謝敏，谷萬里

(1 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院，山東青島 266003；2 聊城市人民醫(yī)院)

·基礎(chǔ)研究·

大蒜素調(diào)節(jié)ApoE-/-小鼠心肌細(xì)胞凋亡及穩(wěn)定易損斑塊的作用機(jī)制

謝敏1，谷萬里2

(1 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院，山東青島 266003；2 聊城市人民醫(yī)院)

目的 觀察大蒜素對(duì)ApoE-/-小鼠心肌細(xì)胞凋亡及Galectin-3、α-actin、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的影響，探討大蒜素穩(wěn)定易損斑塊的作用機(jī)制。方法 24只ApoE-/-小鼠高脂飼料喂養(yǎng)8周，并隨機(jī)分為模型組、大蒜素低劑量組、大蒜素高劑量組。模型組給予0.5 mL/(kg·d)生理鹽水灌胃、低劑量組給予0.15 mg/(kg·d)大蒜素灌胃、高劑量組給予0.30 mg/(kg·d)大蒜素灌胃連續(xù)8周。然后，小鼠眼球取血應(yīng)用ELISA法測(cè)定血清糖(GLU)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平；取主動(dòng)脈根部進(jìn)行病理和免疫組化染色檢查壞死核心面積、心肌細(xì)胞凋亡陽(yáng)性面積，取降主動(dòng)脈至髂動(dòng)脈分叉部分采用免疫印跡法檢測(cè)Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)。結(jié)果 三組小鼠血清GLU、TC、TG、LDL-C水平比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均>0.05)；三組小鼠主動(dòng)脈根部斑塊內(nèi)均存在明顯的壞死核心和脂質(zhì)沉積，大蒜素低劑量組壞死核心面積及細(xì)胞凋亡陽(yáng)性面積比值均小于模型組(P均<0.05)；與模型組比較，大蒜素低劑量組斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞減少(P<0.05)，主動(dòng)脈至髂動(dòng)脈分叉部分抗凋亡蛋白Bcl-2明顯升高而促凋亡蛋白Bax顯著降低(P均<0.05)。結(jié)論 低劑量大蒜素可以通過抗凋亡抑制脂質(zhì)沉積和壞死核心的形成，影響斑塊內(nèi)容物和細(xì)胞成分達(dá)到穩(wěn)定易損斑塊的作用。

動(dòng)脈粥樣硬化；大蒜素；易損斑塊；細(xì)胞凋亡；小鼠

易損斑塊的概念首先由Muller等[1]于1992年提出，Naghavi等[2]將其完善為發(fā)展迅速更易形成血栓的肇事斑塊。易損斑塊是導(dǎo)致急性冠脈綜合征、心肌梗死、中風(fēng)及多種心腦血管疾病的病理基礎(chǔ)。既往研究表明，大蒜素具有提高機(jī)體免疫力、調(diào)節(jié)血脂、抗血小板聚集、擴(kuò)張血管及降血壓作用,是一種預(yù)防心血管疾病的天然藥物[3,4]，但其穩(wěn)定斑塊的研究較少。2016年5～8月，本研究通過觀察不同濃度大蒜素對(duì)ApoE-/-小鼠易損斑塊的干預(yù)作用，從而評(píng)估大蒜素抑制巨噬細(xì)胞聚集、調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡及穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 6～8周齡雄性ApoE-/-小鼠24只(品系背景C57BL/6，常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司)，體質(zhì)量20～22 g，飼以致動(dòng)脈粥樣硬化膳食飼料 (江蘇美迪森生物醫(yī)藥有限公司)，飼養(yǎng)在SPF級(jí)動(dòng)物室，室溫22～24 ℃，相對(duì)濕度50%，光照時(shí)間為7:00～19:00。大蒜素(藥物批號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H42022592)由湖北金龍福公司提供；血糖(GLU)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)ELISA試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物科技有限公司；免疫組化用Galectin-3、α-actin、Bcl-2、Bax抗體購(gòu)自美國(guó)Santacruz公司；PVDF膜購(gòu)自Millipore公司；兔抗小鼠α-actin抗體購(gòu)自武漢博士德生物工程公司；其他二抗購(gòu)于Abcam公司；ECL化學(xué)發(fā)光及BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自南京碧云天公司。另有相差顯微鏡及照相系統(tǒng)(德國(guó)Carl Zeiss Jena公司)、圖像分析儀Image Pro Plus 6.0(美國(guó)Macro media公司)、M750-B型分光光度儀(日本導(dǎo)津公司)。

1.2 動(dòng)物分組及處理 24只ApoE-/-小鼠高脂飼料喂養(yǎng)8周，并隨機(jī)分為模型組、大蒜素低劑量組、大蒜素高劑量組各8只。模型組給予0.5 mL/(kg·d)生理鹽水灌胃、低劑量組給予0.15 mg/(kg·d)大蒜素灌胃、高劑量組給予0.30 mg/(kg·d)大蒜素灌胃，連續(xù)8周。灌胃結(jié)束后1%戊巴比妥腹腔注射麻醉小鼠，眼球取血應(yīng)用ELISA法測(cè)定GLU、TC、TG、LDL-C。冰生理鹽水灌注去除血管內(nèi)殘余血液，無菌條件下取出小鼠心臟保存于4%多聚甲醛中，降主動(dòng)脈至髂動(dòng)脈分叉處保存于液氮中。

1.3 組織病理學(xué)檢查 心臟常規(guī)脫水透明后行石蠟包埋，顯微鏡下觀察待管腔變圓后，于主動(dòng)脈根部開始連續(xù)切片，切片厚度5 μm，每張切片保留2個(gè)組織面，每個(gè)標(biāo)本留取30張切片。每間隔4張切片取1張進(jìn)行TUNEL染色、Masson染色、天狼星紅染色以及Galectin-3(1∶200)、Bcl-2(1∶100)、Bax(1∶150)、α-actin(1∶50)免疫組化染色。取各個(gè)斑塊全視野拍照后利用IPP6.0軟件分析留取數(shù)據(jù)。Western blotting法檢測(cè)降主動(dòng)脈至髂動(dòng)脈分叉部分抗凋亡蛋白Bcl-2、促凋亡蛋白Bax的表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 三組血清糖脂水平變化 三組小鼠血清GLU、TC、TG、LDL-C水平比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均>0.05)。見圖1。

圖1 三組血清糖脂水平(mmol/L)

2.2 三組主動(dòng)脈根部斑塊壞死核心面積、細(xì)胞凋亡陽(yáng)性面積比值 Masson及TUNEL染色顯示，三組ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈根部斑塊內(nèi)都存在明顯的壞死核心(棕色區(qū)域?yàn)殛?yáng)性)，大蒜素灌胃處理后壞死核心面積及細(xì)胞凋亡陽(yáng)性面積比值均有減小趨勢(shì)。見表1。

表1 三組壞死核心面積、細(xì)胞凋亡陽(yáng)性面積比值比較

注：與模型組比較，*P<0.05。

2.3 三組粥樣硬化斑塊內(nèi)容物構(gòu)成 與模型組比較，低劑量大蒜素灌胃處理后斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞陽(yáng)性區(qū)域(Galectin-3免疫組化染色)顯著減小(P<0.05)。與模型組比較，血管平滑肌細(xì)胞(α-actin免疫組化染色)、膠原成分(天狼星紅染色)表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表2。

表2 三組粥樣硬化斑塊內(nèi)容物構(gòu)成比較

注：與模型組比較，*P<0.05。

2.4 兩組凋亡相關(guān)蛋白表達(dá) 與模型組比較，低劑量大蒜素處理后主動(dòng)脈至髂動(dòng)脈分叉部分抗凋亡蛋白Bcl-2明顯升高而促凋亡蛋白Bax顯著降低(P均<0.05)。見圖2。

圖2 兩組Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)

3 討論

大蒜素作為中藥大蒜中的單體有效成分具有散寒通絡(luò)、活血化瘀的作用。唐代陳藏器在《本草拾遺》中記載大蒜“除風(fēng)濕，破冷氣……宣通溫補(bǔ)，無以加之”。研究發(fā)現(xiàn)，大蒜素可以通過調(diào)控氣體信號(hào)分子和改善微循環(huán)，對(duì)寒凝血瘀型心肌缺血有較好治療和保護(hù)作用[5]。馬曉紅等[6]結(jié)扎動(dòng)脈造成大鼠腦缺血微循環(huán)障礙,靜脈給予大蒜新素，發(fā)現(xiàn)該方法能較好地改善微循環(huán)異常，減少腦部缺血再灌注損傷。其他學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，大蒜素在抗人宮頸癌Hela細(xì)胞、肺癌細(xì)胞等方面均有誘導(dǎo)作用[7,8]。動(dòng)脈粥樣硬化不穩(wěn)定斑塊內(nèi)的細(xì)胞凋亡是一種正調(diào)控的級(jí)聯(lián)反應(yīng)過程[9]。巨噬細(xì)胞通過吞噬大量沉積在主動(dòng)脈上的脂質(zhì)形成泡沫細(xì)胞，而這些脂質(zhì)對(duì)巨噬細(xì)胞本身具有毒性，而且易損斑塊內(nèi)部微環(huán)境中的氧化應(yīng)激、代謝產(chǎn)物及炎癥因子有促進(jìn)細(xì)胞凋亡、壞死并加速臨近細(xì)胞凋亡作用，而大量壞死成分融和則形成富含脂質(zhì)的血栓成分壞死核心[10]。斑塊內(nèi)富含的膠原纖維成分覆蓋在壞死核心之上，可防止在血壓的作用下斑塊破裂壞死核心成分暴露，形成血栓導(dǎo)致腦梗死和心肌梗死等疾病。因此纖維帽的厚度和膠原的含量多少也決定了斑塊的穩(wěn)定性[11]。平滑肌細(xì)胞成分是斑塊內(nèi)分泌膠原的主要成分，有助于穩(wěn)定易損斑塊。

細(xì)胞凋亡在促進(jìn)不穩(wěn)定斑塊的形成過程中起著重要作用[12]。Bcl-2家族是典型的抗凋亡蛋白，Bax則有顯著促斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞凋亡的作用，Bcl-2、Bcl-xl等抗凋亡蛋白可以和Bax、Bad等促凋亡蛋白形成異二聚體防止凋亡的發(fā)生，Bcl-2和Bax蛋白之間的平衡決定了斑塊內(nèi)凋亡的趨勢(shì)和走向[13]。我們發(fā)現(xiàn)，小劑量大蒜素具有顯著抑制斑塊內(nèi)壞死核心和抗凋亡的作用，而且有助于增加斑塊內(nèi)膠原面積、減少斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞聚集。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)斑塊內(nèi)部抗凋亡蛋白Bcl-2明顯增加而促凋亡蛋白Bax顯著減少，因此大蒜素通過調(diào)控巨噬細(xì)胞凋亡、壞死從而穩(wěn)定易損斑塊。本研究初步揭示了大蒜素穩(wěn)定易損動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的作用機(jī)制，此為預(yù)防臨床斑塊破裂導(dǎo)致的急性事件提供了理論依據(jù)。

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山東省中醫(yī)藥科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2015485)。

谷萬里(E-mail:guwanli@126.com)

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A

1002-266X(2017)01-0029-03

2016-09-19)