姚一博，賈 媛，夏小婷，祝遠(yuǎn)魁，藍(lán)賢勇，黃永震，陳 宏，雷初朝﹡

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2. 湖南天華實(shí)業(yè)有限公司，湖南 漣源 417126)

黃牛是我國重要的家畜之一，具有重要的經(jīng)濟(jì)文化價值。我國擁有豐富的黃牛品種資源，可以根據(jù)體態(tài)特征分為低峰、有峰和無峰三種，也可以按照地理分布劃分為長珠、黃淮和蒙古三組[1]。20世紀(jì)末，我國養(yǎng)牛業(yè)飛速發(fā)展，引進(jìn)了大量的外來品種，給地方品種資源帶來了極大的沖擊，一些品種已經(jīng)瀕臨滅絕。因此研究我國地方黃牛品種資源的遺傳多樣性，對地方品種資源的保護(hù)和利用具有重要意義。湘西黃牛主要分布于湖南省的鳳凰、桑植、永順、慈利、花垣等縣，具有體質(zhì)結(jié)實(shí)，肢蹄強(qiáng)健，耐旱，抗?jié)窦澳痛诛暤忍攸c(diǎn)[2]。目前，國內(nèi)對湘西黃牛這個地方品種的研究較少[3]。

高等動物線粒體DNA(mtDNA)是一個閉合的共價環(huán)形雙鏈DNA分子，其遺傳方式遵循母系遺傳，另外還擁有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定簡單、單拷貝、無重組、進(jìn)化快等特點(diǎn)，其中D-loop區(qū)的進(jìn)化速度較mtDNA其他區(qū)域更快，是研究母系遺傳的最好的標(biāo)記之一[4]。Lei等[5]分析了中國28個黃牛地方品種的mtDNAD-loop序列，發(fā)現(xiàn)在不同黃牛品種間mtDNA的遺傳多樣性非常豐富，并揭示了我國黃牛主要為普通牛和瘤牛兩大母系起源。Lai等[6]對14個中國地方黃牛品種的mtDNAD-loop序列多態(tài)性進(jìn)行研究，結(jié)果表明我國黃牛是瘤牛和普通?；旌掀鹪?，且南方和西南方的黃牛受瘤牛的影響更大。本研究測定了33頭湘西黃牛的mtDNA D-loop區(qū)全序列，以探究湘西黃牛的遺傳多樣性，為湘西黃牛的遺傳資源保護(hù)和利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

在湖南省花垣縣采集33頭湘西黃牛血液樣本，帶回實(shí)驗(yàn)室于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 基因組DNA提取及PCR擴(kuò)增測序

利用酚-氯仿法提取黃牛基因組DNA。黃牛mtDNA D-loop全序列采用雷初朝等[7]設(shè)計(jì)的引物，正鏈序列為：5′- CTGCAGTCTCACCATCAACC-3′；反鏈序列為: 5′-GGGGTGTAGATGCTTGC-3′。PCR反應(yīng)體系為20 μL，擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性4 min；94℃變性30 s，59℃退火60 s，72℃延伸90 s，40個循環(huán)；最后72℃延伸10 min，4℃保存。采用1.0%的瓊脂糖凝膠檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，將符合測序要求的PCR產(chǎn)物送至西安擎科澤西生物科技有限責(zé)任公司測序。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析方法

利用DNASTAR中的SeqMan程序進(jìn)行同源序列比對，并進(jìn)行人工校正，以確保所測序列的可靠性。用DNASP 5.0統(tǒng)計(jì)核苷酸多態(tài)位點(diǎn)、單倍型數(shù)量、單倍型多樣度、核苷酸多樣度、平均核苷酸差異等。用MEGA5.0軟件中的Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 湘西黃牛mtDNA D-loop區(qū)核苷酸變異與單倍型多樣度

對33頭湘西黃牛mtDNA D-loop區(qū)全序列長度進(jìn)行分析，結(jié)果表明1頭黃牛 D-loop區(qū)長度為909 bp，11頭黃牛 D-loop區(qū)長度為910 bp，17頭黃牛D-loop區(qū)長度為911 bp，4頭黃牛D-loop區(qū)長度為912 bp，D-loop區(qū)長度的變異是由D-loop區(qū)存在堿基的插入與缺失引起的。共檢測到D-loop區(qū)全序列的變異位點(diǎn)55個，占核苷酸總數(shù)的6.04%，其中轉(zhuǎn)換53個(包括33個C/T轉(zhuǎn)換，20個A/G轉(zhuǎn)換)，約占核苷酸多態(tài)位點(diǎn)的96.4%；1個C/G顛換，約占核苷酸多態(tài)位點(diǎn)的1.8%；1個轉(zhuǎn)換與顛換共存位點(diǎn)(C/G+A/G), 約占核苷酸多態(tài)位點(diǎn)的1.8%。T、C、A、G的含量分別為28.1%、25.3%、33.2%、13.4%，C+G平均含量為38.7%。利用DNASP 5.0軟件比對分析33頭湘西黃牛mtDNA D-loop序列，共發(fā)現(xiàn)15種單倍型(圖1)，其中2個屬于普通牛單倍型，13個屬于瘤牛單倍型。在這15個單倍型中，每個單倍型包含的個體數(shù)如圖1所示。平均核苷酸差異(k)為13.1099，單倍型多樣度(Hd)為0.8750±0.0470，核苷酸多樣度(Pi)為0.0144±0.0042。

圖1 湘西黃牛15個mtDNA D-loop單倍型及其多態(tài)位點(diǎn)

圖2 湘西黃牛15個mtDNA D-loop單倍型構(gòu)建的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 湘西黃牛系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

為了研究各單倍型間的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系，根據(jù)GenBank發(fā)布的歐洲普通牛(No.V00654)和印度瘤牛(No.L27733)作為參考序列，用MEGA5.0軟件對湘西黃牛的15個單倍型構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)。結(jié)果顯示湘西黃牛明顯分為普通牛和瘤牛兩大分支，說明湘西黃牛是普通牛和瘤牛的混合母系起源。

3 討論

目前國內(nèi)關(guān)于地方黃牛品種mtDNA D-loop區(qū)序列的核苷酸多樣性的研究較多[1, 3, 5-16]，但是對于湘西黃牛的mtDNA D-loop區(qū)序列的核苷酸變異分析的報(bào)道較少。周艷等[3]分析了4頭湘西黃牛mtDNA D-loop區(qū)序列多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)其Hd值為0.500，Pi值為0.0006。由于本研究的樣本量是其八倍，所以結(jié)果能更準(zhǔn)確地反映湘西黃牛mtDNA的遺傳多樣性。本研究選擇了33個湘西黃牛個體，對其mtDNA D-loop區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，測序并分析。共發(fā)現(xiàn)55個核苷酸突變位點(diǎn)，其中53個轉(zhuǎn)換、1個顛換、1個轉(zhuǎn)換與顛換共存位點(diǎn)；堿基T、C、A、G的平均百分比分別為28.1%、25.3%、33.2%和13.4%，表明湘西黃牛富含A、T堿基。

單倍型多樣度(Hd)和核苷酸多樣度(Pi)是衡量群體遺傳變異的重要指標(biāo)。Jia等[8]分析了13個中國地方黃牛品種125個個體和2個德國黃牛個體的mtDNAD-loop區(qū)的全序列遺傳多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)其Hd值為0.8880，Pi值為0.0251；張桂香等[13]通過對我國16個黃牛品種共206個個體的線粒體D-loop區(qū)序列多態(tài)性進(jìn)行研究，結(jié)果表明其Hd值為0.9320，Pi值為0.0227。而本研究表明湘西黃牛的Hd值為0.8750，Pi值為0.0144，與Jia等[8]和張桂香等[13]的研究結(jié)果相比要低一點(diǎn)，說明湘西黃牛的mtDNA的遺傳多樣性較低，這可能是由“創(chuàng)立者效應(yīng)”造成的[3]，也可能與湘西黃牛產(chǎn)區(qū)山高坡陡石頭多，環(huán)境相對封閉，沒有大量引進(jìn)周圍湘西黃牛的條件有關(guān)[17]。在33個湘西黃牛個體中，5個普通牛起源的個體(占15.15%)共享2個單倍型，28個瘤牛起源的個體(占84.85%)共享13個單倍型，說明湘西黃牛受瘤牛的影響更大。本研究與周艷等[3]對部分中國南方黃牛mtDNA D-loop區(qū)的研究結(jié)果吻合。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)湘西黃牛mtDNA遺傳多樣性比較低，具有瘤牛和普通牛兩大母系起源，但受瘤牛影響更大。由于湘西黃牛的遺傳多樣性較低，在自然選擇的條件下容易近親繁殖，故應(yīng)加強(qiáng)對該品種資源的保護(hù)和利用。

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