)胞的存活率 與對(duì)照組〔(27.36±4.57)%〕相比，黃芪甲苷處理后關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞存活率提高，在20～100 mmol/L濃度范圍內(nèi)與黃芪甲苷作用濃度呈劑量依賴，20 mmol/L存活率為(32.56±5.62)%，40 mmol/L為(40.52±5.38)%，60 mmol/L為(47.36±6.42)%，100 mmol/L效果最佳(62.43±6.48)%。

2.2 MTT法檢測(cè)軟骨組織細(xì)胞的最佳培養(yǎng)時(shí)間 隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞的存活率增加，在12 h～3 d內(nèi)，第3天達(dá)到存活率最高〔(49.68±5.76)%〕，12 h為(27.69±4.23)%，1 d為(33.75±5.28)%，2 d為(42.71±4.68)%，對(duì)照組為(24.75±3.74)%，黃芪甲苷第3天對(duì)病變軟骨細(xì)胞治療效果最佳。

2.3 黃芪甲苷處理后細(xì)胞內(nèi)MMP-1基因表達(dá)情況 與對(duì)照組相比，黃芪甲苷處理后的細(xì)胞中MMP-1基因表達(dá)量均下降，MMP-1基因的表達(dá)量隨著黃芪甲苷的作用濃度與作用時(shí)間的增加而下降。100 mmol/L時(shí)，第2天時(shí)MMP-1基因表達(dá)量最低，第3天時(shí)有上升的趨勢(shì)，有可能是黃芪甲苷的使用濃度過(guò)高導(dǎo)致。見(jiàn)表1。

2.4 ELISA 法檢測(cè)細(xì)胞上清液中 MMP-1的表達(dá) 未進(jìn)行處理的軟骨組織中，正常軟骨組織中MMP-1少量表達(dá)，關(guān)節(jié)炎軟骨組織中MMP-1的濃度為正常組織中的2倍，處理后正常軟骨組織中 MMP-1濃度并未發(fā)生變化，黃芪甲苷處理后的關(guān)節(jié)炎軟骨組織中MMP-1濃度降低為處理前的0.5倍，但仍高于正常軟骨組織中MMP-1的濃度。見(jiàn)表2。

表1 黃芪甲苷處理后細(xì)胞內(nèi)MMP-1基因表達(dá)±s)

與對(duì)照組比較：1)P<0.01，2)P<0.05

表2 黃芪甲苷處理后細(xì)胞上清液中 MMP-1 濃度的變化

與對(duì)照組比較：1)P<0.01 ，與正常軟骨組織組比較：2)P<0.05

2.5 Western印跡檢測(cè)黃芪甲苷處理后MMP-1的蛋白表達(dá) 正常軟骨組織中MMP-1少量表達(dá)，關(guān)節(jié)炎軟骨組織中MMP-1蛋白大量表達(dá)，與對(duì)照組相比，黃芪甲苷處理后軟骨組織中MMP-1蛋白表達(dá)量降低，但仍高于正常骨組織。見(jiàn)圖1。

a：正常軟骨組織；b：關(guān)節(jié)炎軟骨組織；c：黃芪甲苷處理后的軟骨組織圖1 黃芪甲苷處理后MMP-1蛋白表達(dá)

3 討 論

KOA主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)軟骨改變、軟骨組織受到損害、骨質(zhì)增生，常見(jiàn)于老年人群中，發(fā)病時(shí)關(guān)節(jié)腫痛，甚至難以行走，目前還沒(méi)有能夠較好地治療KOA的藥物，經(jīng)常用的藥物為非甾體抗炎藥(NSAIDS)。雖然NSAIDS治療KOA起到很好的消炎作用，但是藥物的副作用很大。近年來(lái)中藥治療KOA取得了較好的成就，如獨(dú)活寄生湯、姜黃素等。黃芪甲苷具有降壓、增強(qiáng)免疫、抑制骨組織磨損等功效〔5〕，湯曉晨等〔6〕研究表明黃芪甲苷能夠抑制退變軟骨細(xì)胞合成白細(xì)胞介素(IL)-1β，降低軟骨細(xì)胞退變的速度。孟祥奇等〔7〕研究表明黃芪甲苷通過(guò)升高軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原(ColⅡ)及ACAN的表達(dá)進(jìn)而降低KOA關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞衰變的速度。KOA主要是由于軟骨細(xì)胞合成減少而凋亡過(guò)度，與正常細(xì)胞的凋亡不同，細(xì)胞凋亡加速會(huì)導(dǎo)致軟骨組織和細(xì)胞的破壞〔8〕，丁輝等〔9〕研究表明在OA晚期沉默調(diào)節(jié)因子(SIRT)1表達(dá)量升高使軟骨細(xì)胞凋亡率升高進(jìn)而破壞骨組織。因此，抑制OA軟骨組織細(xì)胞的過(guò)度凋亡，是延緩KOA加劇的一種方法。本研究結(jié)果表明黃芪甲苷處理后OA軟骨組織細(xì)胞存活率提高，與黃芪甲苷作用濃度呈劑量依賴，并隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，表明黃芪甲苷能夠通過(guò)抑制OA退變軟骨細(xì)胞的死亡，延緩骨組織的破壞。MMPs參與機(jī)體正常生理活動(dòng)如分娩、乳腺退化、傷口修復(fù)、骨組織吸收等〔10〕，MMPs升高會(huì)導(dǎo)致很多疾病的發(fā)生，如動(dòng)脈粥樣化、骨肉瘤等，在軟骨組織局部MMPs表達(dá)量升高破壞細(xì)胞外基質(zhì)的平衡狀態(tài),導(dǎo)致軟骨逐漸出現(xiàn)糜爛、潰瘍?cè)錾纫幌盗型诵行宰兓?1〕。研究發(fā)現(xiàn)MMPs在正常機(jī)體內(nèi)表達(dá)量較低，當(dāng)關(guān)節(jié)發(fā)生炎癥或病變時(shí)，MMPs表達(dá)量迅速上升，并激活大量酶原降解細(xì)胞外基質(zhì)，使骨組織發(fā)生損傷〔12〕。有研究表明，在KOA組織中，MMP-1高度表達(dá)，可能參與細(xì)胞基質(zhì)ColⅡ型膠原降解，且表達(dá)量越高，軟骨組織退變程度越嚴(yán)重〔13〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，正常軟骨組織中MMP-1也表達(dá)，在KOA軟骨組織中，MMP-1大量表達(dá)，黃芪甲苷作用后其表達(dá)量下降，并與作用時(shí)間和作用濃度呈負(fù)相關(guān)，而且黃芪甲苷治療KOA與MMP-1蛋白下調(diào)相關(guān)。ELISA 原理主要是使酶標(biāo)記的抗原抗體反應(yīng)在固相表面檢測(cè)特異性抗原或抗體。反應(yīng)后待測(cè)物發(fā)生顏色變化，利用酶標(biāo)儀測(cè)定待測(cè)物的量與底物的量相關(guān)〔14〕。ELISA 檢測(cè)OA患者滑液中蛋白多糖(PG)的含量高于正常骨組織，透明質(zhì)酸(HA)含量低于正常組；檢測(cè)KOA患者和正常人血清IL-1和IL-6含量，KOA患者的IL-1和IL-6含量高于正常人，進(jìn)而推測(cè)KOA患者的病情程度〔15〕。

綜上所述，本研究結(jié)果表明黃芪甲苷能夠抑制OA退變軟骨組織細(xì)胞MMP-1的表達(dá)，進(jìn)而抑制MMP類金屬降解酶對(duì)軟骨組織細(xì)胞外基質(zhì)的破壞，從而降低骨組織的損傷，減緩OA。本文只是從細(xì)胞生物學(xué)的角度進(jìn)行基礎(chǔ)性研究，對(duì)于其分子機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

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〔2016-03-26修回〕

(編輯 袁左鳴)

國(guó)家自然科學(xué)基金(No.81473800)

1 北京中醫(yī)藥大學(xué)

孟慶剛(1964-)，男，博士，教授，主要從事中醫(yī)基礎(chǔ)研究。

劉建紅(1972-)，女，碩士，副教授，主要從事中西醫(yī)結(jié)合研究。

R394.2

A

1005-9202(2017)03-0532-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.03.005