劉爽，楊洋，聶開立，王萌，鄧?yán)?/p>

1.開封高級(jí)中學(xué)，開封 475003

2.北京化工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100029

3.廈門北化生物產(chǎn)業(yè)研究院有限公司，廈門 361026

多不飽和脂肪酸結(jié)構(gòu)酯酶法合成工藝的研究

劉爽1，楊洋2，聶開立3，王萌2，鄧?yán)?

1.開封高級(jí)中學(xué)，開封 475003

2.北京化工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100029

3.廈門北化生物產(chǎn)業(yè)研究院有限公司，廈門 361026

運(yùn)用低溫溶劑結(jié)晶法富集藻油中多不飽和脂肪酸，最佳結(jié)晶條件為-20℃靜置結(jié)晶72h，丙酮溶劑與藻油的體積質(zhì)量比30∶1（v/wt, mL/g）。在此條件下，藻油sn-2位的脂肪酸組成中PUFA含量從74.8%提高到92.2%。以富集后的藻油和癸酸為底物，合成富含PUFA的結(jié)構(gòu)酯，優(yōu)化了酸解反應(yīng)條件：以脂肪酶Ls-20為催化劑，以正己烷為反應(yīng)介質(zhì)，底物藻油與癸酸的摩爾比1∶10，酶用量10%（占底物藻油的質(zhì)量百分比），氮?dú)獗Ｗo(hù)，40℃，180rpm反應(yīng)25h。利用低溫溶劑結(jié)晶法分離純化酸解產(chǎn)物，在丙酮與油脂的體積質(zhì)量比1.6∶1（v/wt, mL/g），-20℃下結(jié)晶24h，結(jié)構(gòu)酯回收率達(dá)到78.7%。

多不飽和脂肪酸結(jié)構(gòu)酯；脂肪酶；酸解反應(yīng)；低溫溶劑結(jié)晶；結(jié)構(gòu)酯

多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids, PUFA）是主碳鏈上有多個(gè)不飽和鍵的脂肪酸，主要來源于深海魚和微藻。以二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）、二十二碳五烯酸（docosapentaenoic acid，DPA）和二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）等PUFA為主要營(yíng)養(yǎng)成分的醫(yī)藥保健產(chǎn)品備受消費(fèi)者關(guān)注[1-2]。研究表明，PUFA在預(yù)防和改善心血管疾病、抑制腫瘤生長(zhǎng)、預(yù)防老年癡呆、促進(jìn)視力和腦神經(jīng)發(fā)育等方面具有重要的生理活性和廣闊的應(yīng)用前景[3-4]。

目前，市場(chǎng)上含有PUFA的保健品主要有脂肪酸型、乙酯型和甘油酯型三種形式。研究顯示，甘油酯型的PUFA生物利用度最高[5]。但是多不飽和脂肪酸甘油酯因碳鏈較長(zhǎng)而攜帶的能量多，不適于減肥者和運(yùn)動(dòng)員。此外，高不飽和度的碳鏈容易氧化，會(huì)產(chǎn)生過多自由基。因此，通過化學(xué)催化或酶催化改變甘油酯中的脂肪酸組成（脂肪酸種類及含量）和脂肪酸位置分布所得到的人工設(shè)計(jì)合成的結(jié)構(gòu)酯，不僅能夠保留其營(yíng)養(yǎng)保健作用，而且能最大限度地降低脂質(zhì)對(duì)人體的副作用。國(guó)內(nèi)關(guān)于多不飽和脂肪酸結(jié)構(gòu)酯的文獻(xiàn)較少，主要利用魚油作為PUFA來源，由于魚油的PUFA含量有限，產(chǎn)物結(jié)構(gòu)酯中PUFA含量不高[6-7]。Senanayake等[8-9]利用月見草油、琉璃苣油、海獸油等富含PUFA油脂合成多不飽和脂肪酸結(jié)構(gòu)酯，但存在工藝復(fù)雜、成本高的缺點(diǎn)。

利用脂肪酶催化酸解反應(yīng)合成結(jié)構(gòu)酯的工藝相對(duì)簡(jiǎn)單，原料來源更廣泛，生產(chǎn)成本更低，是最具工業(yè)化前景的油脂改性工藝。采用筆者課題組開發(fā)的脂肪酶Ls-20作為催化劑，在成本上較商品化脂肪酶有更顯著的優(yōu)勢(shì)。作為PUFA的兩大來源，藻油相對(duì)于魚油有諸多優(yōu)勢(shì)，如PUFA含量較高、污染較小、成分簡(jiǎn)單、易人工培養(yǎng)等。

采用低溫溶劑結(jié)晶法富集藻油中的多不飽和脂肪酸甘油酯，考察了結(jié)晶時(shí)間、油與溶劑比例等對(duì)結(jié)晶效果的影響，并對(duì)影響脂肪酶催化酸解反應(yīng)的條件進(jìn)行了優(yōu)化，最后比較了不同分離方法對(duì)產(chǎn)品的純化效果，為開發(fā)新型結(jié)構(gòu)酯的合成工藝及微藻資源的高值利用提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 原料與試劑

藻油由天津微藻公司提供；脂肪酶Novo435、RMIM、TLIM，諾維信公司；脂肪酶Ls-20，北京凱泰新世紀(jì)公司；分子篩，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；十七烷酸甲酯，Sigma公司；其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器

氣相色譜儀，GC-2012，日本島津；色譜柱，DB-wax 30×0.53×1，美國(guó)Agilent；TLC-FID，MK-65，日本Iatron Laboratories；高速臺(tái)式離心機(jī)，美國(guó)Beckman；超低溫冰箱，DW-86W100，青島海爾特種電器公司；RE52-99型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；BP211D電子天平，德國(guó)Sartorius。

1.3 甘油酯分析

棒狀薄層氫離子火焰檢測(cè)器色譜儀（TLC-FID）檢測(cè)藻油甘油酯組成。展開劑為V石油醚∶V乙醚∶V98%甲酸=70∶30∶1，空氣流量2L/min，氫氣流量160mL/min。

1.4 脂肪酸組成檢測(cè)

氣相色譜分析甘油酯脂肪酸的組成，脂肪酸甲酯化方法依據(jù)國(guó)標(biāo)方法[10]。DB-WAX色譜柱，30m×0.53mm，膜厚1μm，載氣為氮?dú)?，氫火焰離子化檢測(cè)器。初始溫度50℃，保留時(shí)間1min；以10℃/min的速率升溫到150℃，保留2min；然后以4℃/min的速率升溫到228℃，保留37min。利用十七烷酸甲酯作為內(nèi)標(biāo)分析油脂中脂肪酸的相對(duì)含量。

1.5 脂肪酸位置分析

甘油酯sn-2位脂肪酸分析參照國(guó)標(biāo)方法[11]，略有改動(dòng)，以反應(yīng)混合產(chǎn)物直接作為水解底物，并延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間至5min。sn-1/3位脂肪酸組成分析根據(jù)Angers等[12]的報(bào)道。

1.6 脂肪酶催化酸解反應(yīng)

以正己烷為溶劑，在50mL錐形瓶中加入甘油酯、癸酸和脂肪酶，轉(zhuǎn)速180rpm，恒溫振蕩反應(yīng)。間隔12h取樣分析。

1.7 低溫結(jié)晶

將藻油或反應(yīng)液溶解于一定量的丙酮中，-20℃下靜置冷藏，利用布氏漏斗和減壓抽濾瓶分離固相和液相，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)液相中的丙酮，稱重。

純化過程中液相油脂回收率R1（%），PUFA（DPA、DHA）回收率R2（%），棕櫚酸回收率R3（%），甘油酯的回收率R4（%）的計(jì)算公式如下。

式（1）～（4）中，m0、m1、m2、m3分別為原料質(zhì)量、液相質(zhì)量、回收的甘油酯質(zhì)量和酸解反應(yīng)液中甘油酯質(zhì)量，mg；ρ0、ρ1、ρ2、ρ3分別為原料PUFA（DPA、DHA）含量、液相中PUFA（DPA、DHA）含量、液相棕櫚酸含量和原料棕櫚酸含量，%。

2 結(jié)果與討論

2.1 PUFA的富集

2.1.1 結(jié)晶條件優(yōu)化

富集多不飽和脂肪酸的方法很多，但大多數(shù)方法會(huì)改變甘油酯結(jié)構(gòu)，且結(jié)構(gòu)酯含量不高，因此本研究采用低溫溶劑結(jié)晶法分級(jí)富集藻油中的PUFA。如圖1所示，隨著溶劑比例增加，油脂的溶解度提高，去結(jié)晶后的液相中油脂的PUFA（DHA和DPA，未見EPA）回收率增加，但是棕櫚酸的回收率和回收率增幅要低得多。在溶劑與藻油比例為30mL/g時(shí)富集效果不再提高，此時(shí)DHA回收率達(dá)73%，DPA回收率為66%，棕櫚酸回收率為25%。通過低溫溶劑結(jié)晶法分級(jí)富集藻油中的PUFA，獲得與Morales-Medina等[13]利用同樣方法富集沙丁魚油中的PUFA相似的效果。

結(jié)晶時(shí)間對(duì)液相中油脂及油脂中的脂肪酸的回收也有一定的影響（圖2）。液相中油脂的各主要脂肪酸的結(jié)晶狀態(tài)隨時(shí)間動(dòng)態(tài)變化，液相中油脂中PUFA的回收率先提高后降低，液相中油脂的回收率與液相油脂中的棕櫚酸的回收率隨時(shí)間的變化趨勢(shì)一致，緩慢增加后緩慢降低。結(jié)晶72h時(shí)液相中油脂回收率和油脂中PUFA回收率最高，而結(jié)晶時(shí)間大于72h，液相中油脂的PUFA回收率降低。因而將低溫溶劑結(jié)晶時(shí)間確定為72h。

2.1.2 結(jié)晶對(duì)甘油酯及sn-2位脂肪酸的影響

結(jié)晶對(duì)液相油脂中和油脂中sn-2位脂肪酸的影響如圖3所示，在不計(jì)其他少量飽和脂肪酸情況下，藻油結(jié)晶前后液相油脂中脂肪酸組成發(fā)生顯著變化。PUFA 由53.9%提高到80.9%，棕櫚酸則由46.1%減少至19.1%；sn-2位上的脂肪酸組成PUFA 從74.8%上升至92.2%，棕櫚酸從25.2%降低至7.8%。由此可見，低溫溶劑結(jié)晶富集法獲得了液相油脂中sn-2位富含PUFA的甘油酯。

2.2 脂肪酶催化合成結(jié)構(gòu)酯的條件優(yōu)化

2.2.1 脂肪酶種類

選擇Novo435、RMIM、TLIM和Ls-20四種脂肪酶作為考察對(duì)象。Novo435不具有位置專一性和鏈長(zhǎng)專一性[14]，Ls-20是具有sn-1/3位選擇性的游離脂肪酶[15]，RMIM、TLIM均為具有sn-1/3位置專一性的固定化脂肪酶。

分析表明（圖4），富含PUFA的原料藻油中不含有癸酸，而酸解產(chǎn)物中均不同程度的并入一定量的癸酸。選擇并入一定量的癸酸是由于其在反應(yīng)條件下呈液態(tài)，比棕櫚酸對(duì)心血管等更具生理功效等。從癸酸含量分析可知，Ls-20和RMIM的催化能力大于Novo435和TLIM。Ls-20催化酸解產(chǎn)物結(jié)構(gòu)酯中癸酸的含量為36.8%，能有效置換原甘油酯中的飽和脂肪酸棕櫚酸，棕櫚酸在甘油酯中的含量從13.4%降低至2.4%。由于Ls-20和RMIM的催化能力相當(dāng)，綜合考慮催化效果和催化劑成本，選擇Ls-20作為催化劑。

2.2.2 反應(yīng)時(shí)間

反應(yīng)時(shí)間對(duì)酸解合成結(jié)構(gòu)酯非常重要。反應(yīng)時(shí)間過短，結(jié)構(gòu)酯產(chǎn)率較低，反應(yīng)時(shí)間過長(zhǎng)，會(huì)發(fā)生?；D(zhuǎn)移。根據(jù)癸酸并入甘油酯和甘油酯sn-2位和sn-1/3位的相對(duì)量變化情況可以決定最佳的反應(yīng)時(shí)間。如圖5所示，癸酸并入甘油酯sn-1/3位的量，在反應(yīng)25h后達(dá)到平衡，癸酸并入甘油酯和甘油酯sn-2的相對(duì)量增長(zhǎng)緩慢。研究目的是合成sn-1/3位富含癸酸sn-2位富含PUFA的結(jié)構(gòu)酯，因此要求sn-1/3位較多地加入癸酸，而sn-2位較多地保留PUFA。因此，選擇25h為最佳的反應(yīng)時(shí)間。

2.2.3 底物摩爾比

圖1 溶劑與藻油的比例對(duì)液相中油脂的主要脂肪酸回收率的影響

圖2 結(jié)晶時(shí)間對(duì)液相中油脂的PUFA和棕櫚酸回收率的影響

圖3 結(jié)晶對(duì)甘油酯及其sn-2位脂肪酸的影響

目標(biāo)結(jié)構(gòu)酯理論上含有2分子癸酸和1分子PUFA，癸酸在甘油酯中相對(duì)質(zhì)量比為50%左右最接近結(jié)構(gòu)酯的脂肪酸組成。反應(yīng)系統(tǒng)中癸酸過量，有利于平衡向生成目標(biāo)產(chǎn)物的方向進(jìn)行。Mu等[16]提出高的脂肪酸/甘油酯比例可以縮短反應(yīng)時(shí)間，避免酰基轉(zhuǎn)移。但是在過高的脂肪酸/甘油酯比例下，反應(yīng)初期脂肪酸會(huì)酸化微水環(huán)境而抑制脂肪酶的活力[17]。在不影響酶活性的前提下，可以盡量提高癸酸與甘油酯的比例，促進(jìn)結(jié)構(gòu)酯合成?？紤]到脂肪酸過多，還會(huì)增加后期的分離難度。因此，本研究選擇富含PUFA的甘油酯與癸酸的摩爾比1/10為酸解反應(yīng)條件（圖6）。

圖4 不同脂肪酶催化對(duì)甘油酯脂肪酸組成的影響

圖5 酸解反應(yīng)中癸酸在甘油酯、甘油酯的sn-2位和sn-1/3位中相對(duì)含量的變化

圖6 底物摩爾比對(duì)酸解過程的影響

2.2.4 酶用量

如圖7所示，隨著脂肪酶用量的增加，產(chǎn)物甘油酯中癸酸相對(duì)含量增加。雖然從反應(yīng)初始速率來看，8%和10%的酶用量對(duì)反應(yīng)速率的影響幾乎相同，但在反應(yīng)12h后，10%酶用量的催化效果略好于8%的催化效果。雖然增加酶用量可以提高反應(yīng)速率，但研究表明，過高的酶用量會(huì)增加?；D(zhuǎn)移，不利于結(jié)構(gòu)酯的生成[18]?？紤]到需要避免酰基轉(zhuǎn)移的發(fā)生及降低生產(chǎn)成本，本研究選擇10%的酶用量為酸解條件。

2.2.5 溫度

酶催化過程中，反應(yīng)溫度升高可以促進(jìn)反應(yīng)向正反應(yīng)方向進(jìn)行，而且高溫可以增加溶劑溶解度和降低黏度，有利于癸酸在甘油酯中含量的提高。研究表明，45℃時(shí)能夠獲得更接近于理想的癸酸的相對(duì)質(zhì)量，但是溫度過高容易造成酶的失活和增加?；D(zhuǎn)移[16]。溫度過高還會(huì)顯著影響各種植物油脂的氧化過程，尤其是含有n-3型多不飽和脂肪酸的油脂。綜上分析，選擇40℃為反應(yīng)溫度。

基于以上結(jié)果確定以正己烷為溶劑，40℃，富含PUFA的甘油酯與癸酸摩爾比為1/10，脂肪酶Ls-20用量10%，氮?dú)獗Ｗo(hù)，180rpm搖床反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間25h為優(yōu)化的反應(yīng)條件（圖8）。

2.2.6 酸解反應(yīng)產(chǎn)物組成分析

對(duì)酸解反應(yīng)的產(chǎn)物組成進(jìn)行分析（見圖9），產(chǎn)物結(jié)構(gòu)酯sn-2位脂肪酸的組成中PUFA含量占78.1%，sn-1/3位脂肪酸的組成中癸酸占51%。合成了sn-1/3位富含癸酸、sn-2位富含PUFA的結(jié)構(gòu)酯。

2.3 產(chǎn)物分離

選用堿中和法、液-液萃取法和低溫溶劑結(jié)晶法分離酸解產(chǎn)物，對(duì)比三種分離方法的分離效果（表1），低溫溶劑結(jié)晶法液相回收的油脂中結(jié)構(gòu)酯含量為89%，游離脂肪酸含量為11%，液相中結(jié)構(gòu)酯回收率為78.7%。綜合考慮結(jié)構(gòu)酯回收率和結(jié)構(gòu)酯純度，選擇低溫溶劑結(jié)晶法分級(jí)酸解產(chǎn)物。

圖7 酶用量對(duì)酸解反應(yīng)的影響

圖8 溫度對(duì)酸解反應(yīng)的影響

圖9 酸解反應(yīng)產(chǎn)物脂肪酸組成分析

表1 三種分離方法效果的比較

3 結(jié) 論

采用低溫溶劑結(jié)晶法直接富集含有PUFA的天然油脂，得到富含PUFA的液體相中的甘油酯，不僅簡(jiǎn)化了富集步驟，而且得到sn-2位上富含PUFA的甘油酯。

以富含PUFA的甘油酯和癸酸為反應(yīng)底物進(jìn)行脂肪酶催化的酸解反應(yīng)，癸酸更容易置換甘油骨架上sn-1/3位上的脂肪酸，有利于合成sn-1/3位富含癸酸和sn-2位富含PUFA的結(jié)構(gòu)酯。

低溫溶劑結(jié)晶法不僅工藝簡(jiǎn)單，還有利于加工中的PUFA穩(wěn)定。綜合考慮產(chǎn)物結(jié)構(gòu)酯回收率和純度，低溫溶劑結(jié)晶法最適合分級(jí)酸解產(chǎn)物。

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Study on enzymatic synthesis process of polyunsaturated fatty acid structured esters

LIU Shuang1，YANG Yang2，NIE Kaili3，WANG Meng2，DENG Li2

1. Kaifeng High School, Kaifeng 475003, China
2. College of Life Science and Technology, Beijing University of Chemical Technology, Beijing 100029, China
3. Amoy-BUCT Industrial of Bio-technovation Institute, Xiamen 361026, China

Using low temperature solvent crystallization to enrich polyunsaturated fatty acids from algae oil and the optimal crystallization conditions were acetone vs algae oil ratio 30:1(v/wt, mL/g), -20℃ and 72h. The content of PUFA in the sn-2 position fatty acid of algae oil was increased from 74.8% to 92.2% under the optimal conditions. Structured lipid with enriched PUFA was synthesized by utilizing the extracted algae oil and capric acid as substrates. The optimized conditions for acidolysis reaction were lipase Ls-20 as biocatalyst, hexane as reaction medium, algae oil vs capric acid ratio 1:10, nitrogen protection, 40℃, 180rpm and 25h. Employing low temperature solvent crystallization to purify the products, recovery rate of structured esters reached 78.7% under the conditions of acetone vs modif ed algae oil ratio 1.6∶1(v/wt, mL/g), -20℃ and 24h.

polyunsaturated fatty acid esters; lipase; acidolysis reaction; low temperature solvent crystallization; structured esters

10.3969/j.issn.1674-0319.2017.01.017

鄧?yán)?，教授。主要研究方向?yàn)楣δ苄杂椭庸?、生物基化學(xué)品等。E-mail：dengli@mail.buct.edu.cn

國(guó)家自然科學(xué)基金（21476017），北京化工大學(xué)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目基金（XK1537）