王璇，萬代紅，高興娟，趙帥，汪嬌嬌

(煙臺毓璜頂醫(yī)院，山東煙臺 264000)

孟魯司特治療小鼠嗜酸性粒細胞性胃腸炎療效觀察

王璇，萬代紅，高興娟，趙帥，汪嬌嬌

(煙臺毓璜頂醫(yī)院，山東煙臺 264000)

目的 觀察孟魯司特治療卵清蛋白(OVA)誘導的小鼠嗜酸性粒細胞性胃腸炎 (EG)的療效，并探討其作用機制。方法 40只雌性Balb/c小鼠隨機分為正常對照組8只和OVA處理組32只。OVA處理組小鼠腹腔注射OVA和 Al(OH)3溶液行基礎致敏及強化致敏，繼之OVA灌胃激發(fā)胃腸道過敏。造模成功后，將OVA處理組再隨機分為模型組、孟魯司特組、強的松組、強的松+孟魯司特組各8只。模型組及各藥物治療組繼續(xù)給予OVA隔日灌胃激發(fā)胃腸反應，同時藥物治療組分別給予強的松、孟魯司特及二者聯(lián)合灌胃治療。觀察EG小鼠外周血嗜酸性粒細胞(EOS)計數(shù)變化，ELISA法檢測小鼠血清IgE水平,HE染色觀察小鼠胃腸黏膜組織病理學變化,免疫組化方法檢測小鼠空腸組織主要堿性蛋白(MBP)表達。結(jié)果 模型組小鼠外周血EOS計數(shù)、血清IgE水平較正常對照組明顯升高(P均<0.01)；與模型組比較，各藥物治療組小鼠外周血EOS計數(shù)、血清IgE水平降低(P均<0.05)。模型組小鼠空腸MBP表達較正常對照組明顯增強，各給藥組空腸MBP表達均較模型組減弱。模型組小鼠胃黏膜變薄、斷裂、下層充血，黏膜上皮細胞近胃腔端腺上皮脫落，有炎癥細胞浸潤。腸組織上皮細胞水腫，并見局灶性壞死、脫落，有大量炎性細胞浸潤。各給藥組小鼠胃腸黏膜各層結(jié)構(gòu)基本正常，僅見輕微充血及炎癥細胞浸潤，上皮細胞結(jié)構(gòu)基本正常。結(jié)論 孟魯司特通過降低EG小鼠的外周血EOS計數(shù)、IgE水平及空腸組織MBP表達，從而實現(xiàn)對EG的治療作用。

胃腸炎,嗜酸性粒細胞性；白三烯受體拮抗劑，孟魯司特；嗜酸性粒細胞；IgE；主要堿性蛋白；小鼠

嗜酸性粒細胞性胃腸炎 (EG) 是以胃腸道某些部位彌漫性或局限性嗜酸性粒細胞(EOS)異常浸潤為特征的胃腸道疾病。近年來國內(nèi)外有用白三烯受體拮抗劑孟魯司特成功治療EG的臨床個例報道，但缺乏大樣本的臨床對照研究。2014年5月～2016年1月，本研究通過應用孟魯司特與激素對照治療EG小鼠模型，觀察其療效，為合理應用孟魯司特治療EG提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗動物：雌性Balb/c小鼠40只，體質(zhì)量20～22 g，SPF級，購于北京實驗動物研究中心。主要藥物和試劑：卵清蛋白(OVA)、Al(OH)3為Sigma公司產(chǎn)品 ；孟魯司特片(劑量10 mg)為杭州默沙東制藥有限公司饋贈；潑尼松龍片(劑量5 mg)為北京雙鶴藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)。ELISA試劑盒、主要堿性蛋白(MBP)免疫組化試劑盒等為福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司產(chǎn)品。

1.2 動物分組及處理 40只小鼠適應性喂養(yǎng)1周后，隨機分為正常對照組8只和OVA處理組32只。第1天OVA處理組小鼠腹腔注射OVA和Al(OH)3溶液(50 μg/mg)一次以基礎致敏，第15天OVA處理組小鼠腹腔注射用生理鹽水配制的OVA溶液(50 μg/mg)一次達強化致敏，第20～24天給予OVA(50 mg)隔日灌胃激發(fā)胃腸道過敏，制備EG小鼠模型。正常對照組各時間點給予等劑量磷酸鹽緩沖鹽水處理。造模成功后，將OVA處理組再隨機分為模型組、孟魯司特組、強的松組、強的松+孟魯司特組各8只。第26天起OVA處理各組繼續(xù)給予OVA隔日灌胃激發(fā)胃腸反應，同時孟魯司特組、強的松組、強的松+孟魯司特組分別給予孟魯司特(1.5 mg/kg)、強的松(3 mg/kg)、強的松聯(lián)合孟魯司特灌胃，正常對照組、模型組給予相應體積的生理鹽水連續(xù)灌胃。連續(xù)給藥2周。

1.3 檢測方法 處理第40天取材，常規(guī)計數(shù)法檢測小鼠外周血EOS數(shù)量，ELISA法檢測小鼠血清IgE水平，HE染色觀察小鼠胃腸黏膜組織病理學變化，采用免疫組化方法檢測小鼠空腸組織MBP表達。小鼠空腸組織MBP表達結(jié)果判定方法：從每只動物腸組織切片中隨機抽取1張，在低倍鏡下選取陽性細胞最密的區(qū)域，隨機選取10個低倍視野，對染色反應陽性強度、陽性細胞數(shù)進行半定量分析。光鏡下觀察空腸組織形態(tài)學改變。

2 結(jié)果

2.1 五組外周血EOS計數(shù) 連續(xù)給藥2周后，模型組小鼠血清EOS數(shù)量較正常對照組明顯升高(P<0.01)。各給藥組小鼠外周血EOS數(shù)量較模型組降低(P均<0.05)。強的松組、孟魯司特組和孟魯司特+強的松組小鼠外周血EOS數(shù)量比較差異無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。見圖1。

注： 與正常對照組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.05。

圖1 五組外周血EOS計數(shù)

2.2 五組血清IgE水平變化 連續(xù)給藥2周后，模型組小鼠血清IgE水平較正常對照組明顯升高(P<0.01)。孟魯司特+強的松組、孟魯司特組和強的松組血清IgE水平較模型組均降低(P均<0.05)，各給藥組間血清IgE水平比較差異無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。見圖2。

注： 與正常對照組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.05。

圖2 五組血清IgE水平

2.3 五組空腸組織MBP表達變化 正常對照組空腸組織MBP染色強度為±、陽性細胞數(shù)為-，模型組為+++、+++，孟魯司特+強的松組、孟魯司特組、強的松組均為+、+。正常對照組小鼠空腸MBP表達弱，模型組小鼠空腸MBP表達明顯增強，各給藥組空腸MBP表達均較模型組減弱。各給藥組空腸MBP表達無差異。

2.4 五組胃腸組織病理變化 藥物治療2周，正常對照組胃腸黏膜結(jié)構(gòu)正常，厚薄均勻、規(guī)則、完整，未見水腫、充血及炎癥細胞浸潤，黏膜上皮腺細胞均正常，上皮細胞未見壞死、脫落。模型組胃黏膜變薄、斷裂，下層充血，黏膜上皮細胞近胃腔端腺上皮脫落，有炎癥細胞浸潤。腸組織上皮細胞水腫、并見局灶性壞死、脫落，有大量炎性細胞浸潤。各給藥組小鼠胃、腸黏膜各層結(jié)構(gòu)基本正常，僅見輕微充血及炎癥細胞浸潤，上皮細胞結(jié)構(gòu)基本正常。

3 討論

EG主要特征為胃腸道彌漫性或局限性EOS異常浸潤，臨床可表現(xiàn)為腹痛、惡心、嘔吐、腹瀉等，胃腸道病理檢查可見EOS異常浸潤，血液檢查80%的患者有外周血EOS增多。食物過敏誘發(fā)的EG患者血中IgE增高，部分EG患者的胃腸道黏膜中發(fā)現(xiàn)有IgE的增高[1]。到目前為止,沒有FDI批準的特異治療EG的藥物，也沒有關于EG治療的隨機前瞻性臨床試驗。因此，EG的治療僅依據(jù)治療者的臨床經(jīng)驗和患者臨床表現(xiàn)的嚴重程度而定。當前EG治療主要是口服糖皮質(zhì)激素，大多數(shù)患者臨床癥狀可改善，組織學檢查也有好轉(zhuǎn)，外周血EOS正常，但減量后易復發(fā)，停藥后復發(fā)率為55%[2]。長期應用糖皮質(zhì)激素會有水電解質(zhì)紊亂、庫興綜合征、高血糖、生長抑制、骨質(zhì)疏松、垂體及腎上腺皮質(zhì)反應低下等不良反應，可影響兒童的生長發(fā)育，并且少數(shù)還存在糖皮質(zhì)激素依賴和應用大劑量激素病情仍無改善情況[3]。1999年，Neustrom等[4]首次報道了應用孟魯司特成功治療EG患者，可使其臨床癥狀緩解；內(nèi)鏡活檢顯示腸道病理組織學完全改善，外周血EOS降低。但應用孟魯司特治療EG的作用機制報道較少。

OVA誘發(fā)EG小鼠模型顯示EOS浸潤胃腸道是EG重要的發(fā)病機制[5～7]。EOS的浸潤可能造成腺窩增生,上皮細胞壞死和絨毛狀斷裂。激活的嗜酸粒細胞毒性蛋白MBP也可以對腸道黏膜造成損傷。MBP可通過補體和細胞因子受體的參與觸發(fā)EOS，可導致廣泛的EOS活性趨化因子的產(chǎn)生。流行病學研究結(jié)果還表明，在EG患者的胃腸組織中存在顯著的細胞外MBP沉積[8]。胃腸組織中MBP主要通過毒覃堿M2受體發(fā)揮作用,使M2受體功能障礙而增加平滑肌細胞的反應性,又可促使神經(jīng)軸突壞死,降低胃蠕動和胃排空功能,還可以觸發(fā)肥大細胞和嗜堿性細胞脫顆粒,引起組織炎癥反應[9,10]。本研究顯示,孟魯司特、強的松治療均可以顯著改善OVA激發(fā)小鼠血液EOS的水平，降低MBP在空腸的表達，表明孟魯司特可通過顯著減少EOS浸潤胃腸組織，進而減少MBP產(chǎn)生而改善EG的胃腸道癥狀。

Foroughi等[11]研究表明在EOS的炎癥反應中，IgE的介導過程起了重要作用，并揭示抗IgE可能是一個潛在治療EOS相關胃腸道疾病的方法。有資料顯示孟魯司特能明顯降低血清IgE水平[12，13]。本研究也證實,OVA激發(fā)小鼠血中IgE明顯提高，而用孟魯司特治療可使IgE明顯下降至接近正常水平，且與強的松組比較無統(tǒng)計學差異。上述結(jié)果提示孟魯司特可通過抑制IgE介導的炎癥反應起到保護胃腸道的治療作用。本研究顯示，模型組小鼠胃腸病理組織學檢查存在胃腸組織損傷和炎癥細胞浸潤以及廣泛的胃腸黏膜結(jié)構(gòu)紊亂、變薄、斷裂和混濁腫脹。給藥治療后，各治療組胃腸黏膜損傷基本修復。

總之，孟魯司特可使EG小鼠外周血EOS、IgE水平下降，空腸組織MBP表達降低，防止胃腸黏膜損傷。

[1] 陳碩珠，林庚金，徐三榮.實用內(nèi)科學[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2001:1783-1785.

[2] Chan S,Orenstein SP.Eosinophilic gastroenteritis [J].Paediatr Drug,2002,4(9):560-570.

[3] Rothenberg ME.Eosinophilic gastrointestinal disorders (EGID) [J].J Allergy Clin Immunol,2004,113(1):11-28.

[4] Neustrom MR,Friesen C.Treatment of eosinophilic gastroenteritis with montelukast [J].J Allergy Clin Immunol,1999,104(2):506.

[5] Mishra A,Hogan SP,Lee JJ,et al.Fundamental signals that regulate eosinophil homing to the gastrointestinal tract[J] .J Clin Invest,1999,103(12):1719-1727.

[6] Hogan SP,Mishra A,Brandt EB,et al.A critical role for eotaxin in experimental oral antigen-induced eosinophilic gastrointestinal allergy[J].Proc Natl Acad Sci USA,2000,97(12):6681-6686.

[7] Song DJ,Cho JY,Miller M,et al.Anti-Siglec-F antibody inhibits oral egg allergen induced intestinal eosinophilic inflammation in a mouse model[J].Clin Immunol,2009,131(1):157-169.

[8] Mishra A,Hogan SP,Brandt EB,et al.An etiological role for aero allergens and eosinophils in experimental esophagitis [J].J Clin Invest,2001,107(1):83-90.

[9] Evans CM,Fryer AD,Jacoby DB,et al.Pretreatment with antibody to eosinophil major basic Protein prevents hyperresponsiveness by protecting neuronal M2 muscarinic receptors in antigen-challenged guinea pigs[J].J Clin Invest,1997,100(22):54-62.

[10] Adako DJ,Yost BL,Gleich GJ,et al.Ovalbumin sensitization ehanges the inflanunatory response to subsequent Parainfluenza infection:eosinophils mediate airway hyperresponsiveness,M2 musearinic receptor dysfunction and antiviral effects [J].J Exp Med,1999,190(14):65-77.

[11] Foroughi S,Foster B,Kim N,et al.Anti-IgE treatment of eosinophil-associated gastrointestinal disorders [J].J Allergy Clin Immunol,2007,120(3):594-601.

[12] Stelmach I,Bobrowska-Korzeniowska M,Majak P,et al.The effect of montelukast and different doses of budesonide on IgE serum levels and clinical parameters in children with newly diagnosed asthma [J].Pulm Pharmacol Ther,2005,18(5):374-380.

[13] Ehlayel MS,Bener A,Sabbah A.Montelukast treatment in children with moderately severe atopic dermatitis [J].Eur Ann Allergy Clin Immunol,2007,39(7):232-236.

煙臺市科技計劃項目(2014WS018)。

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.01.011

R573.3

A

1002-266X(2017)01-0035-03

2016-11-09)