王慧，張海娟，李志東

（臨沂大學(xué)藥學(xué)院，山東臨沂 276000）

忍冬藤提取物對(duì)兔離體腸平滑肌的舒張作用及其機(jī)制

王慧，張海娟，李志東

（臨沂大學(xué)藥學(xué)院，山東臨沂 276000）

【目的】胃腸平滑肌過(guò)度收縮可引起腹痛腹瀉等臨床常見(jiàn)的疾病。目前，臨床上對(duì)治療胃腸平滑肌過(guò)度收縮的藥物主要以西藥為主，如鈣離子通道阻斷藥硝苯地平和抗膽堿藥阿托品等，硝苯地平長(zhǎng)期使用可引起負(fù)性肌力和負(fù)性傳導(dǎo)的現(xiàn)象，而阿托品由于其不良反應(yīng)較大，在臨床應(yīng)用中受到一定的限制。因此，開(kāi)發(fā)具有有效防治胃腸平滑肌痙攣、低毒、低殘留的天然中草藥意義重大。試驗(yàn)以兔離體小腸平滑肌為研究對(duì)象，利用豐富的忍冬藤資源，研究忍冬藤提取物對(duì)兔離體小腸平滑肌收縮的影響，并探討其作用機(jī)制?！痉椒ā坎捎猛秒x體小腸平滑肌試驗(yàn)，應(yīng)用BL-420E生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，觀察忍冬藤提取物對(duì)正常狀態(tài)下兔離體小腸平滑肌自發(fā)性收縮的影響；進(jìn)而使用工具藥乙酰膽堿、組胺和氯化鋇致兔小腸痙攣性收縮后，觀察忍冬藤提取物對(duì)其痙攣性收縮的影響；為研究忍冬藤提取物抑制兔離體小腸平滑肌收縮的作用機(jī)制，應(yīng)用 IP3受體阻斷劑肝素(HP)、肌漿網(wǎng) ryanodine受體阻斷劑釕紅(RR)和一氧化氮合酶抑制劑左旋硝基精氨酸甲酯(L-NAME)，探明忍冬藤提取物對(duì)兔離體小腸平滑肌作用的機(jī)制?！窘Y(jié)果】忍冬藤提取物可濃度依賴性抑制兔離體小腸平滑肌自發(fā)性收縮，藥物濃度在7.5 g·L-1時(shí)可顯著抑制兔離體小腸平滑肌收縮的頻率(P＜0.05)，藥物濃度在5g·L-1時(shí)可極顯著抑制兔離體小腸平滑肌收縮的振幅(P＜0.05)；工具藥乙酰膽堿、組胺和氯化鋇可顯著誘導(dǎo)兔小腸平滑肌收縮的振幅，忍冬藤提取物可顯著抑制由乙酰膽堿、組胺和氯化鋇誘導(dǎo)的兔離體小腸平滑肌收縮的頻率(P＜0.05)，可極顯著抑制兔離體小腸平滑肌收縮的振幅(P＜0.01)。IP3受體阻斷劑肝素能增強(qiáng)忍冬藤提取物舒張兔離體小腸平滑肌收縮的作用(P＜0.01)，而肌漿網(wǎng)ryanodine受體阻斷劑釕紅對(duì)忍冬藤提取物舒張兔小腸平滑肌的作用無(wú)明顯影響(P＞0.05)。左旋硝基精氨酸甲酯能夠部分阻斷忍冬藤提取物舒張兔離體小腸平滑肌收縮的作用(P＜0.01)?！窘Y(jié)論】忍冬藤提取物可顯著抑制兔離體小腸平滑肌收縮的頻率和振幅，其機(jī)制可能與增加一氧化氮濃度，抑制IP3受體介導(dǎo)的內(nèi)鈣釋放有關(guān)，但對(duì)肌漿網(wǎng)ryanodine受體途徑引起的內(nèi)鈣釋放無(wú)關(guān)。

忍冬藤提取物；兔；小腸平滑??；鈣離子；一氧化氮

0 引言

【研究意義】仔豬腹瀉因具有發(fā)病率高、死亡快的特點(diǎn)，在養(yǎng)豬業(yè)危害中居首位[1]。當(dāng)由胃腸平滑肌運(yùn)動(dòng)異常引起的仔豬功能性腹瀉時(shí)，應(yīng)使用調(diào)節(jié)腸管運(yùn)動(dòng)的藥物，如阿托品、胃復(fù)安等，隨著該類藥物在臨床上出現(xiàn)的諸多副作用[2-5]，天然中草藥在胃腸道疾病的應(yīng)用中日漸顯著。在獸醫(yī)臨床中忍冬藤常被用于急性細(xì)菌性痢疾和胃腸炎等病癥[6-8]，但其確切療效及作用機(jī)制尚不明確。因此，進(jìn)行忍冬藤對(duì)兔腸平滑肌運(yùn)動(dòng)的作用及機(jī)制研究，為該藥在獸醫(yī)臨床中的應(yīng)用提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】一般在醫(yī)藥上將金銀花的干燥莖枝稱為忍冬藤[9]，和金銀花一樣具有抗菌消炎、清熱解毒和止腸固痢的作用?！侗静菥V目》記載：“忍冬，莖葉及花，功用皆同”。 現(xiàn)代研究證明，忍冬藤與金銀花具有相近的化學(xué)成分和藥理活性[10]。2003 年非典爆發(fā)流行時(shí)金銀花每千克高達(dá)百元以上，而忍冬藤一直沒(méi)有被重視利用[11]。宋士軍等報(bào)道，金銀花提取液對(duì)兔小腸平滑肌運(yùn)動(dòng)具有顯著抑制作用，其作用機(jī)制可能是激動(dòng)β受體，抑制肌漿網(wǎng)釋放鈣離子和細(xì)胞外鈣離子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)有關(guān)[12]。作為和金銀花藥性相似、價(jià)格低廉、來(lái)源豐富的忍冬藤對(duì)動(dòng)物胃腸道的調(diào)節(jié)作用及機(jī)理研究鮮見(jiàn)報(bào)道，使其在防治畜禽消化道疾病的應(yīng)用中受到一定限制?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】忍冬藤可以單方或復(fù)方出現(xiàn)用于治療消化道疾病，但其作用機(jī)制不明確。課題組前期研究表明，將忍冬藤粉碎后添加到仔豬飼料中，可有效防治仔豬腹瀉的發(fā)生，其作用機(jī)制可能與抑制動(dòng)物胃腸道運(yùn)動(dòng)有關(guān)。鑒于此，本試驗(yàn)采用BL-420E生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，研究忍冬藤提取物對(duì)兔小腸平滑肌運(yùn)動(dòng)的影響，并使用不同工具藥探明忍冬藤對(duì)動(dòng)物胃腸平滑肌調(diào)控的機(jī)制?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】開(kāi)發(fā)忍冬藤的藥用資源，探明忍冬藤對(duì)動(dòng)物胃腸道運(yùn)動(dòng)的調(diào)控機(jī)制，為該藥在防治動(dòng)物消化道疾病的應(yīng)用中提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間及地點(diǎn)

本試驗(yàn)于2013年4月至2013年10月在臨沂大學(xué)藥學(xué)院山東省魯南中藥材資源開(kāi)發(fā)工程技術(shù)研究中心藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)室完成。

1.2 材料

1.2.1 藥品及來(lái)源 忍冬藤提取物不自制，原料由山東省平邑縣九間棚農(nóng)業(yè)科技園忍冬藤種植基地提供；氯化鋇（批號(hào)：20080410，上海山浦化工有限公司）；乙酰膽堿（批號(hào)：15917，Acros ）；組胺（批號(hào)：H7125，Sigma ）；肝素（heparin, HP 批號(hào)：H0200000，Sigma）；釕紅（ruthenium red, RR 批號(hào)：SC-202328，Santan cruz）；左旋硝基精氨酸甲酯（nitro-L-arginine methylester , L-NAME 批號(hào)：N5751，Sigma）。

1.2.2 儀器及試劑 BL-420E生物信號(hào)采集系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司）；JH-2型張力傳感器（中國(guó)北京航天醫(yī)學(xué)工程研究所產(chǎn)品）；水浴恒溫振蕩器（江蘇金壇市醫(yī)療儀器廠）；臺(tái)氏液（g·L-1）：NaCl 8. 0, CaCl20.2, KCl 0.2, MgCl20.1, NaHCO31.0, KH2PO40.05, 葡萄糖1.0。

1.2.3 試驗(yàn)動(dòng)物 選擇同批次新西蘭大白兔30只，雌雄各半，體重在（2.5±0.4）kg，購(gòu)自山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 忍冬藤提取物制備 準(zhǔn)確稱取忍冬藤50 g，加入15倍體積的15%乙醇，浸泡30 min。之后加熱至沸騰，煎煮3次，每次煎煮1 h，紗布過(guò)濾合并煎煮液。將煎煮液減壓濃縮至20—30 mL，稱量體積，加入乙醇，使含醇量達(dá)60 %。靜置24 h后，過(guò)濾，濾液繼續(xù)減壓濃縮至無(wú)醇味，收集濾液后冷凍干燥備用。

1.3.2 兔離體小腸平滑肌標(biāo)本的制備 取健康家兔，禁食24 h 后，用木槌猛擊兔頭枕部致死。迅速沿腹中線打開(kāi)腹腔，每只兔取十二指腸同一腸段放入盛有混合氣體的飽和臺(tái)式液中，洗凈腸內(nèi)容物。將其剪成2—3 cm 的腸段作為實(shí)驗(yàn)標(biāo)本。

1.3.3 腸管收縮活動(dòng)的記錄 打開(kāi) BL-420E生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，調(diào)零，定標(biāo)，在一通道輸入接口處安裝張力換能器。調(diào)節(jié)恒溫平滑肌槽，使水溫保持在（37±0.5）℃，將臺(tái)式液加入預(yù)管內(nèi)，藥物管加入16 mL臺(tái)氏液。將標(biāo)本一端固定于L型通氣鉤上，另一端連接張力換能器，持續(xù)通入混合氣體（96% O2，4% CO2），每秒1—2個(gè)氣泡，溫度在37 ℃，標(biāo)準(zhǔn)負(fù)荷1 g，平衡1 h，待腸管運(yùn)動(dòng)穩(wěn)定后，開(kāi)始進(jìn)行試驗(yàn)。

1.3.4 忍冬藤提取物對(duì)小腸平滑肌自主性收縮的影響待腸管收縮穩(wěn)定后, 累計(jì)加入忍冬藤提取物，使終濃度分別為2.5、5、7.5、10、12.5 g·L-1，加藥間隔時(shí)間為 5 min，對(duì)照組加入等量生理鹽水，觀察忍冬藤提取物對(duì)家兔小腸自發(fā)性收縮的影響。記錄忍冬藤提取物各濃度對(duì)小腸自發(fā)性收縮的頻率和振幅，并計(jì)算抑制率。

頻率抑制率（%）=（給藥前平均頻率- 給藥后平均頻率）/給藥前平均頻率×100%

振幅抑制率（%）=（給藥前平均振幅- 給藥后平均振幅）/給藥前平均振幅×100%

1.3.5 忍冬藤提取物對(duì)激動(dòng)劑（乙酰膽堿、組胺、氯化鋇）所致腸痙攣性收縮的影響 隨機(jī)分為 4組（n=5），乙酰膽堿+忍冬藤組、組胺+忍冬藤組、氯化鋇+忍冬藤組、生理鹽水+忍冬藤組。待腸管收縮穩(wěn)定后, 各組分別給予乙酰膽堿（1 μmol·L-1）、組胺（5 mg·L-1）、氯化鋇（10 mg·L-1），對(duì)照組加入等量生理鹽水，描記腸肌收縮的運(yùn)動(dòng)曲線，再加入忍冬藤提取物10 g·L-1，記錄加入忍冬藤后收縮活動(dòng)的頻率和振幅，計(jì)算抑制率。

1.3.6 HP、RR 和L-NAME預(yù)處理腸肌后對(duì)忍冬藤提取物舒張腸肌運(yùn)動(dòng)的影響 隨機(jī)分為4組（n=6），HP +忍冬藤組、RR +忍冬藤組、L-NAME+忍冬藤組、生理鹽水+忍冬藤組。待腸管收縮穩(wěn)定后, 各組分別給予HP（50 mg·L-1）、RR（10 μmol·L-1）、L-NAME（100 μmol·L-1），孵育15 min后，加入忍冬藤提取物10 g·L-1，對(duì)照組加入等量生理鹽水，記錄加入忍冬藤前后收縮活動(dòng)的頻率和振幅，計(jì)算抑制率。

2 結(jié)果

2.1 忍冬藤提取物對(duì)兔離體腸平滑肌自發(fā)性收縮的影響

2.5 —12.5 g·L-1忍冬藤能劑量依賴性抑制兔小腸平滑肌收縮，忍冬藤在較低濃度時(shí)對(duì)腸肌收縮的頻率和振幅均無(wú)影響，隨著藥物濃度的增加，對(duì)腸肌收縮的抑制作用增強(qiáng)，與對(duì)照組相比，藥物濃度在7.5 g·L-1以上時(shí)對(duì)腸肌收縮的頻率抑制率具有顯著差異（P＜0.05），藥物濃度在5 g·L-1以上時(shí)對(duì)振幅抑制率具有顯著差異（P＜0.05，圖1）。

2.2 忍冬藤對(duì)乙酰膽堿、組胺、BaCl2誘導(dǎo)腸肌收縮后的影響

2.2.1 忍冬藤對(duì)乙酰膽堿誘導(dǎo)腸平滑肌收縮的抑制作用 1 μmol·L-1乙酰膽堿可明顯增強(qiáng)腸平滑肌運(yùn)動(dòng)波形，使腸肌收縮振幅增加（27.5 ± 2.5）%，與對(duì)照組相比，具有極顯著差異（P＜0.01），但對(duì)收縮頻率無(wú)影響。加入 10 g·L-1的忍冬藤后，可明顯降低乙酰膽堿誘導(dǎo)的腸肌運(yùn)動(dòng)波形，并對(duì)收縮頻率的抑制具有顯著差異（P＜0.05）；對(duì)收縮振幅的抑制具有極顯著差異（P＜0.01, 圖2）。

2.2.2 忍冬藤對(duì)組胺誘導(dǎo)腸平滑肌收縮的抑制作用 5 mg·L-1組胺可明顯增強(qiáng)腸平滑肌運(yùn)動(dòng)波形，使收縮振幅增加（11 ± 1）%，與對(duì)照組相比，具有顯著差異（P＜0.05），對(duì)收縮頻率無(wú)影響。10 g·L-1忍冬藤對(duì)組胺誘導(dǎo)的腸平滑肌運(yùn)動(dòng)的波形具有抑制作用，對(duì)收縮頻率具有顯著抑制作用（P＜0.05），對(duì)收縮振幅具有極顯著抑制作用（P＜0.01，圖3）。

圖1 忍冬藤對(duì)兔小腸平滑肌運(yùn)動(dòng)的影響Fig.1 Effect of the C. lonicerae on intestinal smooth muscle motility

圖2 忍冬藤對(duì)乙酰膽堿誘導(dǎo)的腸平滑肌收縮的影響Fig. 2 Effect of C. lonicerae on intestinal smooth muscle contractions induced by acetylcholine

2.2.3 忍冬藤對(duì)BaCl2誘導(dǎo)腸平滑肌收縮的抑制作用10 mg·L-1BaCl2可明顯增強(qiáng)腸平滑肌運(yùn)動(dòng)波形，使腸平滑肌收縮頻率增加 8%，振幅增加14%，與對(duì)照組相比，BaCl2對(duì)收縮振幅的增強(qiáng)具有極顯著差異（P＜0.01）。10 g·L-1忍冬藤可顯著抑制由BaCl2誘導(dǎo)的腸肌收縮的頻率和振幅（圖4）。

圖3 忍冬藤對(duì)組胺誘導(dǎo)的腸平滑肌收縮的影響Fig.3 Effect of C. lonicerae on intestinal smooth muscle contractions induced by histamine

圖4 忍冬藤對(duì)氯化鋇誘導(dǎo)的腸平滑肌收縮的影響Fig.4 Effect of C. lonicerae on intestinal smooth muscle contractions induced by BaCl2

2.3 HP、RR、L-NAME預(yù)處理對(duì)忍冬藤舒張腸平滑肌的影響

10 g·L-1忍冬藤可顯著抑制腸平滑肌收縮的頻率和振幅，50 mg·L-1的 IP3受體阻斷劑肝素（heparin, HP）預(yù)孵育后，可增強(qiáng)忍冬藤舒張腸平滑肌的作用，對(duì)腸平滑肌收縮頻率由（76±3）%減為44.5%（P＜0.01，圖5）。

與忍冬藤比較，肌漿網(wǎng) ryanodine受體阻斷劑RR（10 μmol·L-1）預(yù)孵育后對(duì)忍冬藤舒張腸平滑肌的作用無(wú)明顯影響（P＞0.05，圖6）。一氧化氮合酶抑制劑L-NAME（100 μmol·L-1）預(yù)孵育后，可極顯著增加忍冬藤舒張腸平滑肌運(yùn)動(dòng)的振幅（ P＜0.01，圖7）。

3 討論

胃腸平滑肌痙攣可引起腹痛、腹瀉等臨床常見(jiàn)的疾病。研究表明，胃腸平滑肌上主要存在某些受體（M膽堿能受體、組胺受體和 5-HT受體等）和離子通道（鈣離子通道、鉀離子通道和鈉離子通道）[13-15]。神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿主要通過(guò)突觸后膜的兩大受體系統(tǒng)發(fā)揮其生理作用，即煙堿型受體（N受體）和毒蕈堿型受體（M受體），其中廣泛分布于胃腸平滑肌，并對(duì)其具有調(diào)控作用的為M膽堿能受體。乙酰膽堿激動(dòng)M受體，可使細(xì)胞內(nèi)第二信使三磷酸肌醇（IP3）和二酰甘油（DG）濃度上升，進(jìn)而引起細(xì)胞內(nèi)鈣離子釋放，濃度增加而產(chǎn)生收縮反應(yīng)[16]。組胺可作用于分布在胃腸平滑肌上的H1受體，以打開(kāi)細(xì)胞膜上允許Na+，K+，Ca2+通透的離子通道，導(dǎo)致細(xì)胞膜去極化，進(jìn)而使電壓依賴性鈣通道開(kāi)放，胞內(nèi)游離鈣離子濃度增高，從而引起胃腸平滑肌收縮[17]。氯化鋇可通過(guò)直接刺激胃腸粘膜，引起胃腸平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子釋放誘導(dǎo)收縮[18]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，忍冬藤提取物能濃度依賴性抑制腸平滑肌的自發(fā)性收縮，并顯著抑制由乙酰膽堿、組胺和氯化鋇誘導(dǎo)的腸平滑肌痙攣性收縮。

圖5 肝素對(duì)忍冬藤抑制腸平滑肌收縮的影響Fig.5 Effect of HP on intestinal smooth muscle contractions inhibited by C. lonicerae

圖6 釕紅對(duì)忍冬藤抑制腸平滑肌收縮的影響Fig. 6 Effect of RR on intestinal smooth muscle contractions inhibited by C. lonicerae

圖7 L-NAME對(duì)忍冬藤抑制腸平滑肌收縮的影響Fig. 7 Effect of L-NAME on intestinal smooth muscle contractions inhibited by C. lonicerae

因乙酰膽堿、組胺和氯化鋇引起腸平滑肌痙攣性收縮都與細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度增多有關(guān)，故推測(cè)忍冬藤抑制腸平滑肌痙攣性收縮與降低細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度有關(guān)。腸平滑肌收縮所需的鈣離子主要來(lái)源于細(xì)胞外通過(guò)電壓依賴性鈣離子通道進(jìn)入的鈣離子和細(xì)胞肌漿網(wǎng)內(nèi)三磷酸肌醇受體和雷諾定受體釋放的鈣離子，當(dāng)胞內(nèi) Ca2+濃度達(dá)到一定水平（1—50 μmol·L-1）時(shí), 與肌鈣蛋白或肌調(diào)蛋白結(jié)合, 觸發(fā)平滑肌收縮[19-20]。為此本試驗(yàn)進(jìn)一步進(jìn)行了忍冬藤提取液對(duì)內(nèi)鈣釋放的影響。

細(xì)胞內(nèi)釋放的鈣離子主要來(lái)自于肌漿網(wǎng)，肌漿網(wǎng)內(nèi)釋放的鈣離子主要通過(guò)三磷酸肌醇受體（IP3）和雷諾定受體（ryanodine）來(lái)完成。當(dāng)這些受體被激活后，可引起肌漿網(wǎng)內(nèi)鈣離子釋放，從而引起細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度增加，誘導(dǎo)平滑肌收縮[21-22]。忍冬藤可能通過(guò)三磷酸肌醇受體或雷諾定受體途徑來(lái)完成其對(duì)腸平滑肌運(yùn)動(dòng)的抑制作用。為此，本試驗(yàn)進(jìn)行了 IP3受體阻斷劑肝素（HP）和雷諾定受體阻斷劑釕紅（RR）預(yù)處理下，忍冬藤對(duì)腸平滑肌的作用。結(jié)果顯示，預(yù)先應(yīng)用IP3受體阻斷劑HP可顯著減弱忍冬藤對(duì)腸平滑肌收縮的振幅（P＜0.01），而預(yù)先應(yīng)用雷諾定受體阻斷劑RR后，對(duì)忍冬藤舒張腸平滑肌的作用無(wú)影響（P＞0.05），由此推斷，IP3受體途徑受到抑制，引起細(xì)胞內(nèi)鈣離子釋放減少可能介導(dǎo)忍冬藤舒張腸平滑肌的作用，但雷諾定受體途徑并未介導(dǎo)忍冬藤對(duì)腸平滑肌的舒張作用機(jī)制。

據(jù)報(bào)道，神經(jīng)遞質(zhì)NO通過(guò)激活平滑肌細(xì)胞內(nèi)的鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶，使胞質(zhì)內(nèi)cGMP濃度增高，鈣離子濃度下降，誘導(dǎo)胃腸平滑肌的舒張[23-25]。本試驗(yàn)采用NO合酶抑制劑L-NAME預(yù)處理腸平滑肌細(xì)胞，忍冬藤舒張平滑肌作用明顯減弱（P＜0.01），表明忍冬藤對(duì)腸平滑肌的抑制作用可能與NO濃度有關(guān)，但對(duì)其下游的鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶有無(wú)影響尚需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

通過(guò)忍冬藤對(duì)兔小腸平滑肌運(yùn)動(dòng)的影響研究，表明忍冬藤可濃度依賴性抑制自發(fā)性腸平滑肌收縮，并對(duì)乙酰膽堿、組胺和氯化鋇誘導(dǎo)的腸平滑肌痙攣具有顯著抑制作用；IP3受體阻斷劑HP和NO合酶抑制劑L-NAME預(yù)處理后可顯著增強(qiáng)忍冬藤的舒張作用，而雷諾定受體阻斷劑釕紅并沒(méi)有影響忍冬藤的舒張作用。由此得出忍冬藤抑制兔腸平滑肌收縮的作用機(jī)制可能為增加小腸平滑肌NO濃度，抑制IP3受體介導(dǎo)的內(nèi)鈣釋放，最終使細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度降低，平滑肌舒張而達(dá)到對(duì)腸平滑肌的解痙作用。忍冬藤對(duì)動(dòng)物腸平滑肌運(yùn)動(dòng)具有顯著的舒張作用，因此，該藥在胃腸功能紊亂性疾病的應(yīng)用中，具有廣闊的開(kāi)發(fā)前景。

[1] FARZAN A, KIRCANSKI J, DELAY J, SOLTES G, SONGER J G, FRIENDSHIP R, PRESCOTT J F. An investigation into the association between cpb2 encoding clostridium perfringens type A and diarrhea in neonatal piglets. Canadian Journal of Veterinary Research, 2013, 77(1):45-53.

[2] JAILWALA J, IMPERIALE T F, KROENKE K. Pharmacologic treatment of the irritable bowel syndrome: a systematic review of randomized controlled trials. Annals of Internal Medicine, 2000, 133(2): 136-147.

[3] ZHOU S, ZHANG L P, ZHAO D M, FENG G Y, SONG X D, ZHANG T, HUANG F. The effects of Weichangshu tablet on intracellular Ca2+concentration in cultured rat gastrointestinal smooth muscle cells. Journal of Physiology and Biochemistry, 2011, 67: 265-273.

[4] XU G N, YANG K, XU Z P, ZHU L, HOU L N, QI H, CHEN H Z, CUI Y Y. Protective effects of anisodamine on cigarette smoke extract-induced airway smooth muscle cell proliferation and tracheal contractility. Toxicology and Applied Pharmacology, 2012, 262(1): 70-79.

[5] YAMAGIWA T, AMINO M, MORITA S, YAMAMOTO R, SAITO T, INOKUCHI S. A case of torsades de pointes induced by severe QT prolongation after an overdose of eperisone and triazolam in a patient receiving Nifedipine. Clinical Toxicology, 2010, 48(2):149-152.

[6] 國(guó)家藥典委員會(huì). 中華人民共和國(guó)藥典,Ⅰ部[S]. 北京:化學(xué)工業(yè)出版社, 2000:133. Chinese Pharmacopoeia Commission. Chinese Pharmacopeia,ⅠVolume [S]. Beijing: Chemical Industry Press, 2000:133. (in Chinese)

[7] SEELINGER G, MERFORT I, SCHEMPP C M. Anti-oxidant, anti-inflammatory and anti-allergic activities of luteolin. Planta Medica, 2008, 74(14):1667-1677.

[8] REINDERS R D, BIESTERVELD S, BIJKER P. Survival of Escherichia coli O157:H7 ATCC 43895 in a model apple juice medium with different concentrations of proline and caffeic acid. Applied and Environmental Microbiology, 2001, 67(62) 863-2866.

[9] 國(guó)家藥典委員會(huì). 中華人民共和國(guó)藥典,Ⅰ部[S]. 北京：化學(xué)工業(yè)出版社, 2005:133.Chinese Pharmacopoeia Commission. Chinese Pharmacopeia,Ⅰvolume [S]. Beijing: Chemical Industry Press, 2005:133. (in Chinese)

[10] LIM T K. Edible Medicinal and Non-Medicinal Plants. Fruits, 2014, 7:656-680.

[11] 吳德峰, 王麗輝, 黃玉樹(shù), 翁順太, 張明新, 何玉峰. 忍冬藤作為肉雞飼料添加劑的促生長(zhǎng)和免疫作用研究. 家畜生態(tài)學(xué)報(bào), 2007, 28(3):23-28. WU D F, WANG L H, HUANG Y S, WONG S T, ZHANG M X, HE Y F. Studies on enhancing immunity and raising productivity of meat chicks by feed additive of honeysuckle rattan. Journal of Domestic Animal Ecology, 2007, 28(3):23-28. (in Chinese)

[12] 宋士軍, 李芳芳, 徐瑛, 張麗華, 袁芳, 張翼. 金銀花和黃芩對(duì)家兔小腸平滑肌收縮和電活動(dòng)的影響. 中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜志, 2009, 25(3): 344-348. SONG S J, LI F F, XU Y, ZHANG L H, YUAN F, ZHANG Y. Effects of Honeysuckle Flower and Scutellaria Baicalensis Georgi on contraction and electric activity of rabbit small intestine smooth muscle. Chinese Journal of Applied Physiology, 2009, 25(3): 344-348. (in Chinese)

[13] SANDERS K.M. Regulation of smooth muscle excitation and contraction. Neurogastroenterology and Motility, 2008, 20(1): 39-53.

[14] WANG H, YIN G H, YU C H, WANG Y S, SUN Z L. Inhibitory effect of sanguinarine on PKC-CPI-17 pathway mediating by muscarinic receptors in dispersed intestinal smooth muscle cells. Research in Veterinary Science, 2013, 95(3):1125-1133.

[15] UNNO T, KWON S C, OKAMOTO H, IRIE Y, KATO Y, MATSUYAMA H, KOMORI S. Receptor signaling mechanisms underlying muscarinic agonist-evoked contraction in guinea-pig ileal longitudinal smooth muscle. British Journal of Pharmacology, 2003, 139, 337-350.

[16] EHLERT F J, OSTROM R S, SAWYER G W. Subtypes of the muscarinic receptor in smooth muscle. Life Sciences, 1997, 61(18): 1729-1740.

[17] BOLTON T B, CLARK J P. Effects of histamine, high Potassium and carbochol on K efflux from longitudinal muscle of guinea-Pig intestine. The Journal of Physiology, 1981, 320:347.

[18] 韓堅(jiān), 陳孝健. 離體腸管實(shí)驗(yàn)的研究概況. 中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào), 2008, 14( 3) :94- 97. HAN J, CHEN X J. Study overview of invisible spectro intestine experiment. Guiding Journal of TCM, 2008, 14(3):94-97. (in Chinese) [19] BOLTON T B, PRESTWICH S A, ZHOLOS A V, GORDIENKO D V. Excitation-contraction coupling in gastrointestinal and other smooth muscles. Annual Review of Physiology, 1999, 61:85- 115.

[20] 張佳, 邵正威, 高雅, 王巧云. 槲皮素對(duì)兔離體腸平滑肌的舒張作用及其機(jī)制. 中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜志, 2013, 29( 2):162-165. ZHANG J, SHAO Z W, GAO Y, WANG Q Y. Influences of quercetin on contraction of small intestine smooth muscle of rabbits in vitro and its mechanism. Chinese Journal of Applied Physiology, 2013, 29(2):162-165. (in Chinese)

[21] BOLTON T B, GORDIENKO D V, PUCOVSKY V, PARSONS S, POVSTYAN O. Calcium release events in excitation-contraction coupling in smooth muscle. Novartis Foundation Symposium, 2002, 24(6):154-168.

[22] MCCARRON J G, CHALMERS S, BRADLEY K N, MACMILLAN D, MUIR T C. Ca2+microdomains in smooth muscle. Cell Calcium, 2006, 40:461-493.

[23] FREI E, HUSTER M, SMITAL P, SCHLOSSMANN J, HOFMANN F, WEGENER J W. Calcium-dependent and calcium-independent inhibition of contraction by cGMP/cGKI in intestinal smooth muscle. American Journal of Physiology-gastrointestinal and Liver Physiology, 2009, 297:G834-G839.

[24] HOFMANN F. The biology of cyclic GMP-dependent protein kinases. The Journal of Biological Chemistry, 2005, 280:1-4.

[25] MURTHY K S. Signaling for contraction and relaxation in smooth muscle of the gut. Annual Review of Physiology, 2006, 68:345-374.

（責(zé)任編輯 林鑒非）

Relaxed Effect of Caulis Lonicerae Extraction on Contraction of Intestinal Smooth Muscle of Rabbit in Vitro and Its Mechanism

WANG Hui, ZHANG HaiJuan, LI ZhiDong
( School of Pharmaceutical Sciences, Linyi University, Linyi 276000, Shandong )

【Objective】Excessive gastrointestinal smooth muscle contraction cause abdominal pain and diarrhea diseases in clinical. Recently, Ca2+channel blocker nifedipine and anticholinergic atropine are widely employed in the treatment of gastrointestinal excessive contraction. However, nifedipine has a potent negative inotropic and dromotropic effects with dose increase after long-term administration, and atropine has severe side-effects which highly limited its clinical utilization. Therefore, it is important to develop natural medicines with high activity, low toxicity and no residue. In this research, the effects of Caulis lonicerae extraction on spontaneous smooth muscle contractions in isolated rabbit small intestine were investigated and the possiblemechanism was explored.【Method】The in vitro intestine movement experiment, was conducted and the BL-420E biologic function analysis system was employed. The influences of C. lonicerae extraction on spontaneous contractions of the rabbit intestinal smooth muscle were measured. The effects of C. lonicerae extraction on spasmodic muscle contractions were measured by using acetylcholine (ACh), histamine (HA) and BaCl2. The mechanism of C. lonicerae extraction was studied by using inositol 1,4,5-trisphosphate (IP3) receptor antagonist (heparin, HP), ryanodine receptor antagonist (ruthenium red, RR) and a nitric oxide synthase (NOS) inhibitor (Nitro-L-arginine methyl ester, L-NAME).【Result】The results showed that the extraction of Caulis lonicerae extraction dose-dependently inhibited the spontaneous contraction of intestinal smooth muscle. Caulis lonicerae extraction, at the concentration of 7.5 g·L-1, showed highly inhibition effects on the frequency of spontaneous contractions (P＜ 0.05). Meanwhile, at the concentration of 5 g·L-1, significantly inhibition effects on the amplitude of spontaneous contractions (P ＜ 0.05) were detected. ACh, HA and BaCl2significantly induced the amplitude of smooth muscle contractions, and C. lonicerae extraction notably inhibited the muscle contractions induced by ACh, HA and BaCl2(P ＜ 0.05 or P ＜ 0.01). IP3receptor antagonist heparin could strengthen the relaxed effects of C. lonicerae extraction on intestinal smooth muscle, but ryanodine receptor antagonist ruthenium red had no effect on the relaxation of C. lonicerae extraction. L-NAME inhibited the relaxation of C. lonicerae extraction (P ＜ 0.01).【Conclusion】The extraction of C. lonicerae inhibited the frequency and amplitude of intestinal smooth muscle contractions of rabbits in vitro. The mechanism may be related to the increase of NO concentration in intestinal smooth muscle, and the inhibiting intracellular Ca2+released via IP3of sarcoplasmic reticulum.

extraction of Caulis lonicerae; rabbit; intestinal smooth muscle; calcium; nitric oxide

2016-01-05；接受日期：2016-12-02

國(guó)家星火計(jì)劃項(xiàng)目（2013GA740080）、山東省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（2013GSF11909）

聯(lián)系方式：王慧，Tel：0539-8766716；Fax：0539-8766716；E-mail：wys450@163.com