孫永慧+趙靜+孫楠

[摘要]目的 建立健腰通顆粒中黃芪甲苷的含量測定方法。方法 以高效液相色譜法測定健腰通顆粒中黃芪甲苷的含量，采用Diamonsil C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；流動相為乙腈-水（30∶70）；流速：1.0 ml/min；柱溫：40℃；蒸發(fā)光散射檢測器參數(shù)中氮氣流量：2.5 L/min；漂移管溫度：105℃。結(jié)果 黃芪甲苷進(jìn)樣量在0.56～4.20 μg（r=0.9994）范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。加樣回收率為95.83%（RSD為1.39%，n=5）。結(jié)論 本含量測定法重復(fù)性和精密度良好，結(jié)果可靠準(zhǔn)確，可作為該制劑質(zhì)量的檢測方法。

[關(guān)鍵詞]健腰通顆粒；黃芪甲苷；高效液相色譜法；含量測定

[中圖分類號] R927.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-4721（2016）11（c）-0140-03

[Abstract]Objective To establish the method for the determination of astragaloside Ⅳ in Jianyaotong Granules.Methods HPLC was used the quality of astragaloside Ⅳ in Jianyaotong Granules，analytical column was Diamonsil C18 （4.6 mm×250 mm，5 μm）.Mobile phase was Acetonitrile-Water（30∶70）.Flow rate was 1.0 ml/min，the parameter of ELSD detector：the flow rate of N2 was 2.5 L/min；the temperature of drift tube was 105℃.Results The linear range of astragaloside Ⅳ was from 0.56 to 4.20 μg（r=0.9994）.The average recovery was 95.83%（RSD=1.39%，n=5）.Conclusion This method is proved to be sensitive and reliable.It can be the quality detection method of Jianyaotong Granules.

[Key words]Jianyaotong Granules；Astragaloside Ⅳ；HPLC；Content determination

健腰通顆粒是由黃芪、雞血藤、骨碎補、桑寄生、牛蒡子、補骨脂、三七、淫羊霍、水蛭、鹿茸等多種中藥組成的復(fù)方制劑。具有疏筋養(yǎng)血，補腎益氣，強腰健腎的功效。用于腰間盤突出，腰椎增生及頸腰綜合癥，具有良好的治療效果。黃芪是該制劑中起主要作用的藥物，本實驗以高效液相色譜（HPLC）法對健腰通顆粒中黃芪甲苷進(jìn)行了含量測定[1-14]，以控制該制劑的質(zhì)量。

1儀器與試藥

Waters 2695-2998型高效液相色譜儀（Waters公司，Empower工作站）；蒸發(fā)光散射檢測器（Alltech 2000型，奧泰克公司）；BP221S型電子天平（德國賽多利斯公司）；健腰通顆粒（批號：20150301，20150302，2015 0303），由黑河市中醫(yī)院制劑室生產(chǎn)；黃芪甲苷對照品（批號：110781-201209）， 從中國藥品生物制品檢定所購得。甲醇（色譜純，迪馬公司）；D101型大孔吸附樹脂（天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，批號：20140510）；三氯甲烷（天津化學(xué)試劑廠，批號：20150915）；正丁醇（天津化學(xué)試劑廠，批號：20151020）；氨水（天津化學(xué)試劑廠，批號：20151201）；無水乙醇（天津化學(xué)試劑廠，批號：20151208）；甲醇（天津化學(xué)試劑廠，批號：20150815）。

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件

色譜柱型號：Diamonsil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：乙腈-水（30∶70）；流速為1.0 ml/min；蒸發(fā)光散射檢測器參數(shù)中氮氣流量：2.5 L/min；漂移管溫度：105℃；柱溫是40℃。此分離檢測條件下，供試品中黃芪甲苷色譜峰與其它色譜峰分離度良好，基線平穩(wěn)，陰性制劑無干擾，HPLC色譜圖見圖1。

2.2供試品溶液的制備

取健腰通顆粒（批號：20150301）3袋，粉碎，取粉末25 g，精密稱定，置索氏提取器中，加三氯甲烷適量，加熱回流2 h。棄去三氯甲烷提取液，濾紙筒揮干三氯甲烷，再加甲醇適量，加熱回流4 h。甲醇提取液回收溶劑并濃縮至干，殘渣加水20 ml，稍微水浴加熱攪拌使溶解，室溫放冷，用水飽和的正丁醇振搖提取4次，40 ml/次。正丁醇提取液合并，用氨試液振搖洗滌2次，40 ml/次，棄去氨試液，正丁醇提取液蒸干，殘渣加水10 ml使溶解。水液通過D101型大孔吸附樹脂柱（內(nèi)徑1.5 cm，裝入樹脂高12 cm），用水50 ml洗脫，棄去水洗脫液，再用40%乙醇30 ml洗脫，棄去洗脫液，繼續(xù)用70%乙醇80 ml洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加甲醇適量使溶解并轉(zhuǎn)移至5 ml量瓶中，加入甲醇定容至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過，得健腰通顆粒待測供試品溶液。

2.3黃芪甲苷對照品溶液的制備

取黃芪甲苷對照品約3 mg，精密稱定，置于10 ml容量瓶中，加色譜甲醇至刻度，振搖使溶解混勻，得每1 ml含0.28 mg的黃芪甲苷對照品溶液。

2.4線性關(guān)系的考察

取黃芪甲苷對照品溶液分別進(jìn)樣2、5、8、10、12、15 μl，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，以進(jìn)樣量微克數(shù)的自然對數(shù)為橫坐標(biāo)，以黃芪甲苷色譜峰面積的自然對數(shù)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程為：Y=1.6418 X+10.9741（r=0.9996），提示黃芪甲苷對照品的進(jìn)樣量在0.56～4.20 μg有良好的線性關(guān)系，可以用外標(biāo)兩點法進(jìn)行含量測定。

2.5精密度試驗

取黃芪甲苷對照品溶液，吸取5 μl，連續(xù)進(jìn)樣6次，測得黃芪甲苷對照品色譜峰面積的RSD值為1.97%，結(jié)果表明精密度良好。

2.6穩(wěn)定性試驗

取健腰通顆粒供試品溶液，在7個不同時間點進(jìn)樣測定，分別是：0、2、4、6、8、10、12 h，每次精密進(jìn)樣20 μl，結(jié)果健腰通顆粒的供試品溶液在12 h之內(nèi)測定，黃芪甲苷峰面積數(shù)值是穩(wěn)定的，RSD=2.56%。

2.7重復(fù)性試驗

取同一批健腰通顆粒，粉碎后稱取6份，每份約25 g，精密稱定，按照“2.2”項下方法提取制備供試品溶液。分別精密吸取黃芪甲苷對照品溶液5 μl、10 μl以及供試品溶液20 μl，按照前述色譜條件進(jìn)樣，測定，以外標(biāo)兩點法對數(shù)方程計算供試品中黃芪甲苷的含量。結(jié)果測得黃芪甲苷含量分別為0.0328、0.0336、0.0351、0.0343、0.0358、0.0353 mg/g，平均值為0.0345 mg/g（RSD=3.24%），結(jié)果顯示本藥含量測定方法有較好的重復(fù)性。

2.8加樣回收率試驗

取同一批健腰通顆粒供試品，粉碎，分別取細(xì)粉6份，每份約12.5 g，精密稱定重量，在每份供試品細(xì)粉中分別加入黃芪甲苷對照品0.42 mg（精密吸取濃度為0.28 mg/ml的黃芪甲苷對照品溶液1.5 ml），按照前述“2.2”供試品溶液制備項下的方法進(jìn)行提取以及進(jìn)行含量測定見表1。

五份健腰通顆粒供試品的平均加樣回收率為94.79%（RSD=1.46%）。結(jié)果顯示該藥回收率較高，測定方法可靠。

2.9供試品測定

取三批健腰通顆粒（批號：20140901，20140902， 20140903）各3份，粉碎，每份取約25 g，精密稱定重量，按照前面2.2項下供試品溶液制備方法操作，得到待測黃芪甲苷含量的健腰通顆粒供試品溶液。分別精密吸取黃芪甲苷對照品溶液5、10 μl以及供試品溶液20 μl，按照前述方法進(jìn)樣、測定、計算供試品中黃芪甲苷的含量，見表2。

結(jié)果顯示，三批健腰通顆粒中黃芪甲苷含量平均為0.0373 mg/g，按平均值80%制訂健腰通顆粒中黃芪甲苷含量[15]，每克健腰通顆粒中黃芪甲苷含量應(yīng)≥0.03 mg。

3討論

本方中黃芪起主要作用，其主要成分為黃芪甲苷和毛蕊異黃酮葡萄糖苷等，本試驗通過測定該藥中黃芪甲苷的含量來控制該制劑的質(zhì)量。含量測定參考《中國藥典》2015年版一部“黃芪”藥材[含量測定]項下的方法[1]，并參考文獻(xiàn)[2-14]，采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法進(jìn)行測定，根據(jù)實際色譜分離效果調(diào)整流動相乙腈-水的比例，在乙腈-水（30∶70）時黃芪甲苷色譜峰分離度良好，保留時間適宜，且陰性對照無干擾，是該制劑黃芪甲苷含量測定最優(yōu)的色譜條件。

蒸發(fā)光散射檢測器用于測定黃芪甲苷的含量，重復(fù)性、靈敏度、穩(wěn)定性均能符合含量測定的要求。本試驗對漂移管溫度、霧化器溫度、流動相流速以及載氣流速等試驗參數(shù)進(jìn)行了研究試驗、優(yōu)化調(diào)整。本試驗的最終優(yōu)化條件：流動相為乙腈-水（30∶70），流速為1.0 ml/min，柱溫為40℃，蒸發(fā)光蒸發(fā)溫度為105℃，載氣（氮氣）流速為2.5 L/min。

綜上所述，本黃芪甲苷含量測定方法快速、靈敏、簡便，精密度、線性、重復(fù)性、穩(wěn)定性以及加樣回收率均符合要求，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，重復(fù)性好，可用于健腰通顆粒的質(zhì)量控制。

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（收稿日期：2016-08-29 本文編輯：顧雪菲）