趙云雷，王紅梅，陳偉，龔海燕，桑曉慧，崔艷利，趙佩

（中國農(nóng)業(yè)科學院棉花研究所/棉花生物學國家重點實驗室，河南安陽455000）

基于優(yōu)異等位基因的棉花抗黃萎病性狀的分子鑒定

趙云雷，王紅梅，陳偉，龔海燕，桑曉慧，崔艷利，趙佩

（中國農(nóng)業(yè)科學院棉花研究所/棉花生物學國家重點實驗室，河南安陽455000）

【目的】發(fā)掘棉花抗黃萎病相關的優(yōu)異等位基因，利用優(yōu)異等位基因對棉花抗黃萎病性狀進行分子檢測，實現(xiàn)對抗病性的快速鑒定和對抗病基因型的直接選擇，有效解決當前抗病性鑒定周期長、抗病性選擇效率低的技術難題?！痉椒ā窟x用125份陸地棉優(yōu)異種質，分別采用田間黃萎病病圃鑒定和溫室接種鑒定對材料進行抗黃萎病鑒定，分析材料的抗病性變異；通過篩選前期獲得的與棉花抗黃萎病表型顯著關聯(lián)的優(yōu)異等位基因位點并計算其效應值，分析不同材料中含有的優(yōu)異等位基因數(shù)目及其優(yōu)異等位基因效應值之和，研究利用優(yōu)異等位基因位點進行棉花抗黃萎病預測的可行性，并比較基于優(yōu)異等位基因位點的抗病性分子鑒定與傳統(tǒng)抗病性表型鑒定的相關性。【結果】陸地棉在黃萎病抗性方面表現(xiàn)出廣泛的變異，125份種質材料在田間病圃鑒定條件下和溫室鑒定條件下的抗黃萎病相對病指變化范圍分別為10.10—76.6和17.01—72.63；基于前期的研究結果共篩選到40個抗黃萎病優(yōu)異等位基因，效應值的變化范圍為-8.20—-0.39，每份材料含有的優(yōu)異等位基因數(shù)目為1—24個，每份材料中的優(yōu)異等位基因效應值之和的變化范圍為-92.37—-0.86；相關性分析結果表明，每份材料中含有的優(yōu)異等位基因效應值之和與材料的抗黃萎病相對病指極顯著正相關，病圃鑒定與溫室鑒定條件下兩者的相關系數(shù)分別為0.616和0.566；材料的優(yōu)異等位基因數(shù)目與材料的抗黃萎病相對病指極顯著負相關，病圃鑒定與溫室鑒定條件下兩者的相關系數(shù)分別為-0.618和-0.535?！窘Y論】棉花種質材料中含有的優(yōu)異等位基因數(shù)目、優(yōu)異等位基因效應值之和與材料的抗黃萎病相對病指間存在顯著相關性，表明抗黃萎病優(yōu)異等位基因的累加具有明顯提高抗病性的作用，材料所含有的優(yōu)異等位基因數(shù)目和優(yōu)異等位基因效應值之和在一定程度上可以反映材料抗病性的強弱，從而實現(xiàn)對抗病性的分子鑒定。

棉花；黃萎病；優(yōu)異等位基因；分子鑒定

0 引言

【研究意義】棉花黃萎病是危害棉花最大的世界性病害之一，被稱為棉花的“癌癥”。實踐證明，防治棉花黃病害最經(jīng)濟、安全、有效的方法就是培育和推廣抗病品種[1]?？共∑贩N的選育已成為目前棉花育種的主要方向。然而，近年來，中國棉花抗黃萎病育種進展緩慢，主要原因是中國現(xiàn)有棉花品種資源的遺傳基因狹窄，缺乏高抗黃萎病的棉花資源，與病原菌小種的快速變異不相適應[2-3]。在棉花抗黃萎病性狀的篩選上，目前，有多種方法對黃萎病抗性進行鑒定[4]，其中，最常用的鑒定方法是在大田環(huán)境條件下利用黃萎病病圃對育種材料進行鑒定。然而，由于大田鑒定條件下存在植株成熟早晚和接種量的差異，以及試驗小區(qū)的干擾，導致目前棉花育種中對抗黃萎病性狀的選擇效率十分有限，表現(xiàn)為不同年份、不同棉區(qū)篩選的抗黃萎病材料的抗病性表現(xiàn)存在較大差異，難以篩選到真正的抗黃萎病材料。因此，如何克服環(huán)境條件對抗病性鑒定的影響，實現(xiàn)對抗病基因型的直接鑒定與選擇，對棉花抗黃萎病品種的培育具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】近年來，隨著分子標記技術的發(fā)展，利用分子標記篩選與目標性狀基因緊密連鎖的分子標記，可以大大提高性狀選擇的準確性，并且不受環(huán)境因子影響。目前，國內外已經(jīng)定位的與棉花不同生長階段的抗黃萎病性狀相關的分子標記或 QTL已超過了100個[5-17]，利用這些分子標記進行輔助選擇，可以有效地提高性狀改良的選育效率，加快育種進程。在棉花抗病基因分子標記輔助選擇育種上，王芙蓉等[18]利用與檢測到的3個抗黃萎病QTL較緊密連鎖的SSR標記對雜交后代輔助鑒定，標記 BNL3590在純合的父、母本基因型后代中，平均病指無顯著差異；而標記NAU751和BNL1395的抗性基因型均能顯著增加后代的黃萎病抗性，2個標記的抗性基因型聚合后，后代抗性水平極顯著提高。孔祥瑞等[19]將與陸地棉黃萎病抗性相關的18個SSR標記用于大田輔助選擇育種，結果表明，18個標記中的 BNL1721、BNL2733和BNL3452標記在有/無標記基因型個體間病指差異顯著，且選擇效應能夠在不同世代間穩(wěn)定遺傳。同時，隨著遺傳學研究的發(fā)展，基于連鎖不平衡（LD）的關聯(lián)分析在植物基因組學研究領域得到了成功的應用[20]，為植物數(shù)量性狀的研究開辟了新的途徑。與QTL作圖相比，關聯(lián)分析有以下優(yōu)點：以自然群體為材料，無需構建作圖群體，因此，可以檢測到更多的等位基因變異，從而挖掘到更多的與性狀關聯(lián)的分子標記，為基于分子標記的性狀篩選奠定基礎?！颈狙芯壳腥朦c】由于目前在棉花中，利用分子標記對棉花抗黃萎病性狀進行選擇大多是對來自抗、感親本雜交的后代分離群體進行選擇，這些分子標記僅僅是作為一種輔助手段，僅能用于區(qū)分抗病基因型和感病基因型，無法用于多個材料間抗病性大小的比較。【擬解決的關鍵問題】本研究在前期對棉花抗黃萎病性狀進行關聯(lián)分析的基礎上，進一步發(fā)掘與棉花抗黃萎病性狀顯著關聯(lián)的優(yōu)異等位基因位點，研究了利用優(yōu)異等位基因位點進行棉花抗黃萎病性狀預測的可行性，并分析了基于優(yōu)異等位基因位點的抗病性分子鑒定與傳統(tǒng)抗病性表型鑒定的相關性。該研究將為棉花抗黃萎病性狀的分子檢測及標記輔助選擇育種提供重要的信息，有助于實現(xiàn)對抗病性的快速鑒定和對抗病基因型的直接選擇，有效解決當前抗病性鑒定周期長、抗病性選擇效率低的技術難題。

1 材料與方法

1.1 棉花種質材料

棉花材料為125份陸地棉優(yōu)異種質，這些材料均來自于筆者早期構建的由158份陸地棉優(yōu)異種質組成的關聯(lián)群體[21]，在前期研究基礎上，通過排除掉基因型數(shù)據(jù)或表型鑒定數(shù)據(jù)存在缺失的部分材料，最終確定了125材料用于本研究，這些材料的名稱、編號及系譜來源見電子附表 1。其中，材料的編號與前期研究所用的編號一致。

1.2 抗病性鑒定

對125份材料的抗病性鑒定分別采用人工黃萎病病圃鑒定和溫室接種鑒定2種方法，其中，人工黃萎病病圃鑒定采用國家棉花品種區(qū)試中抗黃萎病的鑒定方法[22]，溫室鑒定采用營養(yǎng)缽底部菌液蘸根法接種鑒定[23]，對鑒定方法的詳細描述請參考筆者以前的研究[21]?？共⌒澡b定所用的黃萎病病菌均為中等致病力的安陽菌系—VD080，所用的感病對照為冀棉11，采用相對病情指數(shù)（relative disease index，RDI）表示各個材料的抗病性強弱，相對病情指數(shù)的計算方法參考文獻[22]。

1.3 優(yōu)異等位基因的篩選及其效應值計算

在前期研究中，利用均勻分布于棉花全基因組的212對分子標記對158份陸地棉優(yōu)異種質進行基因型分析，同時利用人工黃萎病病圃鑒定和溫室鑒定2種方法對群體進行抗病表型鑒定，在此基礎上對棉花抗黃萎病性狀進行了全基因組關聯(lián)分析研究，獲得了40個與抗黃萎病表型顯著關聯(lián)的SSR標記位點[21]。將這些 SSR標記序列與陸地棉基因組序列（測序版本號：BGI_Gossypium_hirsutum_v1.0，https://www. cottongen.org/species/Gossypium_hirsutum/bgi-AD1_ge nome_v1.0）進行BLAST比對，根據(jù)最好的比對結果（E值最低）確定SSR標記的物理位置，從而將這些SSR標記位點錨定在陸地棉染色體上。進一步分析了每個標記位點的各個等位基因在關聯(lián)群體中的分布情況，根據(jù)ZHANG等[24]的描述，利用公式ai=∑xij/ni－∑Nk/nk計算等位基因的效應值，其中，ɑi是第i個等位基因的效應值，xij是含有第i個等位基因的第j個材料的表型值，ni是含有第 i個等位基因的材料數(shù)目，Nk是所有材料的表型值，nk是所有材料的數(shù)目。將效應值最低的等位基因（黃萎病病指最低）確定為該標記位點的優(yōu)異等位基因。

1.4 基因擴增與檢測

利用優(yōu)異等位基因所對應的引物序列對待測的棉花材料進行PCR擴增，PCR反應體系10 μL，其中，含模板DNA 0.1 μg、10×PCR buffer（含Mg2+）1 μL、dNTP（10 nmol·μL-1）0.2 μL、Tag酶（5 U·μL-1）0.1 μL、上下游引物各1 μM。PCR反應程序為95℃ 3 min；94℃ 45 s，56℃ 45 s，72℃ 1 min，30個循環(huán)；72℃5 min。擴增產(chǎn)物用濃度10%的垂直板非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電泳結束參考張軍等[25]的方法銀染檢測。

1.5 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)基因擴增結果，對待測的棉花材料進行分子標記基因型分析，根據(jù)基因型分析結果統(tǒng)計每個材料含有的優(yōu)異等位基因及其數(shù)目，根據(jù)每個優(yōu)異等位基因的效應值，計算每份材料含有的所有優(yōu)異等位基因的效應值之和；利用每份材料含有的優(yōu)異等位基因的數(shù)目及其效應值的和來評價材料的抗病性強弱，實現(xiàn)不同棉花材料間抗黃萎病性狀強弱的判斷。

2 結果

2.1 棉花優(yōu)異種質的黃萎病抗性

對125份陸地棉材料進行抗病性鑒定表明，陸地棉在黃萎病抗性上表現(xiàn)出廣泛的變異。其中，在田間病圃鑒定條件下，125份種質材料的抗黃萎病相對病指變化范圍為 10.10—76.6，平均為37.69；而在溫室鑒定條件下，125份種質材料的抗黃萎病相對病指變化范圍為17.01—72.63，平均為38.51（圖1）。方差分析表明，不同材料的相對病情指數(shù)間存在極顯著差異（P＜0.001），說明了這125份材料的抗病性變異極為豐富；而基于溫室鑒定條件和基于田間病圃鑒定條件的相對病情指數(shù)（RDI）間不存在顯著差異（P=0.5054），即環(huán)境效應不顯著，說明了溫室鑒定和田間病圃鑒定的一致性。進一步比較發(fā)現(xiàn)，在溫室鑒定條件下表現(xiàn)為耐病的材料（相對病指在20—35）有56份，在這56份材料中，在田間病圃條件下仍然表現(xiàn)為耐病的有36份，表現(xiàn)為感病的材料（相對病指在大于35）的有19份，表現(xiàn)為抗病的材料（相對病指在小于20）僅有1份；另外，在溫室鑒定條件下相對病情指數(shù)最高的 7份材料（相對病情指數(shù)在 57.23—72.63），在田間病圃鑒定條件下仍然表現(xiàn)為高度感?。ㄏ鄬Σ≈冈?4.8—66）；然而，溫室鑒定為抗病的材料僅有1份（相對病指17.1），該材料在病圃條件下表現(xiàn)為耐?。ㄏ鄬Σ≈?9.2）。

2.2 抗黃萎病優(yōu)異等位基因的效應值

前期研究中，在田間病圃鑒定條件下獲得30個與抗黃萎病性狀顯著關聯(lián)的SSR標記位點，在溫室鑒定條件下獲得14個與抗黃萎病性狀顯著關聯(lián)的SSR標記位點，同時獲得在2個鑒定環(huán)境中均存在的抗黃萎病性位點4個。通過統(tǒng)計每個標記位點的各個等位基因在關聯(lián)群體中的分布情況，利用公式 ai=∑xij/ni－∑Nk/nk計算各個等位基因的效應值，將效應值最低的等位基因（黃萎病病指最低）確定為該標記位點的優(yōu)異等位基因。40個標記位點共獲得了40個優(yōu)異等位基因，效應值的變化范圍為-8.20—-0.39。其中，田間病圃鑒定條件下獲得30個優(yōu)異等位基因，效應值的變化范圍為-8.2—-0.86；溫室鑒定條件下獲得14個優(yōu)異等位基因，效應值的變化范圍為-6.0—-0.39；同時獲得在2個鑒定環(huán)境中均存在的優(yōu)異等位基因4個。這些優(yōu)異等位基因的基因組位置信息及其效應值如表 1所示。

圖1 田間病圃鑒定和溫室鑒定條件下供試材料病指變化頻率分布圖Fig. 1 Histogram of relative disease index of tested lines identified in field disease nursery and in greenhouse

2.3 基于優(yōu)異等位基因的抗病性強弱判斷

統(tǒng)計每份材料含有的優(yōu)異等位基因及其數(shù)目, 根據(jù)每個優(yōu)異等位基因的效應值，計算每份材料含有的所有優(yōu)異等位基因的效應值之和，該效應值之和代表了所有優(yōu)異等位基因聚合情況下的基因效應。利用40個優(yōu)異等位基因的分子標記對125份材料進行分析表明，每份材料含有的優(yōu)異等位基因數(shù)目為1—24個，125份材料優(yōu)異等位基因效應值之和的變化范圍為-92.37—-0.86（表2）。其中，編號為191的材料（澳152）含有24個優(yōu)異等位基因，其優(yōu)異等位基因效應值之和為-92.37，在病圃條件下鑒定出的黃萎病相對病指為26.9，為耐病材料；編號為287的材料（新研96-48）僅含有1個優(yōu)異等位基因，其優(yōu)異等位基因效應值之和為-0.86，在病圃條件下鑒定出的黃萎病相對病指為46.5，為感病材料。在病圃鑒定條件下，優(yōu)異等位基因效應值之和小于-32.6（平均值）的材料共56個，其中有47份材料（83.9%）的抗黃萎病病指在35以下，其中包括5份病指20以下的抗病材料(表3)，這5份材料的名稱分別為M-8124-1159（編號169）、中 Arc-185（編號 185）、GK99-1（編號 243）、魯458（編號264）和99633（編號317），所含有的優(yōu)異等位基因數(shù)目分別為16、14、12、11和15個，優(yōu)異等位基因效應值之和分別為-50.27、-42.06、-34.10、-35.63和-52.43，在病圃條件下鑒定出的黃萎病相對病指分別為10.1、19.8、17.3、17.6和14.7 （表2）；優(yōu)異等位基因效應值之和大于-32.6（平均值）的材料共69份，其中有49份材料（71%）的抗黃萎病病指在35以上（表2），例如，高度感病的5份材料大鈴棉（編號67）、常德184（編號5）、邯8944（編號123）、蘇聯(lián)21（編號46）和淮棉4（編號9）中，

優(yōu)異等位基因數(shù)目分別為6、4、7、8和6個，優(yōu)異等位基因效應值之和分別為-12.69、-7.56、-13.97、-20.54和-12.21，在病圃條件下鑒定出的黃萎病相對病指分別為 76.6、73.3、66、60.4和 59.6。這說明利用優(yōu)異等位基因的效應值之和可以有效的將抗（耐）病材料（黃萎病指 35以下）與感病材料（黃萎病指35以上）區(qū)分開，從而實現(xiàn)比較不同材料抗病性強弱的目的。

表1 優(yōu)異等位基因的基因組位置信息及其效應值Table 1 Physical position and effective values of elite alleles

表2 125材料的優(yōu)異等位基因數(shù)目、效應值之和及抗黃萎病相對病指Table 2 The number and sum of effective values of elite alleles, and the relative disease index of Verticillium wilt resistance of 125 lines

續(xù)表2 Continued table 2

續(xù)表2 Continued table 2

為了進一步判斷利用優(yōu)異等位基因進行抗病性強弱分析的可行性，將125份材料的優(yōu)異等位基因數(shù)目、優(yōu)異等位基因效應值之和與材料的黃萎病相對病指進行相關分析，結果表明，優(yōu)異等位基因數(shù)目、效應值之和與材料的黃萎病相對病指間存在顯著的相關性，其中，材料的優(yōu)異等位基因效應值之和與材料的黃萎病病指間存在極顯著的正相關，病圃鑒定與溫室鑒定條件下的相關系數(shù)分別為0.616和0.566；同時，材料的優(yōu)異等位基因數(shù)目與材料的黃萎病相對病指間存在極顯著的負相關，相關系數(shù)分別為-0.618和-0.535（表3），說明材料所含有的優(yōu)異等位基因數(shù)目和優(yōu)異等位基因效應值之和均可以用來判斷材料的抗病性。

表3 優(yōu)異等位基因數(shù)目、效應值之和與黃萎病病指的相關分析Table 3 The correlation coefficients of number of elite alleles and sum of effective values of elite alleles with relative disease index of Verticillium wilt resistance

3 討論

目前，對于棉花黃萎病抗性的鑒定，主要有田間病圃鑒定、營養(yǎng)缽苗期鑒定和黃萎病菌毒素法鑒定[4]。其中，田間病圃鑒定能真實反映鑒定材料抗病性的強弱，是目前最常用的方法，然而該方法存在大田環(huán)境下的地力條件難以控制、需要每年補接菌量及鑒定周期長等限制因素；營養(yǎng)缽苗期鑒定通常在溫室可控條件下進行，具有快速、準確、易操作等優(yōu)點，目前被廣泛使用。然而，由于黃萎病菌致病力的分化，常常導致不同批次、不同年度間同一品種的病情指數(shù)變異較大。近年來，通過設置合適的感病對照品種，利用相對病情指數(shù)來劃分棉花品種的抗病性證明是一種減少環(huán)境變異的有效措施[23,26]。本研究中利用田間病圃鑒定和溫室營養(yǎng)缽苗期鑒定研究了125份棉花優(yōu)異種質的抗病性，田間病圃鑒定反映的是整個生育期的發(fā)病情況，而溫室營養(yǎng)缽苗期鑒定主要反映苗期的發(fā)病情況，我們的結果表明，在對于耐病材料和感病的材料的鑒定方面，溫室鑒定和田間病圃鑒定具有一定程度的一致性；盡管對于抗病材料的鑒定，由于主效抗病基因的表達具有時空性，導致少部分在溫室條件下鑒定為抗病的材料在病圃鑒定條件下表現(xiàn)為耐病，或者反之，然而通過方差分析表明不同鑒定條件下獲得的相對病情指數(shù)間不存在顯著差異，即環(huán)境效應不顯著，進一步說明了使用相對抗性指數(shù)進行抗病性鑒定可消除許多不確定因素對鑒定結果的影響。

目前，國內外學者通過構建雙親間抗病性存在顯著差異的遺傳分離群體，所定位的與棉花不同生長階段的抗黃萎病性狀相關的分子標記或 QTL已超過了100個[5-17]，這些分子標記或QTL為開展標記輔助選擇抗病育種奠定了基礎。本研究的分子標記是通過對大量抗病性存在顯著差異的陸地棉優(yōu)異種質進行關聯(lián)分析獲得的，通過與上述QTL結果進行比較，發(fā)現(xiàn)在本研究所獲得的與抗黃萎病性狀顯著關聯(lián)的SSR標記位點中，有8個SSR標記位點位于上述抗黃萎病QTL區(qū)間內，其中，NAU980-2、NAU5064-2、JESPR0001-1 3個優(yōu)勢等位基因位點（表 1）均位于蔣鋒等[15]定位的棉花抗黃萎病 QTL qV-VD8M-D9-1基因組區(qū)域內（Dt_chr9染色體的29 224 283—55 190 112 bp）。這些結果證明了本研究與前人研究的一致性。祁偉彥等[3]利用和黃萎病抗性緊密連鎖的 SSR 標記對棉花黃萎病抗性進行了輔助篩選，證明了基于人工病圃篩選和分子標記輔助育種相結合是選育棉花抗黃萎病材料可行、高效的育種方法。同上述基于遺傳分離群體的分子標記定位相比，本研究檢測到了更多的優(yōu)異種質材料中存在的抗黃萎病優(yōu)異等位基因變異，有助于實現(xiàn)基于不同優(yōu)勢等位基因的分子標記輔助選擇育種。

棉花抗黃萎病鑒定的一個主要限制因素是病原菌小種的易變性導致品種抗病性的變異。培育具有廣譜抗病性的品種是克服病原菌小種變異的一種有效手段。而廣譜抗病性產(chǎn)生的分子基礎是多個抗黃萎病相關基因的累加。本研究發(fā)現(xiàn)種質材料中含有的優(yōu)異等位基因數(shù)目與材料的黃萎病相對病指間存在極顯著的負相關，說明了抗黃萎病優(yōu)異等位基因的累加具有明顯提高抗病性的作用。

近來，王銘等[27]通過比較多種鑒定棉花抗黃萎病的方法,提出一種使用黃萎病菌毒素進行聯(lián)合鑒定的方法,以替代傳統(tǒng)病圃鑒定法。盡管基于該方法的鑒定結果與田間病圃法鑒定結果的相關系數(shù)為 0.94（P＜0.01），但是該方法仍然沒有有效克服病原菌小種的易變性對鑒定結果的影響，也沒有實現(xiàn)對抗病基因型的直接鑒定。本研究通過將棉花抗黃萎病分子標記進行等位基因分解，將抗病性分子標記轉化為優(yōu)異等位基因，并通過計算優(yōu)異等位基因的效應值實現(xiàn)了分子標記的數(shù)量化，從而將抗病性表型與基因型聯(lián)系起來。從理論上講，優(yōu)異等位基因的效應值在一定程度上反映了基因對表型的貢獻，多個優(yōu)異等位基因的聚合必將對表型產(chǎn)生積極的影響。我們的研究表明，不同材料中含有的優(yōu)異等位基因數(shù)目、優(yōu)異等位基因效應值之和與材料的黃萎病相對病指間存在顯著的相關關系，其中，材料的優(yōu)異等位基因效應值之和與材料的黃萎病相對病指間存在極顯著的正相關，材料的優(yōu)異等位基因數(shù)目與材料的黃萎病相對病指間存在極顯著的負相關，在一定程度上證明了多個優(yōu)異等位基因的聚合有提高材料抗病性的作用，說明材料所含有的優(yōu)異等位基因數(shù)目和優(yōu)異等位基因效應值之和在一定程度上可以反映材料抗病性的強弱，從而實現(xiàn)對抗病性的分子鑒定。

研究表明，陸地棉黃萎病抗性屬數(shù)量性狀遺傳[28]，因此容易受到環(huán)境條件變化的影響。由于田間病圃鑒定反映的是棉花整個生育期的發(fā)病情況，而溫室營養(yǎng)缽苗期鑒定主要反映苗期的發(fā)病情況，再加上抗病相關基因的表達具有時空性，從而導致田間病圃鑒定條件下獲得的優(yōu)異等位基因位點與溫室營養(yǎng)缽苗期接種鑒定條件下獲得的優(yōu)異等位基因位點存在差異。盡管如此，本研究中我們同時獲得了在田間黃萎病病圃鑒定和溫室接種鑒定2個環(huán)境中均顯著關聯(lián)的抗黃萎病優(yōu)異等位基因及其效應值，可以推測，通過采用新的研究方法，發(fā)掘大量的多環(huán)境穩(wěn)定的抗黃萎病優(yōu)勢等位基因，建立基于抗病優(yōu)異等位基因效應值之和為標準的抗黃萎病實時檢測技術，可以實現(xiàn)對抗病性的快速鑒定和對抗病基因型的直接選擇，有效解決當前抗病性鑒定周期長、抗病性選擇效率低的技術難題。

4 結論

棉花種質材料中抗黃萎病優(yōu)異等位基因的累加具有明顯提高抗病性的作用，材料所含有的優(yōu)異等位基因數(shù)目和優(yōu)異等位基因效應值之和在一定程度上可以反映材料抗病性的強弱，從而實現(xiàn)對抗病性的分子鑒定。

[1] 馬存, 簡桂良, 孫文姬. 我國棉花抗黃萎病育種現(xiàn)狀、問題及對策.中國農(nóng)業(yè)科學, 1997, 30(2): 58-64. MA C, JIAN G L, SUN W J. Current status, problem and countermeasure on resistance breeding to verticillium wilt of cotton in China. Scientia Agricultura Sinica, 1997, 30(2): 58-64. (in Chinese)

[2] 徐理, 朱龍付, 張獻龍. 棉花抗黃萎病機制研究進展. 作物學報, 2012, 38(9): 1553-1560. XU L, ZHU L F, ZHANG X L. Research on resistance mechanism of cotton to Verticillium wilt. The Crop Journal, 2012, 38(9): 1553-1560. (in Chinese)

[3] 祁偉彥, 張永軍, 張?zhí)煺? 陳捷胤, 戴小楓. 基于人工病圃篩選和分子標記輔助的棉花抗黃萎病育種方法研究與應用. 分子植物育種, 2012, 10(5): 607-612. QI W Y, ZHANG Y J, ZHANG T Z, CHEN J Y, DAI X F. Studies on the methods for cotton resistant breeding to Verticillium wilt by the screen of disease nursery and molecular marker-assisted selection. Molecular Plant Breeding, 2012, 10(5): 607-612. (in Chinese)

[4] 房慧勇, 馬峙英. 棉花抗黃萎病機制及抗病性鑒定研究進展. 河北農(nóng)業(yè)科學, 2002, 6(2): 1-7. FANG H Y, MA Z Y. Research advances on the resistance mechanism and resistance identification to Verticillium wilt of cotton. Journal of Hebei Agricultural Sciences, 2002, 6(2): 1-7. (in Chinese)

[5] 高玉千, 聶以春, 張獻龍. 棉花抗黃萎病基因的QTL定位. 棉花學報, 2003, 15(2): 73-78.GAO Y Q, NIE Y C, ZHANG X L. QTL mapping of genes resistant to Verticillium wilt in cotton. Cotton Science, 2003, 15(2): 73-78. (in Chinese)

[6] 杜威世, 杜雄明, 馬峙英. 棉花黃萎病抗性基因SSR標記研究. 西北農(nóng)林科技大學學報(自然科學版), 2004, 32(3): 20-24. DU W S, DU X M, MA Z Y. Studies on SSR markers of resistance gene of Verticillium wilt in cotton. Journal of Northwest Sci-Tech University of Agriculture and Forestry (Natural Science Edition), 2004, 32(3): 20-24. (in Chinese)

[7] 王紅梅, 張獻龍, 賀道華, 林忠旭, 聶以春, 李運海, 陳偉. 陸地棉對黃萎病抗性的分子標記研究. 植物病理學報, 2005, 35(4): 333-339. WANG H M, ZHANG X L, HE D H, LIN Z X, NIE Y C, LI Y H, CHEN W. Detection of DNA markers associated with resistance to Verticillium dahliae in cotton. Acta Phytopathologica Sinica, 2005, 35(4): 333-339. (in Chinese)

[8] BOLEK Y, KAMAL M E, ALAN E P, ALOIS A B, CLINT W M, PEGGY M T, REDDY O U K. Mapping of Verticillium wilt resistance genes in cotton. Plant Science, 2005, 168: 1581-1590.

[9] 甄瑞, 王省芬, 馬峙英, 張桂寅, 王雪. 海島棉抗黃萎病基因 SSR標記研究. 棉花學報, 2006, 18(5): 269-272. ZHEN R, WANG X F, MA Z Y, ZHANG G Y, WANG X. A SSR marker linked with the gene of Verticillium wilt resistance in Gossypium barbadense. Cotton Science, 2006, 18(5): 269-272. (in Chinese)

[10] 王省芬, 甄瑞, 馬峙英, 張桂寅, 張艷, 王雪. 海島棉品種抗黃萎病基因 SSR標記的驗證及克隆. 植物遺傳資源學報, 2007, 8(2): 149-152. WANG X F, ZHEN R, MA Z Y, ZHANG G Y, ZHANG Y, WANG X. Verification and cloning of ssr marker linked with the gene of Verticillium wilt resistance in Gossypium barbadense L.. Journal of Plant Genetic Resources, 2007, 8(2): 149-152. (in Chinese)

[11] WANG H M, LIN Z X, ZHANG X L, CHEN W, GUO X P, NIE Y C, LI Y H. Mapping and quantitative trait loci analysis of Verticillium wilt resistance genes in cotton. Journal of Integrative Plant Biology, 2008, 50(2): 174-182.

[12] YANG C, GUO W Z, LI G Y, GAO F, LIN S S, ZHANG T. QTLs mapping for Verticillium wilt resistance at seedling and maturity stages in Gossypium barbadense L.. Plant Science, 2008, 174: 290-298.

[13] 葛海燕, 汪業(yè)春, 郭旺珍, 張?zhí)煺? 陸地棉抗黃萎病性狀的遺傳及分子標記研究. 棉花學報, 2008, 20(1): 19-22. GE H Y, WANG Y C, GUO W Z, ZHANG T Z. Inheritance and molecular tagging of resistance against Verticillium wilt in upland cotton. Cotton Science, 2008, 20(1): 19-22. (in Chinese)

[14] 昝偉, 高峰, 劉海峰, 李國英, 宋武, 羅城, 李暉. 海島棉抗黃萎病性狀分子標記的研究及QTL的定位. 新疆農(nóng)業(yè)科學, 2008, 45(5): 805-808. ZAN W, GAO F, LIU H F, LI G Y, SONG W, LUO C, LI H. Molecular mark of resistance to Verticillium wilt of G. barbadence and mapping of QTL. Xinjiang Agricultural Sciences, 2008, 45(5): 805-808. (in Chinese)

[15] 蔣鋒, 趙君, 周雷, 郭旺珍, 張?zhí)煺? 陸地棉抗黃萎病基因的分子標記定位. 中國科學 C輯: 生命科學, 2009, 39(9): 849-861. JIANG F, ZHAO J, ZHOU L, GUO W Z, ZHANG T Z. Molecular mapping of Verticillium wilt resistance in upland cotton. Science in China Series C: Life Sciences, 2009, 39(9): 849-861. (in Chinese)

[16] FANG H, ZHOU H P, SANOGO S, FLYNN R, PERCY R G, HUGHS S E, ULLOA M, JONES D C, ZHANG J F. Quantitative trait locus mapping for Verticillium wilt resistance in a backcross inbred line population of cotton (Gossypium hirsutum ×Gossypium barbadense) based on RGA-AFLP analysis. Euphytica, 2013, 194: 79-91.

[17] NING Z Y, ZHAO R, CHEN H, AI N J, ZHANG X, ZHAO J, MEI H X, WANG P, GUO W Z, ZHANG T Z. Molecular tagging of a major quantitative trait locus for broad-spectrum resistance to Verticillium wilt in upland cotton cultivar prema. Crop Science, 2013, 53: 2304-2312.

[18] 王芙蓉, 劉任重, 王留明, 張傳云, 劉國棟, 劉勤紅, 馬小波, 張軍. 陸地棉品種抗黃萎病性狀的分子標記及其輔助選擇效果, 棉花學報, 2007, 19(6): 424-431. WANG F R, LIU R Z, WANG L M, ZHANG C Y, LIU G D, LIU Q H, MA X B, ZHANG J. Molecular markers of Verticillium wilt resistance in upland cotton (Gossypium hirsutum L.) cultivar and their effects on assisted phenotypic selection. Cotton Science, 2007, 19(6): 424-431. (in Chinese)

[19] 孔祥瑞, 王紅梅, 陳偉, 趙云雷, 李運海, 龔海燕, 桑曉慧. 陸地棉黃萎病抗性的分子標記輔助選擇效果. 棉花學報, 2010, 22(6): 527-532. KONG X R, WANG H M, CHEN W, ZHAO Y L, LI Y H, GONG H Y, SANG X H. Effect of molecular marker assisted selection to Verticillium wilt resistance in upland cotton breeding. Cotton Science, 2010, 22(6): 527-532. (in Chinese)

[20] FLINT-GARCIA S A, THUILLET A C,YU J M, PRESSOIR G, ROMERO S M, MITCHELL S E, DOEBLEY J, KRESOVICH S, GOODMAN M M, BUCKLER E S. Maize association population: A high-resolution platform for quantitative trait locus dissection. ThePlant Journal, 2005, 44: 1054-1064.

[21] ZHAO Y L, WANG H M, CHEN W, LI Y H. Genetic structure, linkage disequilibrium and association mapping of Verticillium wilt resistance in elite cotton (Gossypium hirsutum L.) germplasm population. PLoS ONE, 2014, 9(1): e86308.

[22] 朱荷琴, 吳征彬, 鄒奎, 馮自力. 國家棉花品種區(qū)域試驗抗枯黃萎病鑒定方法. 中國棉花, 2007, 34(11): 9-24. ZHU H Q, WU Z B, ZOU K, FENG Z L. Identification method for Fusarium and Verticillium wilt in national cotton variety regional test. China Cotton, 2007, 34 (11): 9-24. (in Chinese)

[23] 朱荷琴, 馮自力, 李志芳, 趙麗紅, 師勇強. 蛭石沙土無底紙缽定量蘸菌液法鑒定棉花品種(系)的抗黃萎病性. 中國棉花, 2010, 12: 15-17. ZHU H Q, FENG Z L, LI Z F, ZHAO L H, SHI Y Q. Identification method for Verticillium wilt resistance in cotton cultivars by using paper pots containing vermiculite and sand inoculated with spore suspension. China Cotton, 2010, 12: 15-17. (in Chinese)

[24] ZHANG T Z, QIAN N,ZHU X F, CHEN H, WANG S, MEI H X, ZHANG Y M. Variations and transmission of QTL alleles for yield and fiber qualities in upland cotton cultivars developed in China. PLoS ONE, 2013, 8(2): e57220.

[25] 張軍, 武耀廷, 郭旺真. 棉花微衛(wèi)星標記的 PAGE/銀染快速檢測.棉花學報, 2000, 12(5): 267-269. ZHANG J, WU Y T, GUO W Z. Fast screening of microsatellite markers in cotton with PAGE/silver staining. Cotton Science, 2000, 12(5): 267-269. (in Chinese)

[26] 李社增, 馬平, HUANG H C, 陳新華. 相對病情指數(shù)劃分棉花品種杭病性的統(tǒng)計學基礎. 棉花學報, 2003, 15(6): 344-347. LI S Z, MA P, HUANG H C, CHEN X H. Statistical basis for determining Verticillium wilt resistance of cotton cultivar/line according to relative disease index. Cotton Science, 2003, 15(6): 344-347. (in Chinese)

[27] 王銘, 臧麗麗, 范凱, 李鳳, 袁淑娜, 申浩, 王學德. 黃萎病菌毒素聯(lián)合法鑒定棉花對黃萎病的抗性. 中國農(nóng)業(yè)科學, 2015, 48(9): 1678-1688. WANG M, ZANG L L, FAN K, LI F, YUAN S N, SHEN H, WANG X D. A combined identification method for the Verticillium wilt resistance in cotton by using pathogen toxin. Scientia Agricultura Sinica, 2015, 48(9): 1678-1688. (in Chinese)

[28] 王紅梅, 張獻龍, 李運海, 聶以春. 陸地棉黃萎病抗性遺傳分析.棉花學報, 2004, 16(2): 84-88. WANG H M, ZHANG X L, LI Y H, NIE Y C. Analysis on the Inheritance of Verticillium dahliae Resistance in G. hirsutum. Cotton Science, 2004, 16(2): 84-88. (in Chinese)

（責任編輯 李莉）

Elite Alleles-Based Molecular Detection for Verticillium Wilt Resistance in Cotton

ZHAO YunLei, WANG HongMei, CHEN Wei, GONG HaiYan, SANG XiaoHui, CUI YanLi, ZHAO Pei
(Cotton Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences/State Key Laboratory of Cotton Biology, Anyang 455000, Henan)

【Objective】Detecting Verticillium wilt resistance in cotton by using molecular markers of elite alleles of Verticillium wilt resistance contributes to fast identification of disease resistance and direct selection of disease resistance genotypes, thus resolving the problems of time-consuming and poor efficiency in selection of disease resistance. 【Method】In this study, Verticillium wilt resistance of 125 elite cotton lines was estimated by using a disease nursery and greenhouse screening method, respectively. Elite alleles related to Verticillium wilt resistance were obtained from the earlier publication of the authors and the phenotypic effect of each elite allele was calculated. The number and the sum of effective value of elite alleles in each cotton line were used to study the possibility of elite alleles-based molecular detection for Verticillium wilt resistance. 【Result】Results of the study showed that widespread variation of Verticillium wilt resistance was observed in upland cotton. The range of relative disease index of Verticillium wilt resistance identified in field disease nursery and in greenhouse was 10.10-76.6 and 17.01-72.63, respectively. A total of 40 elitealleles were obtained and the effective values of each allele was in the range of -8.20--0.39. The number of elite alleles in each lines was in the range of 1-24. The sum of effective values of elite alleles in each line were in the range of -92.37--0.86. Correlation analysis showed that the sum of effective values of elite alleles had a significant positive correlation with relative disease index of Verticillium wilt resistance, and the correlation coefficient in field disease nursery and in greenhouse was 0.616 and 0.566, the number of elite alleles in each line had a significant negative correlation with relative disease index of Verticillium wilt resistance, and the correlation coefficient in field disease nursery and in greenhouse was -0.618 and -0.535, respectively. 【Conclusion】It was concluded that there is a significant correlation between the number of elite alleles, the sum of effective value of elite alleles and relative disease index of Verticillium wilt resistance, implying the accumulation of different elite alleles in one line can improve the disease resistance. The sum of effective value of elite alleles and the number of elite alleles in a cotton line can reflect the disease resistance, thus realizing the molecular identification of disease resistance in cotton.

cotton; Verticillium wilt; elite allele; molecular identification

2016-07-01；接受日期：2016-09-29

中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務專項（1610162015A02）、國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系（CARS-18-01）

聯(lián)系方式：趙云雷，E-mail：yunleizhao2002@126.com。通信作者王紅梅，E-mail：aywhm@163.com