王慶學(xué)+韓琳

[摘要]目的 建立腦血疏口服液中黃芪甲苷的含量測(cè)定方法。方法 采用高效液相色譜法（HPLC）定量分析腦血疏口服液中黃芪甲苷的含量。色譜柱：Shimadzu UVP-ODS（5 μm，250 mm×4.6 mm）；十八烷基鍵合硅膠為填充劑；流動(dòng)相：乙腈-水（17：33）。理論板數(shù)按黃芪甲苷峰計(jì)應(yīng)≤4000。結(jié)果 黃芪甲苷的進(jìn)樣量在1.78～24.92 μg呈良好的線性關(guān)系，r=0.9998；平均回收率為101.02%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）=4.03%，在常溫下8 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。結(jié)論 HPLC法簡(jiǎn)便快速、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好、結(jié)果可靠，該黃芪甲苷含量測(cè)定法可作為控制腦血疏口服液質(zhì)量的方法。

[關(guān)鍵詞]腦血疏口服液；黃芪甲苷；高效液相色譜法；含量測(cè)定

[中圖分類號(hào)] R927.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2016）11（c）-0137-03

[Abatract]Objective To establish an assay method of astragaloside in Naoxueshu Oral Liquid by HPLC.Methods The content of astragaloside in Naoxueshu Oral Liauid was detected by HPLC，and Shimadz UVP-ODS（5 μm，250 mm×4.6 mm）Column was used.18 alkyl bonding silica gel as the filling agent.The mobile phase was a mixture of acetonitrile-water （17∶33）.According to the theory of number of astragalus armor plate tower peak computation should not below 4000.Results A good linear relationship of Astragaloside was in the range of injection volume was from 1.78 to 24.92 μg （r=0.9998），the average recovery rate was 101.02%，RSD=4.03%.The constancy was good within 8 hours under common temperature.Conclusion The HPLC method is convenient，sensitive and accurate.It can be a method for quality control of Naoxueshu Oral Liquid in production.

[Key words]Naoxueshu Oral Liquid；Astragaloside；HPLC method；Content determination

腦血疏口服液主要含有黃芪、水蛭、大黃、牡丹皮等，可益氣活血，在臨床上使用多年，效果良好。主要可以增加腦血流量，改善微循環(huán)，促進(jìn)吞噬細(xì)胞的吞噬功能，加速腦血腫的吸收[1-3]，因此，該藥是治療出血性中風(fēng)的首選藥物之一。方中君藥黃芪為常用中藥，素有“補(bǔ)藥之長(zhǎng)”之稱，具有益氣固表，利尿托毒等功效，還具有保護(hù)缺血性心肌、調(diào)節(jié)血壓、擴(kuò)張血管、增強(qiáng)免疫力、抗病毒、抗衰老等作用，還具有一定的抗癌作用[4-6]。黃芪的藥用價(jià)值很高，臨床上常被用來(lái)治療非特異性免疫功能低下，乙肝和心血管系統(tǒng)等疾?。稽S芪中含有多種化學(xué)成分，如多糖類成分、黃芪皂苷Ⅰ～Ⅷ、異黃酮、鈣、鉀等，其中黃芪甲苷具有強(qiáng)心作用、心肌缺血作用及抑制血小板凝集和抗氧化、衰老等作用[7-8]，因此對(duì)方中君藥黃芪的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究對(duì)腦血疏口服液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)尤其重要。本研究考察多種測(cè)定條件，高效液相色譜法（HPLC）具有分離效能高、分析速度快、檢測(cè)靈敏度高、自動(dòng)化操作、分析精確度高等優(yōu)點(diǎn)，故采用HPLC法測(cè)定腦血疏中黃芪甲苷的含量，以提高該藥品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

1儀器與試藥

日本島津1260型高效液相色譜儀，SPD-20A（V）紫外檢測(cè)器；腦血疏口服液（山東沃華醫(yī)藥科技股份有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字Z20070059）；黃芪甲苷標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)110781～201402，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；乙腈為色譜純（Fisher Scientific）；水為純化水；其余試劑均為分析純。

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件

色譜柱：島津Shimadzu UVP-ODS（5μm，250 mm×4.6 mm）；十八烷基鍵合硅膠為填充劑；流動(dòng)相：乙腈-水（17∶33）；檢測(cè)波長(zhǎng)：200 nm；流速：1.0 ml/min；樣品進(jìn)樣量為10 μl。理論板數(shù)符合《中國(guó)藥典》2015年版要求。

2.2溶液配制

精密稱取黃芪甲苷標(biāo)準(zhǔn)品9.315 mg，置于10 ml量瓶中，加甲醇溶解稀釋至刻度，搖勻，得標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

取腦血疏口服液（150101、1501021、150103、150401、150402、150403、150701、151002、151201、151202）樣品，精密量取10 ml，置分液漏斗中，分別加20 ml水飽和的正丁醇溶液提取4次，合并正丁醇液；分別取100 ml氨試液洗滌3次，取正丁醇液蒸干。殘?jiān)眉状既芙獠⒁迫? ml量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，薄膜過(guò)濾，得供試品溶液。

按照藥品的制備方法制備缺黃芪的制劑作為空白溶液。

2.3線性試驗(yàn)

配制標(biāo)準(zhǔn)品溶液，濃度分別為0.356 mg/ml、0.712 mg/ml、1.068 mg/ml、1.424 mg/ml、1.780 mg/ml、2.136 mg/ml、2.492 mg/ml，取10 μl分別進(jìn)樣，測(cè)定其峰面積分別為110 209、709 820、1 263 252、1 910 580、2 492 408、3 178 988、3 746 508，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程y=171312x-523518，r=0.9995，結(jié)果顯示進(jìn)樣量為3.56～24.92 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4精密度試驗(yàn)

精密吸取“2.2”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)品溶液，在相同色譜條件下重復(fù)進(jìn)樣5次，記錄其峰面積分別為1 313 181、1 368 894、1 358 224、1 311 770、1 303 445，RSD為2.26%。

2.5重復(fù)性試驗(yàn)

精密量取樣品（150402）5 ml共5份，照“2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法進(jìn)行處理并測(cè)定，結(jié)果顯示重復(fù)性良好（表1）。

2.6穩(wěn)定性試驗(yàn)

按樣品溶液制備方法制得供試品溶液（批號(hào)：150402），精密吸取供試品溶液10 μl注入液相色譜儀測(cè)定。分別于0、2、4、6、10、16、20、24 h測(cè)定1次。峰面積依次為236 851、240 501、239 980、242 697、239 803、 236 654、231 569、235 980，RSD為1.46%，提示供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7回收率試驗(yàn)

精密量取已知含量的腦血疏口服液（批號(hào)：150402）5 ml置分液漏斗中，分別精密量取標(biāo)準(zhǔn)品溶液（0.9 315 mg/ml）各2 ml加入，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液并測(cè)定，計(jì)算其回收率：回收率（%）=（測(cè)得量-供試品所含被測(cè)成分量）/加入對(duì)照品的量×100%。得平均回收率為101.02%，RSD為4.03%，加樣回收良好（表2）。

2.8空白試驗(yàn)

取“2.2”項(xiàng)下的空白溶液，按相同色譜條件進(jìn)樣，在與對(duì)照品相同時(shí)間處無(wú)色譜峰出現(xiàn)，表明其他成分對(duì)黃芪甲苷的測(cè)定無(wú)干擾。

2.9樣品測(cè)定

各樣品進(jìn)樣10 μl，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表3。

3討論

測(cè)定黃芪甲苷含量的方法有很多，如比色法[9]、分光光度法[10]及薄層掃描法[11]等，近年來(lái)，黃芪甲苷的分析手段有了進(jìn)一步的提高，有高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)器法及在線固相萃取高效液相色譜法等[12-14]，但是該方法增加了檢驗(yàn)成本，相對(duì)提高了藥品的成本，HPLC的分辨率較高，重復(fù)性好，色譜柱還可以反復(fù)使用，節(jié)約成本，并能較好的檢測(cè)黃芪甲苷的含量[15]，故本研究?jī)H對(duì)該方法進(jìn)行研究。

由于黃芪甲苷屬于四環(huán)三萜類皂苷，紫外末端吸收（λmax=200.8 nm），綜合考慮多種因素，選擇200 nm為本實(shí)驗(yàn)的測(cè)定波長(zhǎng)。另外本研究還考察了甲醇-水及乙腈-水的流動(dòng)相體系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，由于黃芪甲苷的最大吸收波長(zhǎng)較低，用甲醇-水作為流動(dòng)相時(shí)，黃芪甲苷與其他峰之間的分離效果不好，而乙腈-水（17∶33）作為流動(dòng)相時(shí)，分離度符合藥典要求，且分析時(shí)間較短，節(jié)省成本。

由于黃芪含有多種成分，一般的處理方法無(wú)法將多余成分除去，影響分離效果。本實(shí)驗(yàn)按照“2.2”項(xiàng)下方法處理樣品，能將大部分雜質(zhì)成分除去，色譜峰中的雜質(zhì)峰較少，黃芪甲苷與其他非目標(biāo)峰之間的分離度符合藥典要求。

本研究以Shimadz UVP-ODS為色譜柱，乙腈-水（17∶33）為流動(dòng)相，采用HPLC紫外檢測(cè)法測(cè)定腦血疏口服液中黃芪甲苷的含量，方法簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，建議用于腦血疏口服液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制。

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（收稿日期：2016-08-05 本文編輯：顧雪菲）