馮健，吳丹，陳旭昕，劉應才，李家富

(1西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院，四川瀘州646000；2中國人民解放軍海軍總醫(yī)院)

·論著·

G蛋白偶聯(lián)膽汁酸受體1激活對高糖誘導小鼠心肌細胞肥大的影響

馮健1，吳丹1，陳旭昕2，劉應才1，李家富1

(1西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院，四川瀘州646000；2中國人民解放軍海軍總醫(yī)院)

目的 探討G蛋白偶聯(lián)膽汁酸受體1(TGR5)激活對高糖誘導小鼠心肌細胞肥大的影響。方法 原代培養(yǎng)小鼠心肌細胞，將細胞分為對照組、高糖組、高糖+INT-777(TGR5受體激動劑)組、高糖+INT-777+TGR5 shRNA(以TGR5干擾慢病毒包裝)組。采用圖像分析系統(tǒng)測定各組細胞表面積，通過RT-PCR及Western blotting方法檢測TGR5干擾慢病毒效率，RT-PCR檢測各組促肥大因子(心房鈉尿因子、β-肌球蛋白重鏈)mRNA表達變化。結(jié)果 成功培養(yǎng)小鼠心肌細胞。與對照組比較，高糖組心肌細胞表面積及促肥大因子mRNA表達增加(P均<0.05)。激活TGR5后，由高糖導致的心肌細胞表面積及促肥大因子mRNA表達的增加受到抑制(P均<0.05)。與激活TGR5組比較，干擾TGR5基因后，心肌細胞表面積及促肥大因子mRNA表達明顯增加(P均<0.05)。結(jié)論 激活TGR5受體可以抑制高糖誘導的心肌細胞肥大及促肥大因子mRNA表達，可能是糖尿病性心肌病重要的藥物治療靶點。

心肌細胞肥大；G蛋白偶聯(lián)膽汁酸受體；高糖誘導；INT-777；心房鈉尿因子；β-肌球蛋白重鏈；小鼠

長期的糖尿病可導致糖尿病性心肌病，患者出現(xiàn)心肌肥厚及心肌纖維化，最終出現(xiàn)心力衰竭、惡性心律失常甚至死亡[1]。G蛋白偶聯(lián)膽汁酸受體1(TGR5)是一種新型的調(diào)節(jié)機體能量代謝的“開關(guān)”，對血脂異常、肥胖、糖尿病等代謝性疾病有重要調(diào)控作用。近來大量研究表明，TGR5可能是各種代謝性疾病治療的重要藥物靶點[2,3]。但尚未見其在糖尿病性心肌病方面的相關(guān)研究報道。2015年3月～2016年3月，我們以小鼠心肌細胞為研究對象，給予高糖刺激，運用TGR5干擾慢病毒，檢測心肌細胞表面積、細胞總蛋白、心房鈉尿因子(ANF)及β-肌球蛋白重鏈(β-MHC)表達變化，進而探討TGR5在高糖誘導心肌細胞肥大中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 出生0～3 d的乳小鼠、雌雄不限、SPF級(西南醫(yī)科大學實驗動物中心提供)，TGR5抗體(Santa Cruz Biotechnology)，RT-PCR試劑盒、RT-PCR合成引物(大連寶生物工程有限公司)，INT-777(Med Chem Express)，澳洲胎牛血清(BOVOGEN)，多聚賴氨酸、DMEM/F12培養(yǎng)基(Hyclone)，葡萄糖(Sigma)，Ⅱ型膠原酶(GIBICO)，5-溴脫氧尿嘧啶核苷(Sigma)，α-actinin、免疫組化試劑盒(博士德)，胰酶、蛋白酶抑制劑、蛋白裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、DAPI (Beyotime )。

1.2 心肌細胞的原代培養(yǎng)及分組 小鼠心肌細胞的原代培養(yǎng)參照我們之前的實驗方法進行[4]，并將心肌細胞隨機分為四組。對照組：給予5 mmol/L 葡萄糖培養(yǎng)48 h；高糖組：給予33 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)48 h；高糖+INT-777組：同時加入高糖33 mmol/L及TGR5特異性激動劑INT-777 30 μmol/L，培養(yǎng)48 h；高糖+INT-777+TGR5 shRNA組：先給予TGR5干擾慢病毒感染細胞后(TGR5 shRNA由上海漢恒生物科技有限公司設計并合成，以慢病毒包裝)，再加入高糖及INT-777培養(yǎng)48 h。

1.3 心肌細胞表面積和總蛋白測定 每組隨機選取6個視野，每個視野選取10個細胞，利用圖像分析軟件描記和測量單個細胞的表面積。去除培養(yǎng)液，用PBS液清洗3遍，加入蛋白裂解液裂解細胞，離心后取上清，采用BCA法測量各組總蛋白含量。

1.4 細胞 TGR5、ANF、β-MHC基因表達檢測 參照此前文獻報道的RT-PCR方法進行[5]。各組細胞經(jīng)干預后，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后參照試劑盒說明書進行操作。TGR5基因：上游引物：5′-CTCATCGTCATCGCACC-3′；下游引物：5′-GCAAGCAGGGAAAGGAAACA-3′。ANF基因：上游引物：5′-TGGGCTTCTTCCTCGTCTT-3′；下游引物：5′-TCCAGGTGGTCTAGCAGGTT-3′。β-MHC基因：上游引物：5′-CTGTCCGTGCAATGACGA-3′；下游引物：5′-GCTGGTGTTCTGCGAGTGC-3′。GAPDH基因：上游引物：5-′TGCTGTCCTGTATGCCTCTG-3′；下游引物：5′-TTGATGTCACGCACGATTTCC-3′。以GAPDH為內(nèi)參，結(jié)果以目的基因與GAPDH基因的比值表示。

1.5 細胞TGR5蛋白表達檢測 參照我們此前實驗的Werstern blotting方法進行[6]。細胞干預24 h后提取各組心肌細胞總蛋白，測定樣品濃度，灌膠并上樣后，電泳槽電泳，轉(zhuǎn)膜，加入一抗及二抗后用凝膠掃描成像，進行圖像分析。

2 結(jié)果

2.1 TGR5干擾慢病毒小鼠心肌細胞TGR5 mRNA及蛋白表達 對照組TGR5 mRNA及蛋白表達分別為1.67±0.05、1.84±0.07，高糖+INT-777+TGR5 shRNA組TGR5 mRNA 及蛋白表達分別為0.51±0.05、0.60±0.04。與對照組比較，高糖+INT-777+TGR5 shRNA組TGR5 mRNA 及蛋白表達均減少(P均<0.05)。

2.2 四組小鼠心肌細胞表面積和總蛋白 與對照組比較，高糖組心肌細胞表面積明顯增大，總蛋白含量明顯增加(P均<0.05)。與高糖組比較，高糖+INT-777組心肌細胞表面積減小，總蛋白含量明顯減少(P均<0.05)。與高糖+INT-777組比較，高糖+INT-777+TGR5 shRNA組心肌細胞表面積增大，總蛋白含量增加(P均<0.05)。見表1。

表1 四組小鼠心肌細胞表面積和總蛋白比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與高糖組比較，**P<0.05；與高糖+INT-777組比較，△P<0.05。

2.3 四組小鼠心肌細胞ANF及β-MHC mRNA表達 與對照組比較，高糖組心肌細胞ANF及β-MHC mRNA表達明顯增加(P均<0.05)。與高糖組比較，高糖+INT-777組心肌細胞ANF及β-MHC mRNA表達明顯減少(P均<0.05)。與高糖+INT-777組比較，給予TGR5干擾慢病毒后，ANF及β-MHC mRNA表達增加(P均<0.05)。見表2。

3 討論

糖尿病性心肌病是糖尿病的常見并發(fā)癥，心肌肥厚是其主要特征之一。心肌肥厚主要表現(xiàn)為心肌細胞體積增大、蛋白蓄積和促肥厚基因表達增加等[7]。既往研究表明，高糖、血管緊張素Ⅱ等多種因素均能誘導心肌細胞肥大、蛋白質(zhì)合成及促肥厚基因的表達增加[8～10]。此前文獻報道用高糖(33 mmol/L葡萄糖)培養(yǎng)心肌細胞48 h能導致心肌細胞肥大[11]。本研究給予心肌細胞以高糖培養(yǎng)從而建立糖尿病心肌病離體細胞模型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高糖培養(yǎng)乳小鼠心肌細胞48 h，心肌細胞表面積及細胞總蛋白明顯增加，并且引起心肌細胞內(nèi)促肥厚因子ANF及β-MHC的表達增加，表明在此條件下高糖能成功誘導心肌細胞肥大，與既往研究報道的刺激條件一致。

表2 四組小鼠心肌細胞ANF及β-MHC mRNA表達比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與高糖組比較，**P<0.05；與高糖+INT-777組比較，△P<0.05。

TGR5是一種調(diào)節(jié)機體能量代謝的G蛋白偶聯(lián)的膽汁酸受體。一系列的動物實驗研究表明，激活TGR5能增加體內(nèi)的能量輸出、調(diào)節(jié)脂肪代謝，減輕體質(zhì)量；改善胰島素抵抗；改善血管炎癥反應、損傷狀態(tài)；延緩動脈粥樣硬化的發(fā)展等[12～13]。因此，TGR5也可能在高糖誘導的心肌細胞肥大的過程中發(fā)揮作用。TGR5天然激活劑為膽汁酸，但其特異性較差，故本實驗采用TGR5特異性半合成激動劑INT-777，其毒性低，且效價及選擇性較高，可以排除對其他膽汁酸受體的影響。同時，我們在此基礎上采用TGR5干擾慢病毒，能更特異性地顯示出TGR5的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，TGR5特異性激動劑INT-777明顯抑制高糖導致的心肌細胞表面積、總蛋白及ANF、β-MHC mRNA表達增加，提示TGR5激活能改善高糖誘導的心肌細胞肥大。此后給予TGR5干擾慢病毒后，明顯取消了INT-777對高糖誘導的心肌細胞肥大的改善作用，從而再次證明TGR5激活能改善高糖誘導的心肌細胞肥大。

綜上所述，本研究初步探討了激活TGR5在高糖誘導的心肌細胞肥大中的作用，發(fā)現(xiàn)激活TGR5能減輕高糖導致心肌細胞肥大，但其具體作用機制仍需進一步探討。

[1] 黃波，吳陽，薛萊，等.PPARβ及NO在高糖高胰島素誘導心肌細胞肥大中的作用[J].中國病理生理雜志，2015,31(2)：261-266.

[2] Stepanov V,Stankov K,Mikov M.The bile acid membrane receptor TGR5:a novel pharmacological target in metabolic,inflammatory and neoplastic disorders[J].J Recept Signal Transduct Res.2013,33(4):213-223.

[3] Pols TW,Noriega LG,Nomura M,et al.The bile acid membrane receptor TGR5:a valuable metabolic target[J].Dig Dis,2011,29(1):37-44.

[4] 吳丹，馮健，莫顯剛，等.改良的乳小鼠心肌細胞原代培養(yǎng)方法[J].中國比較醫(yī)學雜志,2016,26(4)：62-67.

[5] 楊永紅，張文博，袁鵬英，等.缺氧復氧后腎小管上皮細胞腫瘤壞死因子α的表達及胡黃連提取物對其的作用[J].中國比較醫(yī)學雜志，2013,23(10)：31-35.

[6] Feng J,Zhang P,Chen X,et al.PI3K and ERK/Nrf2 pathways are involved in oleanolic acid-induced heme oxygenase-1 expression in rat vascular smooth muscle cells[J].J Cell Biochem,2011,112(6):1524-1531.

[7] Tham YK,Bernardo BC,Ooi JY,et al.Pathophysiology of cardiac hypertrophy and heart failure：signaling pathways and novel therapeutic targets[J].Arch Toxicol,2015，89(9):1401-1438.

[8] 周慶峰，劉純慧，王洪新.海膽黃多糖SEP抑制高糖高胰島素誘導的大鼠乳鼠心肌細胞肥大[J].中國藥理學通報，2015，31(6)：844-847.

[9] Rodrigues PG,Leite-Moreira AF,Falc′o-Pires I.Myocardial reverse remodeling:how far can we rewind [J].Am J Physiol Heart Circ Physiol，2016,310(11):H1402-1422.

[10] Jia G,DeMarco VG,Sowers JR.Insulin resistance and hyperinsulinaemia in diabetic cardiomyopathy[J].Nat Rev Endocrinol，2016,12(3):144-153.

[11] 孟哲穎，王玉，林艷端，等.成纖維細胞生長因子21對高糖誘導心肌細胞肥大的保護作用[J].上海交通大學學報(醫(yī)學版)，2015,35(1):23-28.

[12] Kumar DP,Rajagopal S,Mahavadi S,et al.Activation of transmembrane bile acid receptor TGR5 stimulates insulin secretion in pancreatic β cells[J].Biochem Biophys Res Commun,2012,427(3):600-605.

[13] Katsuma S,Hirasawa A,Tsujimoto G.Bile acids promote glucagon-like peptide-1 secretion through TGR5 in a murine enteroendocrine cell line STC-1[J].Biochem Biophys Res Commun,2005,329(1):386-390.

Effect of G-protein-coupled bile acid receptor 1 activation on high glucose-induced cardiomyocyte hypertrophy in mice

FENGJian1,WUDan,CHENXuxin,LIUYingcai,LIJiafu

(1TheAffiliatedHospitalofSouthwestMedicalUniversity,Luzhou646000,China)

Objective To investigate the effect of G-protein-coupled bile acid receptor 1 (TGR5) receptor activation on high glucose-induced cardiomyocyte hypertrophy in mice.Methods After primary culture of mouse cardiomyocytes,the cells were divided into the control group,high glucose group,high glucose + INT-777 (the agonist of TGR5 receptor) and high glucose + INT-777+TGR5 shRNA group.Image analysis system was used for determination of cell surface area,RT-PCR and Western blotting were used to detect the lentivirus efficiency of TGR5 interference,and the expression of pro-hypertrophy genes was detected by RT-PCR.Results The mouse cardiomyocytes were successfully cultured.Compared with the control group,cardiomyocytes′ surface area and pro-hypertrophy gene mRNA expression increased in the high glucose group (allP<0.05).TGR5 activation inhibited the increase of cardiomyocytes′ surface area and pro-hypertrophy gene mRNA expression which was induced by high glucose (allP<0.05).Compared with high glucose+INT-777 group,cardiomyocytes′ surface area and pro-hypertrophy gene mRNA expression increased significantly after TGR5 gene interference (allP<0.05).Conclusion TGR5 receptor activation can inhibit cardiomyocyte hypertrophy and pro-hypertrophy gene mRNA expression induced by high glucose,which may be an important drug target for diabetic cardiomyopathy.

cardiomyocyte hypertrophy; G-protein-coupled bile acid receptor; high glucose induction; INT-777; atrial natriure factor; β-myosin heavy chain； mice

國家自然科學基金資助項目(31300946)。

馮健(1982-)，男，副主任醫(yī)師，博士，主要從事冠心病診治的基礎與臨床研究。 E-mail：415623fj@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.01.001

R542.2

A

1002-266X(2017)01-0001-03

2016-07-30)