秦潔

（新鄉(xiāng)縣農(nóng)牧局，河南新鄉(xiāng)453000）

豬日本乙型腦炎的PCR診斷

秦潔

（新鄉(xiāng)縣農(nóng)牧局，河南新鄉(xiāng)453000）

日本乙型腦炎病毒（JEV）是一種單股正鏈RNA病毒，屬于黃病毒科（Flaviviridae）黃病毒屬成員，也是一種重要的人獸共患病病原，可感染人和豬、馬、牛、羊、鼠、犬及禽類等多種動(dòng)物，以流行性乙型腦炎為主的急性傳染病。其中，豬是日本乙型腦炎病毒的主要易感動(dòng)物之一。豬感染日本乙型腦炎病毒主要表現(xiàn)為繁殖障礙和腦炎，臨床上以妊娠母豬發(fā)生流產(chǎn)，產(chǎn)死胎、木乃伊胎，公豬睪丸腫大為特征，腦炎癥狀多由感染的仔豬表現(xiàn)。筆者將一例豬感染日本乙型腦炎病毒的PCR診斷進(jìn)行報(bào)道，以供參考。

1 臨床病例

2016年7月份至8月份，一小型養(yǎng)豬場(chǎng)陸續(xù)有14頭妊娠母豬發(fā)生流產(chǎn)，除偶有胎衣不下外，未見(jiàn)其他明顯的臨床癥狀。采集流產(chǎn)病豬和胎兒的主要臟器、睪丸、腹股溝淋巴結(jié)及胎衣送到新鄉(xiāng)縣進(jìn)行布魯氏菌、衣原體、豬細(xì)小病毒、日本乙型腦炎病毒和豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒等與流產(chǎn)相關(guān)的病原檢測(cè)。

2 實(shí)驗(yàn)室診斷

2.1 病料的DNA和RNA提取

將采集的病料組織加液氮充分研磨。取部分研磨好的樣品進(jìn)行總DNA的提取，樣品以500 μl DNA提取液（10%SDS，20 mg/ml蛋白酶K）在56℃水浴中消化2 h是樣品完全裂解，加入等體積酚/氯仿/異戊醇萃取2次，上清中加入等體積的異丙醇和1/10體積的3 mol/L醋酸鈉，于-80℃冰箱中2 h沉淀DNA，12 000 r/min離心30 min，棄上清，所得白色沉淀即為DNA，晾干，加100 μl TE緩沖液溶解DNA，保存?zhèn)溆谩Ｈ〔糠盅心ズ玫臉悠愤M(jìn)行總RNA的提取，樣品以1 000 μl溶解TRizol，離心，上清加等體積氯仿充分混勻，離心去上清，重復(fù)此步驟一次，所得上清中加入異丙醇，于-80℃冰箱中沉淀RNA，12 000 r/min離心30 min，棄上清，所得白色沉淀即為RNA，晾干，加RNase free H2O溶解RNA，常規(guī)方法反轉(zhuǎn)錄為cDNA備用。

2.2 PCR檢測(cè)

布魯氏菌、衣原體和豬細(xì)小病毒的基因組為DNA，PCR檢測(cè)時(shí)以所提取的DNA為模板，日本乙型腦炎病毒和豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒的基因組為RNA，PCR檢測(cè)時(shí)以反轉(zhuǎn)錄所得的cDNA為模板。以Takara Premix Taq?（Ex Taq?Version 2.0 plus dye）預(yù)混酶進(jìn)行擴(kuò)增，50 μl PCR反應(yīng)體系含25 μl Premix Taq，2 μl模板，2 μl相應(yīng)的上下游檢測(cè)引物，21 μl H2O。本試驗(yàn)檢測(cè)日本乙型腦炎病毒所用引物為P1：5’-GATCTGGTGTTAGAAGG AGA-3’；P2：5’-TCACAATCCAGTGTGACTTC-3’。PCR反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性后，94℃變性45 s，52～57℃退火45 s，72℃延伸45 s，設(shè)35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

3 結(jié)果

將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，僅日本乙型腦炎病毒核酸陽(yáng)性，在510 bp處有一條特異性目的條帶，而布魯氏菌、衣原體、豬細(xì)小病毒和豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒的PCR結(jié)果均為陰性，這表明該豬場(chǎng)的母豬流產(chǎn)由豬日本乙型腦炎病毒感染引起。

4 討論

日本乙型腦炎又稱流行性乙型腦炎，是由日本乙型腦炎病毒感染引起的以中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變?yōu)橹饕卣鞯娜双F共患傳染病。日本乙型腦炎屬于自然疫源性疾病，具有一定的季節(jié)性和區(qū)域性，與蚊的活動(dòng)有密切關(guān)系，主要發(fā)生在蚊蟲(chóng)較多的6～9月間。人和多種動(dòng)物對(duì)日本乙型腦炎病毒均易感，人被感染發(fā)生乙型腦炎。牛、羊和禽類在多數(shù)情況下為隱性感染，不表現(xiàn)明顯臨床癥狀。馬感染后多表現(xiàn)腦炎癥狀，而豬主要表現(xiàn)為流產(chǎn)、死胎和睪丸炎等。豬被認(rèn)為是日本乙型腦炎病毒最重要的天然宿主，通過(guò)豬—蚊—豬的流行環(huán)節(jié)在動(dòng)物間循環(huán)。因此，豬日本乙型腦炎是一種威脅人畜健康的常見(jiàn)傳染病。

由日本乙型腦炎病毒感染引起的豬群繁殖障礙在我國(guó)規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)中比較常見(jiàn)。以流產(chǎn)為主要特征的豬日本乙型腦炎可根據(jù)該病的流行病學(xué)特點(diǎn)和臨床癥狀進(jìn)行初步診斷，但需要與常見(jiàn)的可引起流產(chǎn)相關(guān)的病原如布魯氏菌、衣原體、偽狂犬病毒、豬細(xì)小病毒、豬圓環(huán)病毒、豬呼吸與繁殖障礙綜合征病毒等進(jìn)行區(qū)分。豬日本乙型腦炎的流行呈明顯的季節(jié)性，而豬布魯氏菌病、衣原體、偽狂犬病、豬細(xì)小病毒病等沒(méi)有流行的季節(jié)性；豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒感染的豬群除母豬發(fā)生流產(chǎn)、早產(chǎn)、死產(chǎn)和產(chǎn)木乃伊胎外，斷奶前仔豬表現(xiàn)呼吸道綜合征，新生仔豬死亡率很高；圓環(huán)病毒與之類似，對(duì)發(fā)病豬群中的仔豬影響很大。豬場(chǎng)發(fā)病時(shí)，可用血清學(xué)或分子生物學(xué)方法對(duì)上述病原進(jìn)行診斷。筆者對(duì)發(fā)病豬場(chǎng)采集的樣品進(jìn)行了布魯氏菌、衣原體、豬細(xì)小病毒、日本乙型腦炎病毒和豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒的PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)所采集的病料中日本乙型腦炎病毒核酸為陽(yáng)性，而其他病原的核酸為陰性。由于豬場(chǎng)的流產(chǎn)時(shí)節(jié)正值蚊蟲(chóng)活躍，豬日本乙型腦炎的流行期，結(jié)合臨床癥狀，可以斷定該發(fā)病豬場(chǎng)的流產(chǎn)病例為豬日本乙型腦炎。

豬日本乙型腦炎目前尚無(wú)特效的治療藥物。在防控方面，豬發(fā)病時(shí)應(yīng)及時(shí)隔離，根據(jù)臨床癥狀進(jìn)行對(duì)癥治療，以防止繼發(fā)感染。蚊蟲(chóng)既是日本乙型腦炎病毒的傳播媒介，也是病毒的貯存宿主，因此可通過(guò)殺滅蚊蟲(chóng)來(lái)阻斷其傳播途徑進(jìn)行該病的預(yù)防。加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，保持豬場(chǎng)的環(huán)境衛(wèi)生，疏通溝渠，及時(shí)排除積水和污水，消除蚊蟲(chóng)孳生地，定期消毒等。另外，給豬群定期免疫接種可有效預(yù)防和控制該病。一般對(duì)后備公豬和母豬在當(dāng)?shù)匾倚湍X炎流行季節(jié)前1～2個(gè)月，按量接種日本乙型腦炎病毒弱毒疫苗，接種后1個(gè)月可產(chǎn)生免疫保護(hù)力。以后則按常規(guī)每年注射1次，有較好的預(yù)防效果。

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1004-5090（2017）08-0045-01

2017-06-11）