劉 燦，王 嬋，左之才*，王正中，李學(xué)偉，馬繼登

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院環(huán)境公害與動(dòng)物疾病四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川雅安 625014；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院動(dòng)物遺傳育種研究所，四川成都 611130）

黃芪多糖對(duì)腹腔注射大腸桿菌小鼠TLR信號(hào)通路MyD88、ERK及細(xì)胞因子的影響

劉 燦1，王 嬋1，左之才1*，王正中1，李學(xué)偉2，馬繼登2

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院環(huán)境公害與動(dòng)物疾病四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川雅安 625014；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院動(dòng)物遺傳育種研究所，四川成都 611130）

研究黃芪多糖調(diào)節(jié)動(dòng)物機(jī)體的基本免疫應(yīng)答的機(jī)理。試驗(yàn)選取了132只健康小鼠飼養(yǎng)并采樣，其中6只為初始對(duì)照記為感染前72 h（-72 h），其余小鼠分為3組。Ⅰ組為黃芪多糖組（66 mg·kg-1灌胃黃芪多糖），Ⅱ組為模型組（66 mg·kg-1蒸餾水灌胃），Ⅲ組為健康對(duì)照組（66 mg·kg-1蒸餾水灌胃），每日1次，連用3 d；試驗(yàn)第4天，Ⅰ、Ⅱ組小鼠腹腔注射大腸桿菌液（0.1 mL·只-1），Ⅲ組小鼠腹腔注射等體積生理鹽水。在注射后0、3、6、12、24、48、168 h，每組隨機(jī)選取6只小鼠眼球采血分離血清，采用ELISA試劑盒檢測(cè)MyD88、ERK、TNF-α、IL-6指標(biāo)。與Ⅲ組比較，Ⅱ組小鼠在0～48 h的MyD88、ERK、TNF-α、IL-6均升高。與Ⅱ組比較，Ⅰ組小鼠在0 h的MyD88、ERK、TNF-α均升高，在3～24 h的MyD88、ERK，在3～12 h的IL-6均顯著下降（P＜0.05），TNF-α在168 h顯著升高（P＜0.05）。感染大腸桿菌會(huì)明顯激活小鼠MyD88-ERK通路，但當(dāng)預(yù)防用黃芪多糖激活小鼠MyD88-ERK通路后，再感染大腸桿菌時(shí)則并不能引起MyD88-ERK通路的進(jìn)一步激活。預(yù)防用黃芪多糖可減輕大腸桿菌感染引起的應(yīng)激反應(yīng)，緩解其引起的MyD88-ERK通路激活，進(jìn)而達(dá)到調(diào)節(jié)機(jī)體免疫平衡的作用。

黃芪多糖；大腸桿菌；ERK通路；炎癥

Toll受體（Toll-ike receptor，TLR）信號(hào)通路在自身免疫中有著非常重要的作用［1］，內(nèi)毒素（lipopolysaccharide，LPS）為大腸桿菌的致病因子之一，主要激活機(jī)體TLR信號(hào)通路，引起機(jī)體炎癥反應(yīng)。LPS與LBP（脂多糖結(jié)合蛋白）結(jié)合后，通過(guò)CD14傳遞給TLR4/MD2復(fù)合體，形成異源二聚體，通過(guò)兩種不同的接頭蛋白啟動(dòng)兩條信號(hào)通路：TIRAP-MyD88［髓樣分化因子（myeloid differentiation factor 88，MyD88）］通路（MyD88依賴(lài)性途徑）及TRIF-TRAM通路（非MyD88依賴(lài)性途徑）。在MyD88依賴(lài)性途徑中，通過(guò)一系列胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子的信息傳遞可激活I(lǐng)KK/NF-κB及絲裂原活化的蛋白激酶（MAPKs）途徑，MAPKs包括ERK（細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶）、P38、JNK，當(dāng)他們被激活后可誘導(dǎo)核轉(zhuǎn)錄因子AP-1進(jìn)入胞核，啟動(dòng)一系列與應(yīng)激相關(guān)的炎性介質(zhì)如TNF-α（腫瘤壞死因子-α）、IL-1（白細(xì)胞介素-1）、IL-6（白細(xì)胞介素-6）等合成［2］。ERK，稱(chēng)為細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶。當(dāng)其被激活時(shí)可進(jìn)入核內(nèi)，磷酸化AP-1，調(diào)控基因的表達(dá)［3-5］。TNF-α是由巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞產(chǎn)生的炎性細(xì)胞因子，有免疫調(diào)節(jié)、參與發(fā)熱和炎癥發(fā)生的功能［6］。IL-6主要由T細(xì)胞、B細(xì)胞等細(xì)胞產(chǎn)生，是參與免疫調(diào)節(jié)和炎性反應(yīng)的重要細(xì)胞因子之一［7］。另一方面，非MyD88依賴(lài)性途徑主要通過(guò)TRIF/IRF3誘導(dǎo)IFN-β（干擾素-β）的產(chǎn)生［8-10］。

黃芪多糖作為一種具有多重功效的天然提取物質(zhì)，對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)具有非常廣泛的調(diào)節(jié)作用，能全面提高機(jī)體的免疫監(jiān)視和免疫防御功能，增強(qiáng)免疫力，抵抗外界不良因素的侵害［11］。為進(jìn)一步探討黃芪多糖作為感染性疾病預(yù)防用藥的科學(xué)性與合理性，試驗(yàn)研究預(yù)防用黃芪多糖對(duì)腹腔注射大腸桿菌小鼠MyD88依賴(lài)性途徑ERK以及下游細(xì)胞因子的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)昆明小鼠132只，6～8周齡，體重18～22 g，雌雄各半，購(gòu)自四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 試驗(yàn)藥物

黃芪多糖注射液（質(zhì)量體積比10 mg·m L-1），成都乾坤動(dòng)物藥業(yè)有限公司，批號(hào)：20150601。

1.3 試驗(yàn)菌株及菌液配制

大腸桿菌（E.coli）從患水腫病竹鼠腹腔積液中分離，由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)內(nèi)科實(shí)驗(yàn)室保存。對(duì)該菌的前期研究表明，該大腸桿菌對(duì)昆明小鼠的LD0為1.7×107，LD50為9.9×107，LD100為4.3× 108。本試驗(yàn)參照此菌對(duì)昆明小鼠的最大耐受量作為注射濃度。

將E.coli復(fù)蘇并接種于5 m L MH肉湯培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)16～18 h，用平板菌落計(jì)數(shù)法，估算其菌液濃度，再將菌液濃度稀釋至約為1.7×108m L-1，備用。

1.4 主要試劑及儀器

全自動(dòng)熒光酶標(biāo)分析儀（PR-521）。小鼠MyD88、ERK、TNF-α和IL-6的ELISA檢測(cè)試劑盒，均購(gòu)自武漢基因美生物科技有限公司（Lot. 201601）。

1.5 試驗(yàn)動(dòng)物分組及處理

待小鼠適應(yīng)飼養(yǎng)后，按照性別、體重選取6只未作任何處理的健康小鼠直接采樣，作為各組小鼠的初始對(duì)照，記為-72 h；另將精神、體況接近的126只小鼠按照性別、體重分為3組。其中Ⅰ組為黃芪多糖組；Ⅱ組為模型組；Ⅲ組為健康對(duì)照組。Ⅰ組于每日8：00，將制備的黃芪多糖按66 mg· kg-1灌胃，每日1次，連用3 d，Ⅱ、Ⅲ組灌胃同體積蒸餾水。在試驗(yàn)第4天上午8：00，Ⅰ、Ⅱ組小鼠腹腔注射大腸桿菌液（0.1 m L·只-1），Ⅲ組小鼠腹腔注射0.1 m L生理鹽水。在注射后0、3、6、12、24、48、168 h，每組隨機(jī)處死6只小鼠，通過(guò)眼球采血法獲取血液分離血清，進(jìn)行試驗(yàn)。各組按常規(guī)飼養(yǎng)管理。

1.6 樣本采集與檢測(cè)指標(biāo)

1.6.1 臨床觀察

觀察小鼠自主活動(dòng)、體重變化、皮毛、呼吸、攝食、飲水、排泄、死亡等情況。

1.6.2 檢測(cè)指標(biāo)及方法

于試驗(yàn)各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每組隨機(jī)選取6只小鼠，摘除眼球采血0.7 mL，4℃3 000 r·min-1離心20 min，分離血清，-20℃保存?zhèn)溆?。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定血清中MyD88、ERK、TNF-α、IL-6的含量。

1.7 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 11.0軟件進(jìn)行方差分析和多重比較，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著，P＞0.05表示差異不顯著。

2 結(jié)果和分析

2.1 各組小鼠腹腔注射大腸桿菌前后的臨床表現(xiàn)

腹腔注射大腸桿菌前各組小鼠精神狀況良好，飲、食欲正常。腹腔注射大腸桿菌后，小鼠相繼出現(xiàn)患病癥狀，其中Ⅰ組僅有部分小鼠在注射后3～12 h有精神稍差、活動(dòng)減少的表現(xiàn)；24 h后小鼠的行為表現(xiàn)及精神狀態(tài)基本恢復(fù)正常。Ⅱ組在注射后3 h，多數(shù)小鼠的飲、食欲顯著下降，并出現(xiàn)蜷縮現(xiàn)象；6 h左右，部分小鼠精神高度沉郁、呼吸急促，部分小鼠眼周出現(xiàn)分泌物等癥狀；12 h左右，小鼠病情基本穩(wěn)定，與6 h時(shí)觀察到的癥狀相似，且可見(jiàn)被毛無(wú)光澤；24 h左右，小鼠逐漸恢復(fù)正常，較上次觀察時(shí)活潑，飲、食欲有所增加；注射48 h及1周（168 h）后，小鼠精神狀況良好，飲、食欲正常。Ⅲ組小鼠精神狀況良好，飲、食欲正常。各組小鼠均無(wú)死亡。

2.2 小鼠血清中M yD88的變化

與Ⅲ組相比，Ⅱ組小鼠血清MyD88含量在6～24 h均極顯著或顯著升高（表1）。組內(nèi)相比，Ⅱ組小鼠在6和12 h的MyD88含量極顯著高于-72、0、48和168 h，呈先升高后下降的變化趨勢(shì)，在12 h達(dá)到峰值；Ⅲ組小鼠各時(shí)間點(diǎn)的指標(biāo)間變化不顯著。

Ⅰ組小鼠在0 h血清中的MyD88含量極顯著高于Ⅱ組，與Ⅲ組差異不顯著。Ⅱ組在3 h的MyD88含量極顯著高于Ⅰ組；Ⅱ組在6、12、24 h的MyD88含量均顯著或極顯著高于Ⅰ組。從總體上看，Ⅰ組小鼠在感染后的MyD88含量呈下降、升高、下降、升高的變化趨勢(shì)，但整體幅度變化較小，差異不顯著。

上述結(jié)果表明，單獨(dú)腹腔注射大腸桿菌可使小鼠血清中的MyD88含量顯著升高；但當(dāng)用黃芪多糖預(yù)防3 d，小鼠血清中的MyD88升高后，再腹腔注射大腸桿菌并不引起血清中MyD88的進(jìn)一步增高。

2.3 小鼠血清中ERK的變化

由表2可見(jiàn)，Ⅱ組小鼠在3～12 h血清ERK含量均極顯著高于Ⅲ組，其余時(shí)間點(diǎn)差異不顯著。Ⅱ組小鼠的ERK含量，在3 h達(dá)到峰值并極顯著高于其他各時(shí)間點(diǎn)；在6 h、12 h極顯著高于-72、0、24、48、168 h。Ⅲ組小鼠在各時(shí)間點(diǎn)的ERK含量差異不顯著。

表1 小鼠血清中MyD88含量的變化ng·m L-1

表2 小鼠血清中ERK含量的變化ng·m L-1

Ⅱ組小鼠在3、6、12、24 h的ERK含量極顯著高于Ⅰ組。Ⅰ組小鼠各時(shí)間點(diǎn)的ERK含量差異不顯著。

結(jié)果顯示，使用3 d黃芪多糖后，可有效減緩感染大腸桿菌引起的小鼠ERK的升高。

2.4 小鼠血清中TNF-α的變化

與Ⅲ組相比，Ⅱ組小鼠血清中TNF-α含量在3～24 h均極顯著升高（表3）。組內(nèi)相比，Ⅱ組在3 h的TNF-α含量極顯著高于-72、0、48、168 h，呈先升高后下降的變化趨勢(shì)，在3 h達(dá)到峰值；Ⅲ組小鼠各時(shí)間點(diǎn)的指標(biāo)間變化不顯著。

Ⅰ組小鼠在0 h的TNF-α含量均極顯著高于Ⅱ、Ⅲ組。Ⅰ組在感染3、6、12、24、48 h的 TNF-α含量與Ⅱ組無(wú)明顯差異，而在感染168 h的TNF-α含量極顯著高于Ⅱ組。Ⅰ組小鼠在感染后TNF-α含量呈先下降、后升高的變化趨勢(shì)，但整體幅度變化較小，差異不顯著。

結(jié)果顯示，使用3 d預(yù)防用黃芪多糖后，可升高TNF-α水平，而感染大腸桿菌后并不進(jìn)一步升高TNF-α水平。單獨(dú)感染大腸桿菌可明顯升高TNF-α水平。

2.5 小鼠血清中IL-6的變化

與Ⅲ組相比，Ⅱ組小鼠血清中IL-6含量在各時(shí)間點(diǎn)均無(wú)顯著差異（表4）。組內(nèi)相比，Ⅱ組在3 h的IL-6含量極顯著高于-72、0、12、24、48、168 h，呈升高、下降、升高的趨勢(shì)變化，IL-6在3 h達(dá)到峰值。Ⅲ組小鼠各時(shí)間點(diǎn)的指標(biāo)間變化不顯著。

表3 小鼠血清中TNF-α含量的變化ng·L-1

表4 小鼠血清中IL-6的變化ng·L-1

在使用黃芪多糖3 d（0 h）后，各組小鼠的IL-6含量均無(wú)顯著差異。Ⅰ組小鼠在感染3、6、12 h的IL-6含量極顯著低于Ⅱ組；感染24、48、168 h，各組無(wú)顯著差異。總的來(lái)看，Ⅰ組小鼠在感染后IL-6含量呈下降、升高的變化趨勢(shì)。

結(jié)果顯示，使用3 d預(yù)防用黃芪多糖后，可輕度抑制小鼠IL-6水平，而感染大腸桿菌后繼續(xù)抑制IL-6。單獨(dú)感染大腸桿菌可升高IL-6水平。

3 討論

3.1 腹腔注射大腸桿菌對(duì)小鼠M yD88依賴(lài)途徑ERK及下游細(xì)胞因子IL-6、TNF-α的影響革蘭氏陰性菌侵入機(jī)體后釋放出LPS，引起機(jī)體炎癥應(yīng)答。小鼠腹腔內(nèi)注射大腸桿菌會(huì)誘發(fā)急性腹膜炎，引起嚴(yán)重的內(nèi)毒素血癥，致使小鼠出現(xiàn)感染性休克癥狀，最終死亡。而內(nèi)毒素血癥可激活各類(lèi)免疫細(xì)胞釋放多種炎性介質(zhì)和細(xì)胞因子，如TNF-α、lL-6等［12］。

本試驗(yàn)中，當(dāng)小鼠腹腔注射大腸桿菌后，Ⅱ組小鼠血清中MyD88含量在12 h達(dá)到峰值，ERK含量在3 h達(dá)到峰值，而細(xì)胞因子IL-6、TNF-α含量也在3 h達(dá)到高峰，隨后呈下降趨勢(shì)。表明細(xì)菌侵入機(jī)體后，激活MyD88依賴(lài)途徑，在0～3 h激活ERK通路，持續(xù)至12 h。ERK通路在0～3 h的強(qiáng)力激活使得細(xì)胞因子IL-6、TNF-α大量釋放，引起強(qiáng)烈炎癥反應(yīng)。

3.2 黃芪多糖對(duì)腹腔注射大腸桿菌小鼠M yD88依賴(lài)途徑ERK及下游細(xì)胞因子IL-6、TNF-α的影響

從各組小鼠MyD88的變化可以看出，黃芪多糖組小鼠MyD88在6 h顯著降低后又逐漸升高，且整體表現(xiàn)為MyD88水平低于模型組。由此推測(cè)黃芪多糖可能通過(guò)抑制感染大腸桿菌小鼠的TLR4通路中MyD88接頭蛋白的水平，從而減輕機(jī)體受到的炎癥損害。有研究指出，單味中藥其有效成分或中藥復(fù)方可通過(guò)阻斷或抑制TLR4信號(hào)通路中MyD88的表達(dá)，從而減輕炎癥損害［8］。

邵曉軼等［13］指出在LPS誘導(dǎo)大鼠雪旺氏細(xì)胞TNF-α表達(dá)中，ERK信號(hào)通路的激活可能是LPS誘導(dǎo)TNF-α表達(dá)的前提，從而誘導(dǎo)TNF-α、IL-6等細(xì)胞因子的釋放，誘導(dǎo)炎癥損傷。試驗(yàn)中，黃芪多糖組小鼠ERK在3 h急劇下降，極顯著低于模型組和對(duì)照組，TNF-α、IL-6也出現(xiàn)顯著下降，整體均表現(xiàn)為黃芪多糖組顯著低于模型組。張?zhí)N穎［14］、李冬方［15］在研究黃芪多糖對(duì)炎癥模型細(xì)胞所釋放的炎癥因子中發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖能夠顯著下調(diào)IL-6、TNF-α表達(dá)。小鼠灌胃黃芪多糖3 d，MyD88、ERK、TNF-α均升高，而對(duì)IL-6輕度抑制，表明預(yù)防用黃芪多糖可激活MyD88-ERK通路。當(dāng)腹腔注射大腸桿菌后，黃芪多糖組在0～48 h MyD88、ERK、TNF-α、IL-6水平較感染組低，表明感染會(huì)激活MyD88-ERK通路，而預(yù)防用黃芪多糖可減輕或適度抑制感染引起的MyD88-ERK通路的進(jìn)一步激活?？梢?jiàn)，預(yù)防用黃芪多糖可減輕感染所致的應(yīng)激反應(yīng)，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫平衡，進(jìn)而達(dá)到增強(qiáng)機(jī)體免疫功能的目的。

綜上所述，感染大腸桿菌會(huì)明顯激活小鼠MyD88-ERK通路，但當(dāng)預(yù)防用黃芪多糖激活小鼠MyD88-ERK通路后，再感染大腸桿菌時(shí)則并不引起MyD88-ERK通路的進(jìn)一步激活。預(yù)防用黃芪多糖可減輕大腸桿菌感染引起的應(yīng)激反應(yīng)，緩解其引起的MyD88-ERK通路激活，進(jìn)而達(dá)到調(diào)節(jié)機(jī)體免疫平衡的作用。

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（責(zé)任編輯：盧福莊）

S856.3

A

0528-9017（2017）01-0143-04

文獻(xiàn)著錄格式：劉燦，王嬋，左之才，等.黃芪多糖對(duì)腹腔注射大腸桿菌小鼠TLR信號(hào)通路MyD88、ERK及細(xì)胞因子的影響［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，58（1）：143-147.

10.16178/j.issn.0528-9017.20170146

2016-08-21

四川省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2013NZ0032）

劉 燦（1993-），女，四川郫縣人，本科，從事中西獸醫(yī)與臨床工作，E-mail：1107486614@qq.com。

左之才，E-mail：zzcjl@126.com。