陳虹，鐘丹妮，高宗燕，吳曉靜，韋露明

(廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院,南寧530021)

膽紅素尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶1A1基因突變與新生兒黃疸易感性的關(guān)系

陳虹，鐘丹妮，高宗燕，吳曉靜，韋露明

(廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院,南寧530021)

目的 探討膽紅素尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶1A1基因(UGT1A1)第1外顯子A1及啟動子區(qū)TATA盒基因突變與廣西新生兒黃疸的關(guān)系。方法 152例廣西籍新生兒分為高膽紅素血癥組(病例組)102例及健康對照組50例，采用PCR和DNA直接測序法檢測兩組UGT1A1第1外顯子及啟動子區(qū)TATA盒基因型，比較兩組UGT1A1 G71R基因型分布及等位基因頻率差異，觀察病例組UGT1A1基因突變類型及其不同基因型患兒出生后72 h后血清總膽紅素水平。結(jié)果 兩組UGT1A1 G71R基因型分布及等位基因頻率比較差異有統(tǒng)計學意義(P均<0.01)。病例組檢出G71R錯義突變40例，啟動子A(TA)7突變2例，715C→T雜合無義突變1例。病例組G71R純合子患兒血清總膽紅素水平高于野生型及雜合子患兒(P均<0.05)。結(jié)論 UGT1A1基因 G71R突變是廣西新生兒黃疸主要突變類型，該突變與新生兒高膽紅素血癥有密切關(guān)系；新發(fā)現(xiàn)的715C→T無義突變可能是新生兒膽紅素腦病發(fā)生的重要原因之一。

高膽紅素血癥；新生兒；膽紅素尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶1A1；基因

新生兒黃疸或高膽紅素血癥是新生兒期的常見表現(xiàn)，是由于新生兒血中膽紅素升高引起的皮膚黏膜黃染現(xiàn)象，及時治療后大部分嬰兒恢復正常；如黃疸重癥且治療不及時，過多的膽紅素可通過血腦屏障引發(fā)膽紅素腦病，損害新生兒中樞神經(jīng)系統(tǒng)，導致新生兒聽力、運動、智力受損，甚至死亡。尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶1A1(UGT1A1)是體內(nèi)催化膽紅素進行解毒作用的關(guān)鍵酶[1]。目前全世界已確定UGT1A1基因存在130余種突變類型[2]，其中大多數(shù)基因突變可導致酶活性降低或缺失，影響體內(nèi)膽紅素的結(jié)合反應(yīng)，使膽紅素積聚而引起黃疸,且其基因突變類型存在人種和地域差異。廣西是新生兒黃疸的高發(fā)區(qū)，目前尚有部分患兒的黃疸病因及機理不明。本研究探討UGT1A1第1外顯子及啟動子區(qū)TATA盒突變與廣西新生兒黃疸的關(guān)系，以便為廣西新生兒黃疸的病因診斷及治療提供更多遺傳學依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2013年12月～2015年12月在本院確診為高膽紅素血癥的廣西籍足月新生兒102例(病例組)。男54例、女48例，胎齡(274.2±9.8)d，出生體質(zhì)量(3 249.6±304.3)g，日齡3～7 d。新生兒高膽紅素血癥的診斷標準為：血清總膽紅素升高且以間接膽紅素升高為主，時齡血清總膽紅素值達到或超過2014年新生兒高膽紅素血癥診斷和治療專家共識[3]的新生兒小時膽紅素列線圖第95百分位；同時排除影響和引起新生兒黃疸的因素如新生兒溶血癥、G6PD缺乏癥、敗血癥、窒息、低血糖、酸中毒、高熱、低體溫等。102例患兒中，有膽紅素腦病2例，90%為母乳喂養(yǎng)，經(jīng)光療、藥物治療黃疸完全消退。另取同時期本院廣西籍足月健康新生兒50例(對照組)，男26例、女24例，胎齡(275.6±8.2)d，出生時體質(zhì)量(3 220.5±417.3)g；其性別構(gòu)成、胎齡、出生體質(zhì)量等與病例組比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。對照組早期部分出現(xiàn)黃疸，但膽紅素水平未達到新生兒高膽紅素血癥的診斷標準；新生兒全部母乳喂養(yǎng)，黃疸無需干預，自行完全消退。

1.2 UGT1A1基因檢測 采集新生兒臍血或外周血(ACD抗凝)2 mL，利用DNA抽提試劑盒(TIANGEN公司產(chǎn)品)，依照說明書行外周血白細胞DNA提取，放置-20 ℃保存?zhèn)溆?。根?jù)UGT1A1基因第1外顯子序列和側(cè)翼結(jié)構(gòu)并參考文獻[4]設(shè)計引物。序列為：F引物5′-AAGTGAACTCCCTGCTACCTT-3′，R引物5′-GCTTGCTCAGCATATATCTGGG -3′。引物序列由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司合成。引物擴增包含第1外顯子A1及TATA盒的1 106 bp片段。PCR反應(yīng)體系:總體積 50 μL,10×PCR緩沖液(15 mmol MgCl2) 5 μL,4×dNTP(10 mmol)1.0 μL,測序引物F、R各1.0 μL，模板DNA 1.0 μg,Taq DNA聚合酶2.5 μL，去離子水補充至50 μL。PCR反應(yīng)條件:94 ℃預變性8 min；94 ℃變性1 min，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，循環(huán)35次；72 ℃延伸8 min。取PCR產(chǎn)物加入loading buffer混勻，采用含Ⅰ型核酸染料的2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，將鑒定正確的PCR產(chǎn)物送上海生物工程公司進行DNA直接測序。

1.3 新生兒血清總膽紅素水平檢測 出生后72 h取新生兒靜脈血2 mL，EDTA抗凝,采用全自動生化分析儀測定血清總膽紅素值。

2 結(jié)果

2.1 UGT1A1基因突變類型 ①G71R錯義突變40例： UGT1A1基因第1外顯子區(qū)第211位有G→A點突變(G211A)，第71位密碼子GGA變成AGA，相應(yīng)編碼的甘氨酸變成精氨酸(Gly71Arg，G71R)。測序結(jié)果見圖1。②啟動子A(TA)7突變2例：TATA盒野生型為A(TA)6TAA，TA數(shù)目改變?yōu)門ATA盒 A(TA)7TAA。測序結(jié)果見圖2。③715C→T雜合無義突變1例：UGT1A1基因第1外顯子區(qū)第715位C→T置換，導致終止密碼子TAG取代谷氨酰胺密碼子CAG，提前出現(xiàn)的終止密碼子使多肽鏈合成提前終止致UGT1A1活性完全喪失。該患兒因是雜合子，只表現(xiàn)UGT1A1活性減低。測序結(jié)果見圖3。全部152例樣本在UGT1A1基因第1外顯子均未檢出其他突變類型，如F83L、P229Q突變等，即全部是野生型。

圖1 G71R測序圖

圖2 TATA盒測序圖

圖3 715位堿基測序圖

2.2 兩組UGT1A1 G71R基因型分布及等位基因頻率 兩組UGT1A1 G71R基因型分布及等位基因頻率比較差異有統(tǒng)計學意義(χ2分別為13.495、16.801,P均<0.01)。見表1。

2.3 病例組G71R不同基因型新生兒血清膽紅素水平 病例組102例患兒根據(jù)基因型不同分為G71R突變型純合子(A/A)10例、雜合子(A/G)26例、野生型(G/G)66例，出生后72 h各型血清膽紅素水平分別為(23.7±4.8)、(18.2±2.9)、(17.3±2.7)mg/dL。G71R純合子與野生型和雜合子比較，血清膽紅素水平差異有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)；G71R雜合子與野生型比較，血清膽紅素水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表1 兩組UGT1A1 G71R基因型分布及等位基因頻率比較

3 討論

UGT1A1酶是動物體內(nèi)重要的代謝酶，大量內(nèi)源性和外源性化合物在其催化下與尿苷二磷酸葡萄糖醛酸進行葡萄糖醛酸結(jié)合反應(yīng),形成葡萄糖醛酸結(jié)合物,水溶性增加，易于隨膽汁和尿液排出。因此，葡萄糖醛酸結(jié)合反應(yīng)是體內(nèi)產(chǎn)物和體外異物在機體內(nèi)重要的解毒途徑。UGT1基因位于人類2號染色體長臂(2q37)，由5′端的第1外顯子和3′端的第2～5共同外顯子組成。每個第1外顯子編碼獨特的氨基末端區(qū)，這是與底物的結(jié)合部位，決定同工酶的底物特異性；不同的同工酶與葡萄糖醛酸結(jié)合的共同位點由第2～5共同外顯子編碼。UGT1A1酶是第1外顯子A1和第2～5共同外顯子編碼組成的產(chǎn)物，能特異性催化膽紅素葡萄糖醛酸結(jié)合反應(yīng)。UGT1A1基因包括起調(diào)節(jié)表達作用的啟動子區(qū)和編碼區(qū)，前者含TATA盒，為非編碼區(qū)。目前已證實UGT1A1的多態(tài)性是引起黃疸的重要遺傳因素，在基因非編碼區(qū)啟動子突變使表達減少或基因編碼區(qū)發(fā)生等位突變都會使UGT1A1酶活性降低，引起不同程度的高膽紅素血癥。

迄今為止，世界范圍內(nèi)已確定的UGT1A1基因突變類型有130余種，在第1外顯子及啟動子區(qū)就存在50余種。UGT1A1基因突變類型存在人種和地域差異，在歐美、非洲地區(qū)較多見的是啟動子TATA盒的插入或缺失突變[5，6]，亞洲地區(qū)僅有少量該突變類型的報道。本研究檢出G71R突變較多，其等位基因頻率在病例組和對照組分別為22.55%、4.0%，與我國臺灣地區(qū)Huang等[7]的研究結(jié)果相近，但低于日本人群[8]。這與報道的亞洲地區(qū)編碼區(qū)突變較多見且G71R為主要突變類型相符[9]。該突變?yōu)閁GT1A1基因第一外顯子的211位堿基由G突變?yōu)锳，使71號密碼子由編碼甘氨酸的GGA變?yōu)榫幋a精氨酸的AGA。病例組G71R等位基因頻率明顯高于對照組，提示G71R突變與廣西新生兒病理性黃疸的發(fā)病存在相關(guān)性。同時本研究顯示G71R突變型純合子高膽紅素血癥患兒出生72 h后總膽紅素水平明顯高于野生型，提示G71R突變加重廣西新生兒黃疸的嚴重程度,與本課題組之前的研究一致[10]。因此認為G71R突變是廣西新生兒高膽紅素血癥發(fā)生、發(fā)展的高危因素，是新生兒病理性黃疸的病因之一。本研究人群中僅檢出2例黃疸患兒發(fā)生啟動子區(qū)(TA)7突變，未檢出第1外顯子區(qū)F83L、P229Q等突變。說明(TA)7突變不是本研究人群黃疸的主要致病因素，與國外報道的(TA)7突變并非亞洲主要突變類型一致[4]。

本研究發(fā)生1例膽紅素腦病患兒其UGT1A1基因發(fā)生715C→T雜合突變，該715C→T無義突變使編碼谷氨酸的密碼子變?yōu)榻K止密碼子，提前出現(xiàn)的終止密碼子導致UGT1A1酶活性顯著降低繼而發(fā)生重癥黃疸即膽紅素腦病。對該患兒家族成員進行了追蹤研究，顯示該患兒的父母均存在715C→T雜合突變，該患兒生后4 d時出現(xiàn)膽紅素腦病癥狀，經(jīng)換血、光療、藥物等積極治療，患兒黃疸完全消退好轉(zhuǎn)出院。而其姐姐在幾年前因高膽紅素血癥入住本病區(qū)，于1歲6個月時因反復重度高膽紅素血癥治療無效夭折。當時收集其血標本提取DNA行UGT1A1基因多態(tài)性檢測，應(yīng)用突變特異性擴增系統(tǒng)法僅檢測出已發(fā)現(xiàn)的G71R常見突變點，所以未能及時發(fā)現(xiàn)該新突變?，F(xiàn)將其姐姐的DNA標本按本研究方法進行第1外顯子A1及啟動子區(qū)TATA盒基因突變檢測，發(fā)現(xiàn)存在715C→T純合無義突變，該突變使編碼谷氨酰胺的密碼子變?yōu)榻K止密碼子(Q239X)，提前出現(xiàn)的終止密碼子可導致UGT1A1酶活性完全喪失，診斷為Crigler-Najjar Syndrome Type Ⅰ[11]。因此715C→T突變可能是新生兒發(fā)生膽紅素腦病的重要原因之一，是新生兒黃疸的致殘致死突變類型。

近年來，有研究者對11例高未結(jié)合膽紅素血癥——Crigler-Najjar Syndrome Type Ⅱ患者的UGT1A1基因行全基因突變檢測，發(fā)現(xiàn)Y486D突變是其主要致病因素[12]，與日本[13]和韓國[14]的研究結(jié)果一致。Y486D突變是UGT1A1基因第5外顯子的1 456位堿基由T突變?yōu)镚，使486號密碼子由酪氨酸變?yōu)樘於彼?(c.1456T>G:p.Y486D)。本課題組前期對218例高膽紅素血癥及190例健康新生兒行UGT1A1基因全基因突變檢測，未檢出該突變類型[15]。提示Y486D突變可能與廣西新生兒黃疸的發(fā)病無直接相關(guān)性，因此本研究中未涉及到UGT1A1基因第5外顯子的突變檢測。至于廣西新生兒黃疸是否存在Y486D突變，有待擴大樣本進一步研究。

[1] Tukey RH,Strassburg CP.Human UDP-glucuronosyltransferases:metabolism,expression,and disease [J].Annu Rev Pharmacol Toxicol,2000,40:581-616.

[2] Canu G,Minucci A,Zuppi C,et al.Gilbert and Crigler-Najjar syndromes:An update of the UDP-glucuronosyltransferase 1A1 (UGT1A1) gene mutation database [J].Blood Cells Mol Dis,2013,50(4):273-280.

[3] 中華醫(yī)學會兒科學分會新生兒學組.新生兒高膽紅素血癥診斷和治療專家共識[J].中華兒科雜志,2014,52(10):745-748.

[4] Akaba K,Kimura T,Sasaki A,et al.Neonatal hyperbilirubinemia and mutation of the bilirubin uridine diphosphate-glucuronosyltransferase gene ：A common missense mutation among Japanese,Koreans and Chinese[J].Biochem Mol Biol Int,1998,46(1):21-26.

[5] Bosma PJ,Chowdhury JR,Bakker C,et al.The genetic basis of the reduced expression of bilirubin UDP-glucuronosyltransferase 1 in Gilbert′s syndrome[J].N Engl J Med,1995,333(18):1171-1175.

[6] Monaghan G,Ryan M,Seddon R,et al.Genetic variation in bilirubin UPD-glucuronosyltransferase gene promoter and Gilbert′s syndrome[J].Lancet,1996,347(9001):578-581.

[7] Huang CS,Chang PF,Huang MJ,et al.Relationship between bilirubin UDP-glucuronosyl transferase 1A1 gene and neonatal hyperbilirubinemia[J].Pediatr Res,2002,52(4):601-605.

[8] Maruo Y，Nishizawa K，Sato H，et al.Association of neonatal hyperbilirubinemia with bilirubin UDP-glucuronosyltransferase polymorphism [J].Pediatrics，1999，103(6 Pt 1)：1224-1227.

[9] Long J,Zhang S,Fang X,et al.Association of neonatal hyperbilirubinemia with uridine diphosphate-glucuronosyltransferase 1A1 gene polymorphisms:meta‐analysis [J].Pediatr Int,2011,53(4):530-540.

[10] 高宗燕,鐘丹妮,劉義,等.膽紅素-尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶G71R基因型對廣西地區(qū)新生兒黃疸程度的影響[J].中華兒科雜志,2010,48(9):646-649.

[11] 馮于玲，高宗燕，鐘丹妮，等.Crigler-Najjar I型綜合征患者及其家系UGTlAl基因的遺傳分析[J].中華實用兒科臨床雜志,2014,29(11):847-850.

[12] Li L,Deng G,Tang Y,et al.Spectrum of UGT1A1 variations in Chinese patients with crigler-najjar syndrome type Ⅱ[J].PLoS One,2015,10(5):e0126263.

[13] Maruo Y,Nakahara S,Yanagi T,et al.Genotype of UGT1A1 and phenotype correlation between Crigler-Najjar syndrome type Ⅱ and Gilbert syndrome[J].J Gastroenterol Hepatol,2016,31(2):403-408.

[14] Ko JS,Chang JY,Moon JS,et al.Molecular analysis of the UGT1A1 gene in Korean patients with crigler-najjar syndrome type Ⅱ[J].Pediatr Gastroenterol Hepatol Nutr,2014,17(1):37-40.

[15] Wu XJ,Zhong DN,Xie XZ,et al.UGT1A1 gene mutations and neonatal hyperbilirubinemia in Guangxi Heiyi Zhuang and Han populations[J].Pediatr Res,2015,78(5):585-588.

Relationship between bilirubin uridine diphosphate-glucuronosyl transferase 1A1 gene mutation and susceptibility to neonatal jaundice

CHENHong,ZHONGDanni,GAOZongyan,WUXiaojing,WEILuming

(TheFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China)

Objective To investigate the relationship between newborn jaundice of Guangxi population and the gene mutation in exon 1 and TATA box of bilirubin uridine diphosphate-glucuronosyl transferase (UGT1A1).Methods Totally 102 cases with newborn hyperbilirubinemia (case group) and 50 neonates without newborn jaundice (control group) were included.TATA box and exon 1 genotypes of UGT1A1 in the two groups were detected by PCR and direct sequencing.UGT1A1 G71R genotype distribution and the differences in allele frequencies were compared between these two groups.The types of UGT1A1 mutation in the case group and the total serum bilirubin (TSB) levels in children patients at 72 hours after birth with different genotypes were observed.Results Significant difference was found in the UGT1A1 G71R genotype distribution and allele frequencies between these two groups (allP<0.01).There were 40 cases with G71R missense mutation,2 cases with (TA)7 insertion mutation,and 1 case with 715C→T heterozygous nonsense mutation in the case group.In the case group,the TSB level of G71R homozygous children patients was higher than that of the wild type and heterozygous children (allP<0.05).Conclusions The G71R mutation of UGT1A1 gene is the main mutation type and closely related with newborn hyperbilirubinemia in Guangxi region.The new-found 715C→T nonsense mutation may be one of the important causes of neonatal bilirubin encephalopathy.

hyperbilirubinemia; neonatal; bilirubin uridine diphosphate-glucuronosyltransferase1A1; gene

國家自然科學基金資助項目(81060055)。

陳虹(1990-),女，碩士，研究方向為新生兒黃疸。E-mail:1160087221@qq.com

鐘丹妮(1962-)，女，教授，研究方向為新生兒疾病。主持國家自然科學基金2項，廣西自然科學基金項目多項；其“廣西新生兒黃疸臨床特點與葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶”的研究獲廣西科技進步三等獎。E-mail:danny5911@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.01.007

R575

A

1002-266X(2017)01-0022-04

2016-08-05)