路建軍，張勇濤，倪梅，呂慧霞

(1山東大學(xué)齊魯醫(yī)院，濟南250012；2齊河縣人民醫(yī)院；3青島市中心醫(yī)院)

細胞色素上皮源性因子對巨噬細胞表面CD36蛋白表達的影響

路建軍1,2，張勇濤3，倪梅1，呂慧霞1

(1山東大學(xué)齊魯醫(yī)院，濟南250012；2齊河縣人民醫(yī)院；3青島市中心醫(yī)院)

目的 探討細胞色素上皮源性因子(PEDF)對小鼠動脈粥樣硬化(AS)斑塊內(nèi)巨噬細胞及RAW264.7細胞表面CD36蛋白表達的影響。方法 選取8周齡雄性ApoE-/-小鼠20只，隨機分為對照組、PEDF組各10只，PEDF組尾靜脈注射PEDF，對照組尾靜脈注射同等量的生理鹽水；高脂喂養(yǎng)16周處死小鼠，采用免疫組化染色法檢測兩組主動脈根部組織巨噬細胞表面CD36蛋白表達。將RAW264.7細胞以高糖DMEM培養(yǎng)24 h后分為ox-LDL組、ox-LDL+陰性病毒轉(zhuǎn)染(G)組、ox-LDL+PEDF組、Con組。待細胞貼壁約8 h后，ox-LDL組、ox-LDL+ G組、ox-LDL+PEDF組均給予ox-LDL 80 μg/mL，Con組不給予ox-LDL；另將腺病毒包繞的PEDF以MIC值為30轉(zhuǎn)染進ox-LDL+PEDF組細胞；應(yīng)用免疫印跡法測定四組RAW264.7細胞CD36表達。結(jié)果 與對照組比較，PEDF組主動脈根部AS斑塊內(nèi)巨噬細胞表面CD36 蛋白表達降低(14.00±1.155 vs 29.00±0.577，P<0.05)。ox-LDL組、ox-LDL+G組、ox-LDL+PEDF組、Con組RAW264.7細胞CD36蛋白表達分別為0.754±0.055、0.831±0.072、0.547±0.002、0.339±0.033；與Con組比較，ox-LDL組、ox-LDL+G組CD36蛋白表達水平升高(P均<0.05)；與ox-LDL組、ox-LDL+G組比較，ox-LDL+PEDF組CD36蛋白表達水平降低(P均<0.05)。結(jié)論 PEDF能有效下調(diào)巨噬細胞表面CD36的表達，可能是未來AS治療中的潛在靶點。

動脈粥樣硬化；細胞色素上皮源性因子；CD36 ；小鼠

動脈粥樣硬化(AS)具有變質(zhì)、滲出和增生等炎癥性疾病的基本病理特征，而炎性細胞的浸潤是其發(fā)生、發(fā)展過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[1]。脂蛋白在血管內(nèi)膜的過度積累可激活內(nèi)皮細胞，生成趨化因子，促使單核細胞進入血管內(nèi)膜，并分化為成熟的巨噬細胞。在受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用下，巨噬細胞不斷攝取氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)等被修飾的脂蛋白。當巨噬細胞內(nèi)積聚的脂質(zhì)超過其自身代謝能力時，則轉(zhuǎn)化為泡沫細胞，逐漸形成AS斑塊[2]。細胞色素上皮源性因子(PEDF)屬于絲氨酸蛋白酶超家族成員，具有高度保守的序列和獨特的分子結(jié)構(gòu)，在心血管系統(tǒng)中具有抗炎、抗血栓、抗凋亡及抑制血管新生等作用[3]。既往研究證實，清道夫受體(SRs)CD36是調(diào)控巨噬細胞泡沫化，促進AS形成的關(guān)鍵因子[4]。然而，PEDF是否可以影響CD36的表達及功能，進而調(diào)控巨噬細胞吞噬脂質(zhì)的過程，發(fā)揮抗AS作用，目前尚未見相關(guān)報道。2014年12月～2015年12月，我們通過體內(nèi)及體外實驗對AS形成過程中PEDF與CD36之間的關(guān)系進行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料 8周齡雄性ApoE-/-小鼠20只，均購自于北京維通利華公司；兔抗鼠CD36多克隆抗體購自于美國Santa Cruz公司，SP-9001免疫組化試劑盒、DAB顯色液、羅丹明標記山羊抗鼠IgG均購自于北京中杉生物技術(shù)有限公司，PEDF購自于Abcam公司,RAW264.7細胞株購自于美國ATCC。

1.2 小鼠分組及處理 ApoE-/-小鼠20只飼喂1周，隨機分為對照組、PEDF組各10只，高脂喂養(yǎng)16周。PEDF組尾靜脈注射PEDF，劑量為1×108TU/只；對照組尾靜脈注射同等量的生理鹽水。兩組ApoE-/-小鼠處死后分別取主動脈根部組織，迅速置入4%多聚甲醛溶液中，常規(guī)石蠟包埋、切片。

1.3 AS斑塊內(nèi)巨噬細胞表面CD36蛋白表達檢測 采用免疫組化染色法。取小鼠主動脈根部組織切片，按照SP-9001免疫組化試劑盒說明書步驟操作。一抗為兔抗鼠CD36多克隆抗體，1∶100倍稀釋；陰性對照一抗為PBS。新鮮配置的DAB溶液顯色3～5 min，自來水充分沖洗，蘇木素復(fù)染、脫水、透明、中性樹膠封片。在400倍視野下，每例標本選5張切片，每張切片選主動脈組織分布及染色均勻的4個視野，采用Image pro-Plus 6.0圖文分析系統(tǒng)對結(jié)果進行定量分析。細胞內(nèi)呈現(xiàn)棕色反應(yīng)顆粒判定為陽性，以陽性表達面積與總面積的比值作為相對蛋白表達水平。

1.4 RAW264.7細胞培養(yǎng)、分組及PEDF轉(zhuǎn)染 將RAW264.7細胞種植于6孔板，以高糖DMEM(10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素)貼壁培養(yǎng)24 h，然后分4組，即ox-LDL組、ox-LDL+陰性病毒轉(zhuǎn)染(G)組、ox-LDL+PEDF組、Con組。待細胞貼壁約8 h后，ox-LDL組、ox-LDL+ G組、ox-LDL+PEDF組均給予ox-LDL 80 μg/mL，Con組不給予ox-LDL；另將腺病毒包繞的PEDF以MIC值為30轉(zhuǎn)染進ox-LDL+PEDF組細胞，24 h后觀察轉(zhuǎn)染的情況，使轉(zhuǎn)染效率達100%。

1.5 RAW264.7細胞CD36蛋白表達 采用免疫印跡法檢測。收集各組RAW264.7細胞，提取總蛋白，Bradford法測定蛋白濃度，-40 ℃凍存。取蛋白提取液以10% SDS聚丙烯酰氨凝膠電泳分離蛋白、轉(zhuǎn)膜、封閉，一抗CD36(1∶1 000)4 ℃孵育過夜，二抗孵育2 h，ECL發(fā)光液孵育5 min后置于圖像分析系統(tǒng)進行圖像掃描。目的蛋白和內(nèi)參條帶的灰度值以Image pro-Plus 6.0圖文分析系統(tǒng)進行分析，以目的蛋白的灰度值與內(nèi)參蛋白的灰度值比值作為相對蛋白表達水平。

2 結(jié)果

2.1 兩組AS斑塊內(nèi)巨噬細胞表面CD36蛋白表達 PEDF組主動脈根部AS斑塊內(nèi)巨噬細胞表面CD36 蛋白為14.00±1.155，對照組為29.00±0.577;與對照組比較，PEDF組主動脈根部AS斑塊內(nèi)巨噬細胞表面CD36 蛋白表達顯著降低(P<0.05)。見圖1。

2.2 四組RAW264.7細胞CD36蛋白表達 ox-LDL組、ox-LDL+G組、ox-LDL+PEDF組、Con組RAW264.7細胞CD36蛋白表達分別為0.754±0.055、0.831±0.072、0.547±0.002、0.339±0.033。與Con組比較，ox-LDL組、ox-LDL+G組CD36蛋白表達水平升高(P均<0.05)。與ox-LDL組、ox-LDL+G組比較，ox-LDL+PEDF組CD36蛋白表達水平降低(P均<0.05)。見圖2。

注：A為對照組；B為PEDF組；與對照組比較，*P<0.05。

圖1 兩組主動脈根部AS斑塊內(nèi)巨噬細胞表面CD36蛋白表達

注：與Con組比較，*P<0.05；與ox-LDL、ox-LDL+G組比較，#P<0.05。

圖2 四組RAW264.7細胞CD36蛋白表達

3 討論

CD36屬于B類SRs，在20世紀80年代，最初作為血栓黏合素的受體在血小板的表面被發(fā)現(xiàn)，隨后研究證實，其廣泛存在于單核細胞、巨噬細胞、血小板、內(nèi)皮細胞、脂肪細胞和視網(wǎng)膜上皮細胞以及AS病變中[5]。目前認為，AS斑塊的大小、穩(wěn)定性均與巨噬細胞不斷吞噬ox-LDL，形成泡沫細胞有關(guān)，而CD36又是巨噬細胞發(fā)揮這一功能的關(guān)鍵因子，巨噬細胞攝取ox-LDL量的60%～70%均依賴于CD36的正常功能[4,6,7]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)單純給予小鼠來源的巨噬細胞系RAW264.7細胞ox-LDL刺激，其CD36蛋白表達水平較Con組顯著增高，說明了巨噬細胞在吞噬ox-LDL的過程中，其CD36蛋白的表達明顯上調(diào)。隨后，我們又將PEDF轉(zhuǎn)染入RAW264.7細胞內(nèi)，結(jié)果顯示，ox-LDL組的CD36蛋白表達水平與ox-LDL+G組相仿，說明陰性病毒對巨噬細胞的CD36表達影響較小。但是，PEDF組CD36蛋白表達水平較ox-LDL組、ox-LDL+G組顯著降低。由于小鼠的AS斑塊與人類極其相似，且小鼠基因序列已知，可以對其進行基因敲除或基因敲入，故已成為目前應(yīng)用最為廣泛的AS動物模型[8]。因此，在體內(nèi)研究中，我們利用高脂喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠建立AS動物模型，并給予PEDF干預(yù)。結(jié)果顯示，PEDF干預(yù)能顯著抑制主動脈根部AS斑塊內(nèi)CD36的表達。AS是血管壁的慢性炎癥，是對血管壁損傷的一種反應(yīng)和修復(fù)過程。而單核/巨噬細胞及T淋巴細胞是這一過程的主要炎癥細胞[9]。既往研究也證實人冠狀A(yù)S斑塊內(nèi)含大量巨噬細胞和激活的T淋巴細胞，尤其是在不穩(wěn)定心絞痛斑塊內(nèi)[10]。并且，CD36主要在巨噬細胞表面表達。因此，我們認為PEDF對AS斑塊內(nèi)巨噬細胞的CD36表達具有顯著下調(diào)作用。

既往研究發(fā)現(xiàn)，PEDF可以直接作用于單核細胞/巨噬細胞并誘導(dǎo)其發(fā)生遷移和分化[11]。另外，PEDF促腫瘤細胞死亡的作用與其誘導(dǎo)巨噬細胞膜TRAIL的表達有關(guān)[12]。這些研究均提示PEDF與巨噬細胞間存在密切的聯(lián)系，PEDF是調(diào)控巨噬細胞功能的上游靶點。PEDF是一種多功能蛋白，在體內(nèi)具有抗炎、抗血栓形成和血管保護作用[13]。研究報道，PEDF不僅可以抑制大鼠球囊拉傷術(shù)后的動脈新生內(nèi)膜增生，還可以抑制閉塞性血栓形成[14,15]。另外，抑制人臍靜脈內(nèi)皮細胞的PEDF表達下調(diào)可以改善ox-LDL引起的血管內(nèi)皮損傷[16]。這些研究均證實PEDF具有顯著的抗AS作用。

綜上所述，PEDF具有抑制AS斑塊內(nèi)巨噬細胞SRs CD36表達的作用。但是，PEDF是否對AS患者具有保護作用，仍需進行大量的實驗加以證實。

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Effect of pigment epithelium-derived factor on expression of CD36 protein on surface of macrophages

LUJianjun1,ZHANGYongtao,NIMei,LYUHuixia

(1QiluHospital,ShandongUniversity,Jinan250012,China)

Objective To determinate the effect of pigment epithelium-derived factor (PEDF) on the expression of CD36 protein on the surface of macrophages in mouse atherosclerotic plaque and RAW264.7 cells.Methods In vivo,20 male ApoE-/-8-week-old mice were randomly divided into two groups:the control group and PEDF group.Ten mice in PEDF group were intravenously injected with PEDF to achieve high-level PEDF expression,and ten mice in the control group were given same amount of saline solution.The mice were put to death after 16-week high-fat feeding.The aortic root tissues were removed and immunohistochemistry was applied to evaluate the expression of CD36 protein on the surface of macrophages.In vitro,RAW264.7 cells were cultured in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with high glucose.After 24 hours,the RAW264.7 cells were divided into four groups:ox-LDL group,ox-LDL+ negative vector (G) group,ox-LDL + PEDF group,and Con group.In addition to the Con group,the other three groups were given 80 μg/mL ox-LDL.A adenovirus vector containing a mouse PEDF expression sequence was constructed and transduced into ox-LDL + PEDF group with MIC value of 30.CD36 expression in the four groups was assessed by Western blotting.Results The expression of CD36 protein on the surface of macrophages in aortic root plaque of the PEDF group was 14.00±1.155,which was lower as compared with that of the control group 29.00±0.577,P<0.05.In vitro,the expression of CD36 protein in the ox-LDL group,ox-LDL+G group,ox-LDL + PEDF group,and Con group was 0.754±0.055,0.831±0.072,0.547±0.002,and 0.339±0.033,respectively.Compared with Con group,the expression of CD36 protein in the ox-LDL group and ox-LDL+G group was increased (allP<0.05).Compared with ox-LDL group and ox-LDL+G group,the expression of CD36 protein in the ox-LDL + PEDF group was decreased (allP<0.05).Conclusion PEDF can effectively down-regulate CD36 expression on the surface of macrophages,which suggests that PEDF may serve as a potential target in the treatment of atherosclerosis.

atherosclerosis; pigment epithelium-derived factor; CD36; mice

國家自然科學(xué)基金資助項目(81270403)；“香江學(xué)者”項目計劃(201104629)；中國博士后科學(xué)基金項目(2014M551914)。

路建軍(1982-)，男，在讀研究生，主要研究方向為冠狀動脈粥樣硬化的發(fā)病機制及臨床診治。E-mail:sgly120@163.com

倪梅(1972-)，女，副主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士，碩士生導(dǎo)師，主要研究方向為冠心病的發(fā)病機制及臨床診治。E-mail:nimei999@163.com

呂慧霞(1975-)，女，副主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士，碩士生導(dǎo)師，主要研究方向為動脈粥樣硬化的發(fā)病機制及其干預(yù)。E-mail:lvhuixia2004@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.01.002

R541.4

A

1002-266X(2017)01-0004-04

2016-07-28)