趙拴平, 徐 磊, 賈玉堂

(安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所, 安徽 合肥 230031)

大別山黃牛是我國(guó)優(yōu)良的地方品種牛，主要產(chǎn)于安徽省大別山東部的金寨﹑岳西﹑六安等縣和湖北省大別山西部的黃陂﹑大悟﹑英山等縣，是大別山地區(qū)著名的地方品種。大別山牛體型小、耐粗飼、適應(yīng)性強(qiáng)、抗病力強(qiáng)、容易管理，是我國(guó)寶貴的地方牛遺傳種質(zhì)資源。

CART基因(可卡因-苯丙胺調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄肽基因，Cocaine-and amphetamine-regulated transcript)是一種類(lèi)生長(zhǎng)抑制素多肽，最早從綿羊下丘腦抽提物中分離獲得[1]，研究發(fā)現(xiàn)，CART基因參與動(dòng)物攝食、能量代謝調(diào)節(jié)、應(yīng)激反應(yīng)等多種生理過(guò)程。E.Valle等研究發(fā)現(xiàn)CART基因位于牛20號(hào)染色體[2]，包含3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子，SNP位點(diǎn)主要集中在基因的內(nèi)含子和啟動(dòng)子區(qū)[2-3]，牛CART基因SNPs位點(diǎn)與生長(zhǎng)性狀關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，多態(tài)性位點(diǎn)A1A1(C1)基因型個(gè)體的體重顯著高于A(yíng)1B1基因型個(gè)體(P<0.05)，A2A2(C2)基因型個(gè)體的體重顯著低于A(yíng)2B2基因型個(gè)體(P<0.05)[3]。

本研究依據(jù)牛CART基因序列(NC_007318.6)設(shè)計(jì)引物，利用PCR、測(cè)序和生物信息學(xué)技術(shù)分析大別山牛CART基因SNPs位點(diǎn)與體尺性狀的相關(guān)性，以期為大別山牛品種資源保護(hù)和開(kāi)發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

試驗(yàn)樣品為安徽大別山黃牛血樣300份，樣本間無(wú)親緣關(guān)系，頸靜脈采血法采集每頭牛血液10 mL，ACD 抗凝，低溫帶回實(shí)驗(yàn)室，-80℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 基因組DNA提取

利用DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司，北京)進(jìn)行血液樣品基因組提取，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性，核酸分析儀測(cè)定其純度和濃度。

1.3 基因組DNA池構(gòu)建及PCR擴(kuò)增

分別取20份大別山牛稀釋DNA樣各1.0 μL，混合均勻，構(gòu)建4個(gè)獨(dú)立大別山?；蚪MDNA池。

根據(jù)GenBank公布的牛CART基因序列(NC_007318.6)，利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物(表1)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系為：1 μL DNA，12.5 μL 2× Taq PCR Master mix(KT201)，正反向引物各1.0 μL(100 ng/μL)，去離子水補(bǔ)充至25 μL；擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性5 min；32個(gè)循環(huán)(95℃變性30 s，Tm退火30 s，72℃延伸1 min)；72℃總延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物利用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.4 SNP分析及數(shù)據(jù)處理

利用PCR擴(kuò)增和測(cè)序技術(shù)分析CART基因SNP位點(diǎn)，測(cè)序結(jié)果利用Mutation Surveyor V4.0.8軟件[4]進(jìn)行分析，獲得其分型結(jié)果。根據(jù)群體遺傳學(xué)理論計(jì)算等位基因和基因型頻率，統(tǒng)計(jì)大別山牛群體CART基因多態(tài)位點(diǎn)的基因純合度(Ho)、基因雜合度(He)、有效等位基因數(shù)(Ne)和多態(tài)信息含量(PIC)，利用SPSS17.0軟件GLM模型分析SNP位點(diǎn)與大別山黃牛群體體尺性狀的相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 大別山牛CART基因突變區(qū)域的PCR擴(kuò)增

利用合成引物(表1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所得產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)。結(jié)果表明，擴(kuò)增片段與目的片段長(zhǎng)度一致，且條帶清晰、特異性好，可用于后期測(cè)序分析。

表1 大別山牛CART基因變異位點(diǎn)擴(kuò)增引物信息

圖1 大別山牛CART基因突變區(qū)域 PCR 擴(kuò)增M. DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) D2000；A. F1R1區(qū)域 B. F2R2區(qū)域

2.2 大別山牛CART基因突變區(qū)域的序列測(cè)定和遺傳多態(tài)性分析

PCR測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大別山牛CART基因第一內(nèi)含子存在T253C變異，存在TT、TC和CC三種基因型(圖2A)，第二內(nèi)含子存在A(yíng)1467G變異，有AA、AG和GG三種基因型(圖2B)。從群體遺傳學(xué)角度分析大別山牛CART基因各突變位點(diǎn)的等位基因頻率、基因型頻率、基因純合度、雜合度以及有效等位基因數(shù)和多態(tài)信息含量的遺傳指標(biāo)(表2)，T253C處TT是優(yōu)勢(shì)基因型，T為優(yōu)勢(shì)等位基因，處于低度多態(tài)狀態(tài)；A1467G處AA是優(yōu)勢(shì)基因型，A為優(yōu)勢(shì)基因， 處于低度多態(tài)狀態(tài)。同時(shí)卡方檢驗(yàn)表明，T253C處于Hardy-Weinberg不平衡狀態(tài)(P<0.05)，而A1467G處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(P>0.05)。

2.3 CART基因多態(tài)位點(diǎn)與大別山牛群體尺性狀的關(guān)聯(lián)性分析

對(duì)大別山牛CART基因T253C和A1467G位點(diǎn)進(jìn)行PCR測(cè)序統(tǒng)計(jì)分析后，依據(jù)SPSS17.0 GLM 線(xiàn)性模型分析300頭大別山牛(成年)個(gè)體不同基因型與體高、十字部高、胸圍、腹圍、管?chē)⒀菍捄妥嵌藢挼南嚓P(guān)性(表3)。

由表3可知，第一內(nèi)含子T253C位點(diǎn)不同基因型在體高和腹圍方面差異顯著(P<0.05)，TT和TC基因型個(gè)體均值顯著高于CC基因型個(gè)體；而其他體尺性狀方面基本遵循TT和TC基因型個(gè)體均值略高于CC基因型個(gè)體均值的趨勢(shì)，但差異不顯著(P>0.05)。第二內(nèi)含子A1467G位點(diǎn)不同基因型在管?chē)脱菍挿矫娌町愶@著(P<0.05)，AG基因型個(gè)體均值顯著高于A(yíng)A和GG基因型個(gè)體；而其他體尺性狀方面基本遵循AG基因型個(gè)體均值略高于A(yíng)A和GG基因型個(gè)體均值的趨勢(shì)，但差異不顯著(P>0.05)。

圖2 大別山牛CART基因突變區(qū)域測(cè)序圖譜

SNP位點(diǎn)基因型頻率基因頻率HWE多樣性參數(shù)(χ2)PHoHeNePICT253CTTTCCCTC0.900.090.010.940.069.180.010.8890.1111.1250.105A1467GAAAGGGAG0.720.260.020.850.150.010.990.7410.2591.3500.226

表3 大別山黃牛CART基因多態(tài)位點(diǎn)與體尺性狀的相關(guān)性分析

注:肩標(biāo)不同小寫(xiě)字母(a，b)表示差異顯著(P<0.05)；相同字母或無(wú)字母標(biāo)注表示差異不顯著(p>0.05)

3 討論

Mutation Surveyor V4.0.8是由SoftGenetics公司開(kāi)發(fā)的一款序列變異分析軟件，能夠高效準(zhǔn)確地分析基因純合子或雜合子的SNPs、缺失、插入等[4-5]。本研究利用測(cè)序技術(shù)和Mutation Surveyor V4.0.8軟件分析鑒定CART基因第一內(nèi)含子T253C變異和第二內(nèi)含子A1467G變異，該變異位點(diǎn)均位于內(nèi)含子區(qū)域，均不編碼蛋白質(zhì)序列，但目前研究顯示，內(nèi)含子可能在基因的表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮重要作用，如牛CAPN1基因第14內(nèi)含子C4685T變異與體重顯著相關(guān)(P<0.05)[6]，IGFBP-3基因第2內(nèi)含子C>A變異與海福特牛初生重和體重顯著相關(guān)(P<0.05)[7]?？梢?jiàn)，CART基因T253C和A1467G變異可能不同程度影響CART蛋白的活性，進(jìn)而影響其有關(guān)的生長(zhǎng)發(fā)育性狀。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，大別山牛CART基因T253C和A1467G位點(diǎn)均表現(xiàn)為低度多態(tài)，但具備適度選擇的空間；χ2檢驗(yàn)顯示，CART基因T253C位點(diǎn)處于Hardy-Weinberg不平衡狀態(tài)(P<0.05)， 說(shuō)明其在自然選擇和人工選育過(guò)程中可能會(huì)被逐漸淘汰，也可能與大別山牛品種本身有關(guān)；CART基因A1467G位點(diǎn)處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(P>0.05)，說(shuō)明在人工選育、遷徙和遺傳漂變等外界因素作用下，該基因座處于動(dòng)態(tài)平衡中，并且對(duì)大別山牛的體尺指標(biāo)有一定影響。大別山牛CART基因各突變位點(diǎn)不同基因型與體尺性狀的關(guān)聯(lián)性分析表明：T253C和A1467G突變位點(diǎn)的不同基因型與體高、腹圍、管?chē)脱菍掞@著相關(guān)(P<0.05)，由此推測(cè)T253C和A1467G位點(diǎn)可能影響大別山牛的體尺性狀指標(biāo)。CART基因可能是影響大別山牛體高、腹圍、管?chē)脱菍掦w尺性狀的主效QTL或與之緊密連鎖，此外，張春雷[8]研究發(fā)現(xiàn)，CART基因C2基因座與24月齡南陽(yáng)牛體重、體斜長(zhǎng)、胸圍顯著相關(guān)(P<0.05)，C3基因座與24月齡體斜長(zhǎng)顯著相關(guān)(P<0.05)，C4基因座與24月齡體重和體斜長(zhǎng)顯著相關(guān)(P<0.05)，進(jìn)一步證明CART基因可以嘗試作為我國(guó)地方牛新品系培育的輔助選擇標(biāo)記。然本實(shí)驗(yàn)由于成本、試驗(yàn)條件等因素制約，致使研究樣本量較小，且只限于大別山牛自身體尺性狀的關(guān)聯(lián)分析，所以，今后對(duì)CART基因的研究要進(jìn)一步深入，以便得出較為詳盡的試驗(yàn)結(jié)論，更好地為我國(guó)地方牛新品系的培育提供理論依據(jù)和實(shí)踐基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

CART基因SNPs對(duì)大別山牛體高、腹圍、腰角寬和坐骨端寬的體尺性狀均有不同程度的影響，可以嘗試將其作為大別山牛新品系培育的主效候選基因或與主基因緊密連鎖的分子標(biāo)記。

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