宋曉蕾， 周芬芬， 吳 湜， 高 瓊， 黃海輝， 陳軼堅(jiān)

·論著·

spo0A基因在艱難梭菌生長(zhǎng)及芽孢形成中的作用

宋曉蕾， 周芬芬， 吳 湜， 高 瓊， 黃海輝， 陳軼堅(jiān)

目的 了解spo0A基因?qū)ζD難梭菌臨床分離株生長(zhǎng)和芽孢產(chǎn)生的影響。方法 采用ClosTron敲除技術(shù)構(gòu)建艱難梭菌臨床分離株C25的spo0A基因突變株，分光光度計(jì)檢測(cè)菌液濃度并繪制生長(zhǎng)曲線，孔雀綠染色法計(jì)數(shù)芽孢和營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞。結(jié)果 艱難梭菌臨床分離株C25的spo0A基因敲除突變株和敲除前親代株的48 h生長(zhǎng)曲線無明顯差異，但突變株不再產(chǎn)生芽孢。結(jié)論 spo0A基因是艱難梭菌芽孢形成過程中的關(guān)鍵基因，但并非其生長(zhǎng)過程中的主要基因。

艱難梭菌； 芽孢； spo0A基因； 生長(zhǎng)曲線

艱難梭菌（Clostridium diff cile）為革蘭陽(yáng)性厭氧芽孢桿菌，是醫(yī)院獲得性腹瀉最主要的病原菌，約25 %～33 %抗生素相關(guān)性腹瀉以及90 %假膜性腸炎由艱難梭菌所致，統(tǒng)稱為艱難梭菌感染（Clostridium diff cile infection， CDI）[1]。大多數(shù)的CDI發(fā)生在住院患者中，但近10年社區(qū)獲得CDI急劇上升，約占新發(fā)感染的1/3[2]。

芽孢是艱難梭菌在外界環(huán)境中的主要存在形式，也是艱難梭菌感染廣泛傳播的原因之一。DNA結(jié)合蛋白Spo0A是細(xì)胞從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期進(jìn)入芽孢形成時(shí)期的關(guān)鍵應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白。對(duì)模式微生物枯草芽孢桿菌的研究表明，當(dāng)Spo0A的含量和磷酸化水平達(dá)到一定閾值后，芽孢形成才開始啟動(dòng)[3-4]。有報(bào)道Spo0A在艱難梭菌持續(xù)感染和傳播中起重要作用[5-6]。本研究采用ClosTron技術(shù)構(gòu)建艱難梭菌spo0A基因突變株，對(duì)Spo0A在艱難梭菌臨床分離株生長(zhǎng)和芽孢形成中的作用進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株 艱難梭菌臨床株C25分離自我院腹瀉患者糞便。經(jīng)鑒定該菌株為核糖體014型，產(chǎn)A毒素和B毒素。VPI10463為實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)菌株，產(chǎn)A毒素和B毒素。大腸埃希菌感受態(tài)細(xì)胞HB101購(gòu)自日本TaKaRa公司。pMTL007-E2質(zhì)粒為英國(guó)諾丁漢大學(xué)Nigel Minton惠贈(zèng)。

1.1.2 主要試劑 Brucella瓊脂為美國(guó)BBL Microbiology system產(chǎn)品，蛋白胨-酵母基礎(chǔ)肉湯（TY肉湯）和SAB肉湯為英國(guó)OXOID公司產(chǎn)品。環(huán)絲氨酸、頭孢西丁等藥物購(gòu)自大連美侖生物技術(shù)有限公司。引物由DNA 2.0公司（美國(guó)）或上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。TargeTron gene knockout system kit為美國(guó)Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品?？兹妇G為中國(guó)國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品。番紅染液為上?？片敿挝⑸锛夹g(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建艱難梭菌spo0A基因突變株 在http：//www.clostron.com中選取合適的目的基因突變位點(diǎn)，生成IBS、EBS2、EBS1d、EBS Universal引物序列，由DNA2.0 公司合成上述引物序列并進(jìn)行PCR，純化突變所需內(nèi)含子片段，按TargeTron gene knockout system kit說明書操作完成該內(nèi)含子片段與pMTL007-E2質(zhì)粒的重組。將重組質(zhì)粒導(dǎo)入E. coli HB101感受態(tài)細(xì)胞，氯霉素平皿篩選。將篩選后含有重組質(zhì)粒的大腸埃希菌與親代菌株混合培養(yǎng)進(jìn)行接合實(shí)驗(yàn)。用甲砜霉素-頭孢西丁-環(huán)絲氨酸平皿與紅霉素平皿篩選艱難梭菌接合子[5,7]。在含紅霉素的篩選平皿上隨機(jī)挑取6個(gè)接合子菌落，采用3對(duì)驗(yàn)證引物進(jìn)行PCR并測(cè)序。引物序列見表1。

表1 引物及序列Table 1 Primers and the corresponding oligonucleotide sequences in this study

1.2.2 繪制細(xì)菌生長(zhǎng)曲線 純分后的艱難梭菌菌株在厭氧工作站中（Ruskinn，英國(guó)）37 ℃培養(yǎng)16 h后取1 mL菌液加入到150 mL預(yù)還原TY肉湯中，置于搖床上厭氧培養(yǎng)，記為0 h。前18 h中每隔3 h從厭氧培養(yǎng)TY肉湯中取樣3 mL，于紫外可見光分光光度計(jì)上測(cè)量D600值，之后于24 h、48 h取樣測(cè)量D600值，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.2.3 計(jì)算產(chǎn)芽孢率 分別于第12 h、24 h、48 h、72 h、96 h、120 h取上述菌液1 mL，離心3 000×g，10 min，留取沉淀，加入適量PBS和5 %孔雀綠水溶液等量混合，100℃加熱25 min，涂片，干燥，加熱固定，ddH2O沖洗玻片，直至流出的水無色為止，用0.5 %番紅溶液復(fù)染3 min，使用洗耳球吹去多余染液，吹干玻片。油鏡下芽孢呈綠色，菌體呈紅色。分別計(jì)數(shù)10個(gè)單獨(dú)的視野。產(chǎn)芽孢率= 芽孢數(shù)/（ 芽孢數(shù)+ 營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞數(shù)）×100 %。

2 結(jié)果

2.1 艱難梭菌spo0Aspo0A突變株驗(yàn)證

用Cd-spo0A-F1/Cd-spo0A-R1引物進(jìn)行PCR后，瓊脂糖凝膠電泳顯示突變株擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度較親代株長(zhǎng)，測(cè)序結(jié)果證實(shí)該段序列中含有Ⅱ類內(nèi)含子。用ErmRAM-F/ErmRAM-R引物PCR后其測(cè)序結(jié)果證實(shí)了RAM片段在突變過程中發(fā)生重組。用插入序列一端引物EBS Universal和spo0A基因一端引物Cd-spo0A-R1進(jìn)行PCR后結(jié)果則進(jìn)一步證實(shí)了spo0A基因中有內(nèi)含子插入序列，突變株構(gòu)建成功，見圖1。

圖1 艱難梭菌spo0A突變株驗(yàn)證Figure 1 PCR conf rmation of intron integration into spo0A gene

2.2 生長(zhǎng)曲線

以實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)菌株VPI10463為對(duì)照，可見VPI10463、C25與C25 spo0A突變株生長(zhǎng)情況相似，在前9 h均處于指數(shù)生長(zhǎng)期，12 h后進(jìn)入穩(wěn)定生長(zhǎng)期。各個(gè)時(shí)間點(diǎn)C25與C25 spo0A突變株菌液濃度也相仿，見圖2。

圖2 VPI10463， C25， C25 spo0A突變株生長(zhǎng)曲線Figure 2 Growth curve of three Clostridium diff cile strains, VPI10463, C25 and C25 spo0A mutant

2.3 產(chǎn)芽孢率

VPI10463在48 h即開始有芽孢產(chǎn)生，產(chǎn)芽孢率0.3 %，而后隨時(shí)間增長(zhǎng)產(chǎn)芽孢率增加。C25菌株在48 h開始有芽孢產(chǎn)生，產(chǎn)芽孢率0.1 %，而后隨時(shí)間增長(zhǎng)產(chǎn)芽孢率亦增加。但C25 spo0A突變株至120 h均沒有芽孢產(chǎn)生，見圖3。

圖3 spo0A基因?qū)ρ挎弋a(chǎn)生的影響Figure 3 Effect of spo0A gene inactivation on sporulation capacity of C. diff cile

3 討論

艱難梭菌作為一種芽孢桿菌，可在惡劣的條件下產(chǎn)生芽孢，臨床上營(yíng)養(yǎng)缺乏、抗生素暴露、消毒劑的使用均可能使之產(chǎn)生芽孢。因此芽孢是艱難梭菌傳播的主要形式，亦可能與艱難梭菌感染停藥后反復(fù)發(fā)作相關(guān)[8]。文獻(xiàn)報(bào)道歐美廣泛傳播的NAP1/BI/027菌株產(chǎn)芽孢能力明顯高于其他菌株，且該菌株感染更容易復(fù)發(fā)[9]。因此當(dāng)前很多研究者對(duì)艱難梭菌芽孢形成機(jī)制進(jìn)行研究，以期為治療艱難梭菌感染提供新靶點(diǎn)和新思路。

Spo0A是近年來研究的熱點(diǎn)之一，其在營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)、芽孢產(chǎn)生、毒素分泌以及生物膜形成方面的作用均有報(bào)道[10]。但由于在艱難梭菌中基因敲除比較困難，因此基因功能研究明顯落后于其他病原菌，直至2007年Nigel Minton教授研發(fā)并共享ClosTron技術(shù)[11]。本課題組亦是在Nigel Minton惠贈(zèng)關(guān)鍵質(zhì)粒后方成功敲除spo0A基因。

本研究發(fā)現(xiàn)spo0A基因敲除前后突變菌株與親代菌株的生長(zhǎng)趨勢(shì)相仿，均在9 h后進(jìn)入穩(wěn)定生長(zhǎng)期，且各個(gè)生長(zhǎng)階段吸光度值D600均相近，表明spo0A基因并非艱難梭菌C25菌株生長(zhǎng)過程中的主要基因。雖Pettit等[6]研究顯示部分與細(xì)胞壁合成相關(guān)的基因也受Spo0A調(diào)控，但敲除spo0A基因?qū)τ谄D難梭菌營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)并無明顯影響。

本研究中艱難梭菌臨床分離株C25和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)菌株VPI10463在TY肉湯中培養(yǎng)48 h即開始產(chǎn)生芽孢，之后隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)產(chǎn)芽孢率明顯增加，但C25 spo0A突變株在整個(gè)研究階段均無芽孢產(chǎn)生，提示Spo0A是艱難梭菌芽孢產(chǎn)生的必要蛋白。這與其他研究者的結(jié)果相一致：Mackin等[12]、Underwood 等[7]和Deakin等[5]對(duì)spo0A基因敲除后的027、 078、630 Δerm的研究均發(fā)現(xiàn)spo0A基因敲除后突變株不產(chǎn)生芽孢。并且Deakin等[5]還發(fā)現(xiàn)spo0A基因敲除后突變株在小鼠中的傳播和持續(xù)感染均受到影響，可能與spo0A基因敲除后艱難梭菌芽孢產(chǎn)生障礙有關(guān)。

本研究的局限在于未進(jìn)行spo0A基因回補(bǔ)試驗(yàn)，且僅敲除核糖體型014菌株。今后將增加不同核糖體型別的研究菌株，特別是國(guó)內(nèi)主要的核糖體型017流行株；增加回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，為了解Spo0A在艱難梭菌感染發(fā)病和傳播中的作用提供更多依據(jù)。

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The role of spo0A gene in growth and sporulation of Clostridium diff cile

SONG Xiaolei, ZHOU Fenfen, WU Shi, GAO Qiong, HUANG Haihui, CHEN Yijian. （Institute of Antibiotics, Huashan Hospital, Fudan University; Key Laboratory of Clinical Pharmacology of Antibiotics, Ministry of Health, Shanghai 200040, China）

Objective To investigate the role of spo0A gene in growth and sporulation of Clostridium diff cile clinical isolates. Methods ClosTron gene knock-out system was used to knock out the spo0A gene of C. difficile strain C25. Bacterial growth curve was plotted by measuring D600with spectrophotometer in different phases of bacterial growth. Malachite green staining technique was used to count the number of vegetative cells and spores under optical microscope. The sporulation rate was calculated. Results The spo0A mutant and its C25 parental strain showed similar patterns of growth. However, after knock-out of spo0A gene, an asporogenous phenotype was built, while the parental strain could produce spores as usual. Conclusions The spo0A gene plays a key role in sporulation but not growth of C. diff cile strain.

Clostridium diff cile; sporulation; spo0A gene; growth curve

R378.8

A

1009-7708 ( 2017 )01-0033-04

10.16718/j.1009-7708.2017.01.006

2016-07-13

2016-07-20

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30973594)。

復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院抗生素研究所，衛(wèi)生部抗生素臨床藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200040。

宋曉蕾（1988—），女，碩士研究生，主要從事感染性疾病的診斷治療。

陳軼堅(jiān)，E-mail：chenyijian@fudan.edu.cn。