房 曉, 尹 華, 胡騰惠, 金世光, 王大新

(1. 揚州大學(xué)醫(yī)學(xué)院, 江蘇 揚州, 225001; 2. 揚州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院, 江蘇 揚州, 225001)

論 著

奧沙利鉑對結(jié)腸癌細(xì)胞DNA損傷修復(fù)類抗藥基因表達(dá)的影響

房 曉1, 尹 華1, 胡騰惠2, 金世光2, 王大新2

(1. 揚州大學(xué)醫(yī)學(xué)院, 江蘇 揚州, 225001; 2. 揚州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院, 江蘇 揚州, 225001)

目的 觀察奧利沙鉑對結(jié)腸癌細(xì)胞DNA損傷修復(fù)類基因表達(dá)的影響。方法 采用奧利沙鉑處理結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116 48 h。以Western blot免疫印跡法檢測奧利沙鉑誘導(dǎo)的DNA損傷。采用CCK-8方法探討奧利沙鉑對HCT116細(xì)胞生長的影響。采用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)方法檢測奧利沙鉑處理后相關(guān)DNA損傷修復(fù)基因的表達(dá)。結(jié)果 奧利沙鉑處理后, HCT116細(xì)胞中DNA損傷標(biāo)志基因γ-H2AX表達(dá)明顯上升。DNA損傷切除修復(fù)相關(guān)基因XPC表達(dá)在奧利沙鉑處理后出現(xiàn)顯著上升，其他DNA損傷修復(fù)基因mRNA表達(dá)無明顯上調(diào)。結(jié)論 XPC基因可能在臨床應(yīng)用奧沙利鉑治療結(jié)腸癌時腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生抗藥性的過程中起到了關(guān)鍵作用。

奧沙利鉑; 結(jié)腸癌細(xì)胞; DNA損傷修復(fù); 抗藥性

奧沙利鉑是臨床上常用的DNA損傷類化療藥物, 對結(jié)腸癌有著較好療效[1-2]。DNA損傷類化療藥物通過誘導(dǎo)DNA損傷以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞生長，是腫瘤化療藥物的一大重要組成，然而其局限性在于用藥過程中腫瘤細(xì)胞抗藥性的產(chǎn)生[3]。腫瘤細(xì)胞中DNA修復(fù)相關(guān)蛋白的表達(dá)上調(diào)加快了細(xì)胞內(nèi)DNA損傷的修復(fù)，從而導(dǎo)致了細(xì)胞對DNA損傷類化療藥物如奧沙利鉑等的抗藥性[4]。本研究觀察奧沙利鉑作用結(jié)腸癌細(xì)胞后對DNA損傷修復(fù)類相關(guān)基因表達(dá)的影響，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 試劑、細(xì)胞系與儀器設(shè)備

奧沙利鉑(純度>98%)購自美國Sigma-Aldrich公司; 人結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116由北京蛋白質(zhì)組研究中心惠贈; DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基(Gibco, 美國); 小牛血清(四季青，中國); 青霉素/鏈霉素雙抗溶液(Gibco, 美國); CCK-8細(xì)胞增殖活性檢測試劑盒(Vazyme, 中國); γ-H2AX(Ser139)抗體(Millipore, 美國); GAPDH抗體(Vazyme, 中國); 辣根過氧化酶標(biāo)記羊抗小鼠二抗(Biorad, 美國); ECL試劑盒(Thermo, 美國); Trizol RNA提取試劑(Invitrogen, 美國); 反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo, 美國); SYBR Green熒光定量PCR試劑盒(Vazyme, 中國); 細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo, 美國); 引物合成(Invitrogen, 美國); Tecan M2000酶標(biāo)儀(Tecan, 美國); Bio-Rad Chemi Doc XRS化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀(Bio-Rad, 美國); ABI StepOne Plus實時熒光定量PCR儀 (ABI, 美國)。

1.2 實驗方法

1.2.1 結(jié)腸癌細(xì)胞培養(yǎng)條件與藥物處理: 結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116培養(yǎng)在含15%小牛血清及1%青霉素/鏈霉素雙抗溶液的DMEM完全培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為37 ℃、5% CO2。待細(xì)胞長至60%～70%匯合度，在培養(yǎng)基中加入5 mmol/L奧沙利鉑，處理48 h。1.2.2 CCK-8法檢測細(xì)胞活性: HCT116細(xì)胞以2×104個/孔密度接種于96孔板中，分為2組，分別加入0、5 mmol/L奧沙利鉑處理。藥物處理48 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)1.5 h后，于酶標(biāo)儀450 nm波長讀數(shù)，檢測吸光度。1.2.3 Western Blot檢測細(xì)胞內(nèi)DNA損傷: 收取細(xì)胞，用RIPA溶液(含蛋白酶抑制劑及磷酸酶抑制劑)裂解提取蛋白，以Bradford法進(jìn)行蛋白定量，按每孔60 μg蛋白上樣進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，濃縮膠濃度為5%, 分離膠濃度為12%。采用濕轉(zhuǎn)方法將蛋白轉(zhuǎn)至0.2 μmol/L硝酸纖維膜，使用含5%脫脂牛奶的TBST溶液室溫封閉1 h, 后在γ-H2AX抗體中(稀釋濃度1∶200) 4 ℃孵育過夜。二抗(1∶2 000稀釋)孵育時間為1 h, 使用伯樂XRS化學(xué)發(fā)光成像分析儀顯影成像。

1.2.4 RNA提取、反轉(zhuǎn)錄及熒光實時定量PCR檢測DNA損傷修復(fù)基因mRNA表達(dá): 采用Trizol試劑，按說明書要求進(jìn)行細(xì)胞總RNA提取，按試劑盒說明書步驟通過兩步法完成cDNA反轉(zhuǎn)錄，隨后使用SYBR Green試劑進(jìn)行熒光定量PCR檢測DNA損傷相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平。相關(guān)引物序列來自Primer Bank數(shù)據(jù)庫[5]。熒光定量PCR擴(kuò)增體系為20 μL, 擴(kuò)增反應(yīng)及結(jié)果分析通過Step One Plus實時熒光定量PCR系統(tǒng)(ABI公司，美國)進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

本實驗采用SPSS 11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，以Students′ t test進(jìn)行實驗數(shù)據(jù)組間差異比較，檢驗水準(zhǔn)α=0.05,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 奧沙利鉑誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞DNA損傷并抑制

其生長

為了證實奧沙利鉑對結(jié)腸癌細(xì)胞通過誘導(dǎo)DNA損傷而產(chǎn)生的生長抑制作用，在HCT116細(xì)胞的培養(yǎng)體系中加入了5 mmol/L奧沙利鉑孵育48 h, 通過Western Blot方法檢測細(xì)胞DNA損傷標(biāo)志基因γ-H2AX的表達(dá)。結(jié)果顯示，奧沙利鉑處理后γ-H2AX水平出現(xiàn)顯著上調(diào)，提示奧沙利鉑對DNA損傷的誘導(dǎo)作用。為驗證奧沙利鉑對結(jié)腸癌細(xì)胞生長的抑制作用，以CCK-8方法檢測奧沙利鉑處理48 h后結(jié)腸癌細(xì)胞的活性。結(jié)果顯示，奧沙利鉑處理后結(jié)腸癌細(xì)胞生長活性顯著下降(39.8%,P<0.01), 提示奧沙利鉑抑制結(jié)腸癌細(xì)胞生長。見圖1。

2.2 奧沙利鉑促進(jìn)DNA損傷修復(fù)基因XPC的

mRNA表達(dá)上調(diào)

為了檢測奧沙利鉑對DNA損傷修復(fù)基因表達(dá)的影響，以熒光定量PCR方法檢測奧沙利鉑處理48 h后結(jié)腸癌細(xì)胞中相關(guān)修復(fù)基因的表達(dá)。根據(jù)功能劃分, DNA損傷修復(fù)基因分為切除修復(fù)、錯配修復(fù)以及直接修復(fù)調(diào)控基因3大類[4]。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，奧沙利鉑處理后，結(jié)腸癌細(xì)胞中切除修復(fù)類基因XPC的mRNA表達(dá)出現(xiàn)顯著上升，與對照組相比，其mRNA表達(dá)相對豐度為2.707±0.095 (P<0.0005)。其他7個切除修復(fù)類基因中, RAD23B表達(dá)為(1.546±0.231), 呈略微上升; APEX1、UNG、XRCC1表達(dá)均未出現(xiàn)顯著變化, FEN1、LIG1及LIG3表達(dá)甚至呈現(xiàn)下降趨勢。

A. 奧沙利鉑(5 μmol/L)處理HCT116細(xì)胞48 h后, Western blot實驗提示DNA損傷標(biāo)志蛋白γ-H2AX表達(dá)顯著上升 B. CCK-8實驗顯示HCT116細(xì)胞經(jīng)5 μmol/L奧沙利鉑處理48 h后, 其生長活性顯著下降(***P<0.0001)

圖1 奧沙利鉑誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116產(chǎn)生DNA損傷并抑制其生長活性

奧沙利鉑處理結(jié)腸癌細(xì)胞后，錯配修復(fù)類基因中MLH1、MSH2及MSH6表達(dá)出現(xiàn)下降, PMS2表達(dá)沒有明顯變化; 直接修復(fù)類基因MGMT表達(dá)亦未發(fā)生明顯改變。以上結(jié)果提示XPC可能是結(jié)腸癌細(xì)胞經(jīng)奧沙利鉑處理后產(chǎn)生抗藥性的關(guān)鍵基因。見圖2。

3 討 論

DNA是臨床抗腫瘤藥物的一個主要靶點，以誘導(dǎo)DNA損傷來促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡為機(jī)制的鉑類化療藥物是目前最有效的臨床化療藥物之一。奧沙利鉑通過誘導(dǎo)DNA雙鏈交聯(lián)，阻斷DNA復(fù)制及轉(zhuǎn)錄過程，是繼順鉑后開發(fā)出來的第3代鉑類抗癌藥物[6]。因腫瘤細(xì)胞對其產(chǎn)生的抗藥性與順鉑等鉑類藥物相較更低，奧沙利鉑在結(jié)腸癌的臨床治療中得到了廣泛應(yīng)用[6-8]。

DNA損傷類化療藥物的一大局限在于抗藥性的產(chǎn)生，而造成腫瘤細(xì)胞對這類藥物抗藥性的主要原因是DNA損傷反應(yīng)通路異常，具體包括DNA損傷修復(fù)能力上調(diào)及DNA損傷耐受性增加2個方面[4, 9]。化療藥物對腫瘤細(xì)胞DNA造成的損傷主要通過切除修復(fù)、錯配修復(fù)以及直接修復(fù)3種方式進(jìn)行。DNA損傷修復(fù)蛋白的表達(dá)上調(diào)，提高了腫瘤細(xì)胞對DNA損傷的修復(fù)能力，從而導(dǎo)致了其對DNA損傷類化療藥物抗藥性的產(chǎn)生[4, 10-11]。此外，跨損傷DNA合成機(jī)制可以利用損傷DNA鏈為模板進(jìn)行DNA合成，提高了細(xì)胞對DNA損傷的耐受性，亦可使腫瘤細(xì)胞對DNA損傷類化療藥物敏感性降低[12-16]。

熒光實時定量PCR分析5 μmol/L奧沙利鉑處理HCT116細(xì)胞48 h后DNA損傷修復(fù)基因mRNA表達(dá)情況, **P<0.0005

圖2 奧沙利鉑誘導(dǎo)DNA損傷切除修復(fù)基因XPC表達(dá)上調(diào)

本研究首先通過對奧沙利鉑處理結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116后DNA損傷標(biāo)志性蛋白表達(dá)以及細(xì)胞生長活性改變的觀察，驗證了奧沙利鉑作為DNA損傷類化療藥物對抑制結(jié)腸癌細(xì)胞生長的有效性。盡管文獻(xiàn)[17-26]報道結(jié)腸癌細(xì)胞在奧沙利鉑處理過程中會逐漸產(chǎn)生抗藥性，然而抗藥性產(chǎn)生的具體機(jī)制目前尚未明確。本研究通過熒光定量PCR方法探討可能導(dǎo)致抗藥性的DNA損傷修復(fù)類基因的表達(dá)。作者發(fā)現(xiàn)奧沙利鉑處理后，結(jié)腸癌細(xì)胞中切除修復(fù)基因XPC表達(dá)出現(xiàn)顯著上升。結(jié)合以往研究，推測結(jié)腸癌細(xì)胞在奧沙利鉑處理后可能通過提高XPC的表達(dá)，增強DNA損傷修復(fù)能力，進(jìn)而減少奧沙利鉑通過誘導(dǎo)DNA損傷而導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡，此機(jī)制可能為結(jié)腸癌細(xì)胞對奧沙利鉑產(chǎn)生抗藥性的一個重要方面[21-23]。

綜上所述，初步研究結(jié)果表明, DNA損傷切除修復(fù)基因XPC可能是結(jié)腸癌細(xì)胞對奧沙利鉑產(chǎn)生抗藥性的關(guān)鍵基因。

[1] RAYMOND E, FAIVRE S, CHANEY S, et al. Cellular and molecular pharmacology of oxaliplatin[J]. Mol Cancer Ther, 2002, 1(3): 227-235.

[2] SONG N, POGUE-GEILE K L, GAVIN P G, et al. Clinical outcome from oxaliplatin treatment in stage Ⅱ/Ⅲ colon cancer according to intrinsic subtypes: Secondary analysis of nsabp c-07/nrg oncology randomized clinical trial[J]. JAMA Oncol, 2016, 2(9): 1162-1169.

[3] CHEUNG-ONG K, GIAEVER G, NISLOW C. DNA-damaging agents in cancer chemotherapy: Serendipity and chemical biology[J]. Chem Biol, 2013, 20(5): 648-659.

[4] SALEHAN M R, MORSE H R. DNA damage repair and tolerance: A role in chemotherapeutic drug resistance[J]. Br J Biomed Sci, 2013, 70(1): 31-40.

[5] SPANDIDOS A, WANG X, WANG H, et al. Primerbank: A resource of human and mouse pcr primer pairs for gene expression detection and quantification[J]. Nucleic Acids Res, 2010, 38(Database issue): D792-799.

[6] CULY C R, CLEMETT D, WISEMAN L R. Oxaliplatin.A review of its pharmacological properties and clinical efficacy in metastatic colorectal cancer and its potential in other malignancies[J]. Drugs, 2000, 60(4): 895-924.

[7] BLEIBERG H. Oxaliplatin (l-ohp): A new reality in colorectal cancer[J]. Br J Cancer, 1998, 77 (Suppl 4): 1-3.

[8] HIND D, TAPPENDEN P, TUMUR I, et al. The use of irinotecan, oxaliplatin and raltitrexed for the treatment of advanced colorectal cancer: Systematic review and economic evaluation[J]. Health Technol Assess, 2008, 12(15): 162-169.

[9] KACHALAKI S, EBRAHIMI M, MOHAMED KHOSROSHAHI L, et al. Cancer chemoresistance; biochemical and molecular aspects: A brief overview[J]. Eur J Pharm Sci, 2016, 89: 20-30.

[10] GENTILE F, TUSZYNSKI J A, BARAKAT K H. Modelling DNA repair pathways: Recent advances and future directions[J]. Curr Pharm Des, 2016, 22(23): 3527-3546.

[11] HERATH N I, DEVUN F, LIENAFA M C, et al. The DNA repair inhibitor dt01 as a novel therapeutic strategy for chemosensitization of colorectal liver metastasis[J]. Mol Cancer Ther, 2016, 15(1): 15-22.

[12] LEHMANN A R, NIIMI A, OGI T, et al. Translesion synthesis: Y-family polymerases and the polymerase switch[J]. DNA Repair (Amst), 2007, 6(7): 891-899.

[13] ALBERTELLA M R, LAU A, O′CONNOR M J. The overexpression of specialized DNA polymerases in cancer[J]. DNA Repair (Amst), 2005, 4(5): 583-593.

[14] XIANG Z, KANG Q J, XIANG X. Gene and protein expression in the oxaliplatin-resistant ht29/l-ohp human colon cancer cell line[J]. Genet Mol Res, 2015, 14(3): 11013-11022.

[15] LIU Z, QIU M, TANG Q L, et al. Establishment and biological characteristics of oxaliplatin-resistant human colon cancer cell lines[J]. Chin J Cancer, 2010, 29(7): 661-667.

[16] TO K K, POON D C, WEI Y, et al. Data showing the circumvention of oxaliplatin resistance by vatalanib in colon cancer[J]. Data Brief, 2016, 7: 437-444.

[17] 劉杲全. 反式維甲酸聯(lián)合奧沙利鉑對結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞株增殖、血管新生能力的影響[J]. 海南醫(yī)學(xué)院學(xué)報, 2014, 20(12): 1610-1613.

[18] 江恒, 陳健, 陳克力, 等. 沉默孕烷X受體增強結(jié)腸癌LS174T細(xì)胞對奧沙利鉑敏感性的影響[J]. 第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報, 2012, 34(1): 5-8.

[19] 蔡曉東. 奧沙利鉑聯(lián)合替吉奧治療復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移性大腸癌臨床觀察[J]. 實用臨床醫(yī)藥雜志, 2013, 17(23): 113-114.

[20] 徐明昊, 張悅, 孫明華, 等. 通過奧沙利鉑抑制PI3K/Akt通路以增強TRAIL誘導(dǎo)結(jié)腸癌RKO細(xì)胞凋亡敏感性的實驗研究[J]. 中國全科醫(yī)學(xué), 2013, 16(18): 2113-2116.

[21] 呂會增, 陳圖鋒, 鄭宗珩, 等. 全反式維甲酸提高人結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞對奧沙利鉑敏感性[J]. 中國藥理學(xué)通報, 2009, 25(6): 773-777.

[22] 王新穎, 王繼德, 姜泊. ROS在奧沙利鉑誘導(dǎo)PUMA表達(dá)致腸癌細(xì)胞凋亡過程中的作用[J]. 中國藥理學(xué)通報, 2006, 22(12): 1522-1525.

[23] 向征, 張才全, 湯為學(xué). 人結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞系HT29/L-OHP的建立及其生物學(xué)特性[J]. 第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報, 2008, 30(9): 840-843.

Effect of oxaliplatin on expression of drug resistant gene in DNA damage repair in human colon cancer cells

FANG Xiao1, YIN Hua1, HU Tenghui2, JIN Shiguang2, WANG Daxin2

(1.MedicalCollegeofYangzhouUniversity,Yangzhou,Jiangsu, 225001; 2.ClinicalMedicalCollegeofYangzhouUniversity,Yangzhou,Jiangsu, 225001)

Objective To observe the effect of oxaliplatin on expression of drug resistant gene in DNA damage repair in human colon cancer cells.Methods The human colon cancer cell line HCT116 was processed with oxaliplatin for 48 hours.Western blot was used to examine DNA damage induced by oxaliplatin treatment. CCK-8 assay was used to explore the effect of oxaliplatin on growth of HCT116. The real-time PCR was used to detect the expression of DNA repair genes after oxaliplatin treatment. Results After the treatment of oxaliplatin, the expression of the DNA-damage-marker gene γ-H2AX increased significantly, and DNA damage excision repair related gene XPC increased significantly as well.The mRNA expression of other DNA damage repair genes had no significant increase. Conclusion The gene XPC might play a key role in generating drug resistance when treating colon cancer with oxaliplatin in clinic.

oxaliplatin; colon cancer cells; DNA damage repair; drug resistance

2016-10-26

江蘇省自然科學(xué)基金資助項目(BK20140497); 江蘇省高校自然科學(xué)研究面上項目(14KJB310024);江蘇省揚州市自然科學(xué)基金面上項目(YZ2014059)

王大新, E-mail: daxinw2002@sina.com

R 735.3

A

1672-2353(2017)01-001-04

10.7619/jcmp.201701001