林周，施晶晶，朱棟曉，吳學(xué)明，孟浩宇，陳彭生，楊志健，陳艷紅，王曉彥

(1無錫市第三人民醫(yī)院，江蘇無錫214041；2江蘇省人民醫(yī)院；3徐州市中心醫(yī)院；4武漢亞洲心臟病醫(yī)院)

麝香酮對急性心肌梗死小鼠心臟結(jié)構(gòu)和功能的影響

林周1，施晶晶1，朱棟曉1，吳學(xué)明1，孟浩宇2，陳彭生3，楊志健2，陳艷紅4，王曉彥1

(1無錫市第三人民醫(yī)院，江蘇無錫214041；2江蘇省人民醫(yī)院；3徐州市中心醫(yī)院；4武漢亞洲心臟病醫(yī)院)

目的 探討麝香酮改善急性心肌梗死小鼠心臟功能和心肌重構(gòu)的作用機制。方法 選取C57BL/6J小鼠63只隨機分為三組，假手術(shù)組9只、麝香酮組27只、對照組27只。通過開胸結(jié)扎左冠脈前降支建立急性心肌梗死模型。假手術(shù)組小鼠只開胸不結(jié)扎左冠脈前降支，予生理鹽水灌胃；麝香酮組結(jié)扎后予麝香酮2 mg/(kg·d)灌胃；對照組結(jié)扎后生理鹽水灌胃。采用心臟超聲測量各組心臟結(jié)構(gòu)及功能指標(biāo)如左室舒張末內(nèi)徑、左室收縮末內(nèi)徑、左室射血分數(shù)和左室短軸縮短率。造模第21天時測定勞力游泳時間后二氧化碳窒息處死小鼠，Masson染色行病理和組織形態(tài)學(xué)檢查。采用TUNEL法檢測細胞凋亡數(shù)，酶聯(lián)免疫吸附試驗測量心肌炎癥因子TGF-β1、TNF-α、IL-1β表達，蛋白質(zhì)印跡分析法測心肌細胞凋亡因子Bcl-2、Bax、NF-κB及Akt-eNOS通路相關(guān)因子p-Akt和p-eNOS表達。結(jié)果 與假手術(shù)組相比，心肌梗死小鼠勞力游泳時間、心臟結(jié)構(gòu)及功能、心臟纖維化程度、心肌炎癥因子、細胞凋亡因子及Akt-eNOS通路相關(guān)因子比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。與對照組比較，麝香酮組小鼠以上觀察指標(biāo)均明顯改善，兩組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。結(jié)論 麝香酮通過抗炎、抗纖維化、抗凋亡能改善心臟重構(gòu)和功能，增強心肌梗死小鼠的運動耐力。

心肌梗死，急性；麝香酮；心肌纖維化；炎癥因子；細胞凋亡；Akt-eNOS通路；小鼠

研究表明，心肌梗死后心肌炎癥、纖維化、細胞凋亡、內(nèi)皮功能障礙等導(dǎo)致左室進行性擴張變形、心功能降低，是影響心肌梗死預(yù)后的主要原因[1]。心肌梗死后，致炎因子如TGF-β1、 TNF-α、IL-1β對心肌的纖維化和重構(gòu)起著重要作用[2]，Bcl-2升高和Bax降低能抑制凋亡和改善心臟功能，Akt和eNOS的磷酸化能保護細胞內(nèi)皮功能[3]。研究表明，麝香酮有抗氧化應(yīng)激損傷、抗炎、抗血管增生和血管擴張作用[4，5]。2016年1～6月，我們通過建立小鼠急性心肌梗死模型探討麝香酮對心肌的保護作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF 級雄性C57BL/6J小鼠，6～8 周齡，體質(zhì)量 18～24 g，由南京醫(yī)科大學(xué)動物模式中心提供。麝香酮購于國家藥物及生化產(chǎn)品管理局(純度> 98%，濃度1 g/mL)。小動物高分辨率超聲成像系統(tǒng)Vevo2100、小動物簡易肢體導(dǎo)聯(lián)ECG、小動物呼吸機、普通光學(xué)顯微鏡、帶Image J 軟件的計算機、自制無菌氣管插管用套管留置針、石蠟包埋切片機、造模相關(guān)手術(shù)器械、生理鹽水、1%戊巴比妥鈉、75%乙醇、2%碘酊、青霉素、易氟烷、石蠟、病理切片試劑、二甲苯、樹膠、Masson染液。

1.2 建立急性心肌梗死模型 取63只小鼠隨機分為三組，假手術(shù)組9只、麝香酮組27只、對照組27只。麻醉后氣管插管開胸結(jié)扎冠脈前降支建立急性心肌梗死模型[6]。假手術(shù)組僅開胸不接扎前降支，予生理鹽水灌胃；麝香酮組結(jié)扎后予麝香酮2 mg/(kg·d)灌胃[7]；對照組結(jié)扎后生理鹽水灌胃。模型建立后每12 h觀察小鼠1次，每周稱體質(zhì)量，統(tǒng)計各組小鼠的死亡數(shù)量。建模前及建模第21天超聲心動圖檢測左室舒張末內(nèi)徑(LVEDd)、左室收縮末內(nèi)徑(LVESd)、左室射血分數(shù)(LVEF)和左室短軸縮短率(LVFS)。第21天測量勞力游泳時間評估運動耐力，運動耐力測量后使用二氧化碳窒息處死小鼠。

1.3 心肌纖維化程度測量 建模第21天時處死小鼠測量離體心臟質(zhì)量，得出心臟/體質(zhì)量比。心臟放在磷酸鹽緩沖液中沖洗，4%多聚甲醛固定一晚后，石蠟包埋，4μm切片，Masson染色，顯微鏡下成像，使用計算機Image J軟件測量心肌纖維化面積。

1.4 細胞凋亡指數(shù)測量 采用TUNEL法。使用DAPI染色觀察切片細胞核形態(tài)，F(xiàn)ITC標(biāo)記的TUNEL陽性細胞由放大400倍的熒光顯微鏡成像。高倍鏡或低倍鏡下隨機選擇5個視野，計數(shù)綠色細胞(TUNEL凋亡細胞)個數(shù)和藍色DAPI總細胞個數(shù)，綠色細胞數(shù)/藍色細胞數(shù)即為細胞凋亡指數(shù)。最終細胞凋亡指數(shù)為5個視野的平均值。

1.5 炎癥因子、細胞凋亡因子及Akt-eNOS通路相關(guān)因子測量 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗測量心肌TGF-β1、TNF-α、IL-1β表達，蛋白質(zhì)印跡分析法測心肌p-Akt、p-eNOS、Bcl-2、Bax、NF-κB等因子表達。測量結(jié)果均為與正常GAPDH對照比較的相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 三組生存率和活動耐力 建模第21天，假手術(shù)組小鼠無死亡、麝香酮組存活25只、對照組存活19只。與對照組比較，麝香酮組小鼠生存率提高(93% vs 74%，P<0.05)。死亡小鼠解剖后示主要原因為心力衰竭。勞力游泳時間假手術(shù)組、麝香酮組、對照組分別為(28.21±0.49)、(20.71±0.73)、(18.70±0.58)min；與假手術(shù)組相比，對照組心肌梗死后勞力游泳時間縮短，經(jīng)麝香酮治療后延長(P均<0.05)。

2.2 三組心臟結(jié)構(gòu)和功能 建模第21天，假手術(shù)組、麝香酮組、對照組LVEDd、LVESd、LVEF、LVFS、心臟/體質(zhì)量比見表1。

表1 三組心臟結(jié)構(gòu)和功能指標(biāo)比較

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與對照組比較，△P<0.05。

2.3 三組心肌纖維化程度 建模第21天，假手術(shù)組、麝香酮組、對照組心肌纖維化面積分別為(2.02±1.02)%、(5.17±1.50)%、(8.33±2.34)%。與假手術(shù)組相比，心肌梗死小鼠的心肌纖維化面積增加(P均<0.05)；與對照組相比，麝香酮治療后纖維化程度降低(P<0.05)。

2.4 三組炎癥因子表達 見表2。

表2 三組炎癥因子表達比較

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與對照組比較，△P<0.05。

2.5 三組心肌細胞凋亡指數(shù)及凋亡因子表達 見表3。

表3 三組心肌細胞凋亡指數(shù)及凋亡因子表達比較

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與對照組比較，△P<0.05。

2.6 三組Akt-eNOS通路因子表達 假手術(shù)組、麝香酮組、對照組心肌中p-Akt分別為(1.016±0.24)%、(1.95±0.25)%、(1.30±0.27)%；p-eNOS分別為(2.82±0.94)%、(6.67±2.67)%、(4.36±1.70)%。與假手術(shù)組相比,心肌梗死小鼠心肌中p-Akt和p-eNOS水平降低 (P均<0.05)；麝香酮組與對照組相比，p-Akt和p-eNOS水平升高(P均<0.05)。

3 討論

炎癥反應(yīng)是心肌梗死后急性內(nèi)源性應(yīng)激反應(yīng)，是心肌創(chuàng)傷修復(fù)和癱痕形成的前提條件，但過度反應(yīng)可引起心室重塑。研究顯示，炎癥因子TGF-β1、TNF -α、IL -1β在心肌梗死后心臟重構(gòu)、心肌纖維化進程中起著重要作用[8]。NF-κB是重要的轉(zhuǎn)錄因子，能促進致炎因子、內(nèi)皮黏附分子和氧化應(yīng)激酶等一系列目標(biāo)基因的表達[9]。NF-κB激活后，TGF-β1、TNF-α和IL-1β表達增加,隨后促進膠原沉積、心肌纖維化導(dǎo)致心臟重構(gòu)和心力衰竭[10]。Morishita等報道，抑制NF-κB的表達可減輕心肌梗死后的心肌損傷。本研究顯示，麝香酮能抑制心肌梗死后TGF-β1、TNF-α、IL-1β、NF-κB等炎癥因子的表達，表明麝香酮的心肌保護作用與其抗炎癥作用有關(guān)。

原癌基因Bcl-2是目前公認的促進細胞生存、抑制細胞凋亡的長壽基因[11]；Bax 基因高表達可抵消或減輕Bcl-2基因的抑制凋亡并促進凋亡的發(fā)生,故被稱為凋亡促進基因。凋亡在心肌梗死和心力衰竭中有重要作用。以往研究表明，在心肌缺血損傷中凋亡和壞死導(dǎo)致了心肌細胞自體吞噬和丟失[12]，其主要原因是Bax家族蛋白的表達抑制Bcl-2家族蛋白的表達。Bcl-2能抑制NF-κB的活性，故表明凋亡與纖維化有關(guān)[13]。我們的研究顯示，麝香酮能上調(diào)Bcl-2表達、抑制Bax表達，降低心肌梗死區(qū)域的細胞凋亡水平，麝香酮通過抗細胞凋亡來抑制心臟重構(gòu)，有可能為心肌保護提供新的途徑。

eNOS活性的平衡是心血管內(nèi)皮功能的重要標(biāo)志[14]。激活eNOS可促進NO的生成，抑制TNF-α炎癥因子的產(chǎn)生，從而通過調(diào)節(jié)血管重構(gòu)和血管新生來保護缺血心臟[15]。已有研究表明，激活磷脂酰肌醇-3激酶信號通路(P13K/PKB)可使Akt快速磷酸化為p-Akt，促使血管內(nèi)皮eNOS磷酸化為p-eNOS而成為激活的eNOS，從而改善心肌缺血再灌注損傷。eNOS活性不足則引起心肌細胞凋亡和心力衰竭。本研究中，麝香酮能誘導(dǎo)Akt、eNOS的磷酸化，麝香酮通過激活PI3K-Akt-eNOS通路對缺血心肌產(chǎn)生保護作用。

本研究顯示，麝香酮對缺血心肌具有抗纖維化、抗炎、抗細胞凋亡、預(yù)防心肌梗死后心臟重構(gòu)以及改善心功能等作用。未來隨著對麝香酮藥理作用認識的深入和制作工藝的提高，麝香酮有望成為心肌梗死患者抗心肌損傷的有效藥物。

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無錫市衛(wèi)計委課題基金資助項目(MS201514)。

王曉彥(E-mail:1807250234@qq.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.01.010

R542.2

A

1002-266X(2017)01-0032-03

2016-08-03)