李婷婷，連方，孫振高

(1山東中醫(yī)藥大學(xué)，濟(jì)南 250355;2山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院)

二至天癸顆粒對小鼠卵細(xì)胞及胚胎質(zhì)量的影響及其機制

李婷婷1，連方2，孫振高2

(1山東中醫(yī)藥大學(xué)，濟(jì)南 250355;2山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院)

目的 探討二至天癸顆粒提高小鼠卵細(xì)胞及胚胎質(zhì)量的機制。方法 將180只7周齡雌性小鼠按隨機數(shù)字表法分為三組各60例。二至天癸組予二至天癸顆粒加注射用尿促性素(HMG)超排卵；注射用絨毛膜促性素(HCG)組予HMG及HCG超排卵；空白組不干預(yù)。每組各30只取卵及顆粒細(xì)胞，解剖鏡下觀察卵母細(xì)胞形態(tài)，有極體排出計為MⅡ卵，計算優(yōu)質(zhì)卵率(MⅡ卵/獲卵數(shù))。剩余30只小鼠取胚胎行形態(tài)學(xué)觀察，記錄優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)、計算優(yōu)質(zhì)胚胎率。Western blotting法和RT-PCR法分別檢測顆粒細(xì)胞FasL、Fas、Caspase8、Caspase3 mRNA及其蛋白表達(dá)；熒光素酶法檢測MⅡ卵及胚胎ATP。分析FasL、Fas、Caspase8、Caspase3表達(dá)與MⅡ卵及胚胎平均ATP的相關(guān)性。結(jié)果 三組獲卵數(shù)和MⅡ卵數(shù)比較，結(jié)果均為二至天癸組>HCG組>空白組，但二至天癸組與HCG組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)，兩組與空白組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.01)；三組優(yōu)質(zhì)卵率和MⅡ卵平均ATP含量比較，結(jié)果均為二至天癸組>空白組>HCG組，且二至天癸組明顯高于HCG組(P<0.05)，但二至天癸組和空白組相比、空白組和HCG組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>均0.05)。三組胚胎數(shù)比較，二至天癸組>HCG組>空白組，但HCG組和空白組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)二至天癸組>空白組>HCG組，但三組間兩兩比較均無統(tǒng)計學(xué)差異(P均>0.05)；優(yōu)質(zhì)胚胎率和胚胎平均ATP空白組與二至天癸組比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，兩組均明顯高于HCG組(P均<0.01)。二至天癸組Fas和Caspase3蛋白及mRNA表達(dá)均低于HCG組(P均<0.05)，與空白組比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P均>0.05)；FasL蛋白及mRNA三組間表達(dá)比較均無統(tǒng)計學(xué)差異(P均>0.05)；二至天癸組Caspase8 mRNA與HCG組比較無統(tǒng)計學(xué)差異，但Caspase8蛋白表達(dá)低于HCG組(P>0.05)。Caspase3蛋白和mRNA的表達(dá)與MⅡ卵及胚胎平均ATP含量均呈負(fù)相關(guān)(P均<0.05)。結(jié)論 二至天癸顆粒可提高卵細(xì)胞質(zhì)量和胚胎質(zhì)量，其機制可能為下調(diào)顆粒細(xì)胞Fas、Caspase3表達(dá)。

二至天癸顆粒；顆粒細(xì)胞；Fas通路；小鼠

近幾年輔助生殖技術(shù)飛速發(fā)展，但臨床妊娠率始終較低，沒有大的突破。2012年9月ESHRE公布?xì)W洲國家體外授精-胚胎移植/卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射技術(shù)(IVF/ICSI)成功率僅在30%左右[1]。隨著自然環(huán)境和社會環(huán)境的變化，影響人類配子和受精卵質(zhì)量的因素日趨增多而復(fù)雜，不孕癥發(fā)病率也逐年增高。影響成功妊娠的因素較多，其中卵母細(xì)胞質(zhì)量和胚胎發(fā)育潛能是關(guān)鍵因素之一。包繞著卵母細(xì)胞的顆粒細(xì)胞(以下稱顆粒細(xì)胞)為卵巢的主要功能細(xì)胞之一，具有支持和營養(yǎng)卵母細(xì)胞的作用，是影響生殖功能的重要一環(huán)。二至天癸顆粒來源于山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院連方教授創(chuàng)立的補腎調(diào)沖之二至天癸方。多年來在臨床上用于行IVF-ET的不孕癥患者，臨床及實驗研究發(fā)現(xiàn)其能提高卵母細(xì)胞和胚胎質(zhì)量，改善子宮內(nèi)膜容受性，提高妊娠率。本研究探討二至天癸顆粒提高大鼠卵細(xì)胞與胚胎質(zhì)量的效果及其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗動物：同一時期出生的7周齡SPF級健康性成熟昆明種雌性小鼠180只(山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供)，體質(zhì)量(35±5)g。動物質(zhì)量合格許可證號：SCXK(魯)20140004。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后對雌鼠行陰道分泌物涂片檢查確定動情周期，見大量卵圓角化細(xì)胞即確定為動情期，將連續(xù)觀察到兩個動情周期的小鼠納入實驗。實驗藥物：二至天癸顆粒，山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院制劑室提供[院內(nèi)批號：(01)FZ032-03]，規(guī)格：3 g/包，12包/袋；組成：女貞子、旱蓮草、菟絲子、枸杞子、當(dāng)歸、白芍、川芎、熟地黃、制香附、炙甘草。注射用尿促性素(HMG)、注射用絨毛膜促性素(HCG)均由麗珠集團(tuán)麗珠制藥廠生產(chǎn)。試劑與儀器：抗體均購自Bioworld公司，引物由上海漢尹生物科技有限公司設(shè)計合成，三磷酸腺苷(ATP)檢測試劑盒為碧云天生物技術(shù)公司產(chǎn)品，編號S0026。

1.2 動物分組及干預(yù) 將符合實驗標(biāo)準(zhǔn)的180只雌性小鼠隨機分為二至天癸組、HCG組、空白組，各60只。采用人與動物的體表面積直接計算法[2]計算小鼠的每日用藥量，小鼠每日服用二至天癸顆粒0.1 g相當(dāng)一般成人的每日服藥量。取一包二至天癸顆粒溶于7.5 mL蒸餾水，得0.4 g/mL混懸液，每日0.25 mL灌胃。注射用HMG 75 U溶于2.5 mL生理鹽水中，每只小鼠每次取0.4 mL注射。注射用HCG 1 000 U溶于2.5 mL生理鹽水中，取0.1 mL(40 U)加0.9 mL生理鹽水，每次注射0.3 mL。每日下午16時雌鼠灌胃給藥，二至天癸組用二至天癸顆粒，HCG組及空白組用等量蒸餾水，均連續(xù)10 天。第11天(下午16時)二至天癸組與HCG組同時腹腔注射HMG 10 IU，48 h后腹腔注射HCG 12 IU。

1.3 標(biāo)本獲取 每組各取半數(shù)小鼠，二至天癸組及HCG組于注射HCG后14 h、空白組于陰道上皮角化次日(對雌鼠行陰道分泌物涂片檢查確定動情周期)斷頸處死，剪取輸卵管，收集卵丘復(fù)合物及顆粒細(xì)胞;選取MⅡ期卵細(xì)胞脫顆粒，分離顆粒細(xì)胞。每組剩余半數(shù)小鼠按照雌∶雄=1∶1提前兩周準(zhǔn)備8周齡雄性小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)，于雌鼠注射HCG后分別合籠飼養(yǎng)，次日晨檢栓，合籠40 h后同上法處死小鼠，解剖取出輸卵管，TB 針沖洗一端，使受精卵從另一端流出，收集受精卵于含P-1液的四孔培養(yǎng)皿中進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察后放入培養(yǎng)箱待用。

1.4 相關(guān)指標(biāo)觀察 ①卵細(xì)胞、胚胎形態(tài)學(xué)變化：解剖鏡下觀察卵母細(xì)胞形態(tài)，有極體排出計為MⅡ卵，分裝每只鼠所獲的MⅡ卵，計算優(yōu)質(zhì)卵率(MⅡ卵/獲卵數(shù))。分裝每只鼠所獲胚胎，進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，記錄優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)、計算優(yōu)質(zhì)胚胎率。②顆粒細(xì)胞FasL、Fas、Caspase8、Caspase3表達(dá)：Western blotting法檢測顆粒細(xì)胞FasL、Fas、Caspase8、Caspase3蛋白的相對表達(dá)量；RT-PCR法檢測顆粒細(xì)胞FasL mRNA、Fas mRNA、Caspase8 mRNA、Caspase3 mRNA的相對表達(dá)量。③MⅡ卵及胚胎線粒體ATP含量：熒光素酶法檢測MⅡ卵及胚胎線粒體ATP，按照試劑盒說明進(jìn)行操作。

2 結(jié)果

因在動情周期觀察、給藥、標(biāo)本留取及檢測過程中均有小鼠被剔除，最終計入統(tǒng)計的為每組各40只。

2.1 三組卵及胚胎情況比較 見表1、2。

表1 三組卵基本情況比較±s)

注：與空白組比較，*P<0.05，△P<0.01；與HCG組比較，#P<0.01。

表2 三組胚胎基本情況比較±s)

注：與空白組比較，*P<0.05，△P<0.01；與HCG組比較，#P<0.01。

2.2 三組FasL、Fas、Caspase8、Caspase3蛋白表達(dá)比較 見表3。

表3 三組FasL、Fas、Caspase8、Caspase3蛋白

注：與空白組比較，*P<0.05，△P<0.01；與HCG組比較，#P<0.01。

2.3 三組FasL、Fas、Caspase8、Caspase3 mRNA表達(dá)比較 見表4。

表4 三組FasL、Fas、Caspase8、Caspase3 mRNA

注：與空白組比較，*P<0.05，△P<0.01；與HCG組比較，#P<0.05。

2.4 相關(guān)性分析 Caspase3蛋白和mRNA相對表達(dá)量與MⅡ卵ATP含量均呈負(fù)相關(guān)(r分別為-0.326和-0.266，P均<0.05)，與胚胎線粒體ATP含量亦均呈負(fù)相關(guān)(r分別為-0.398和-0.319，P均<0.05)；FasL、Fas、Caspase8蛋白和mRNA相對表達(dá)量與MⅡ卵ATP含量、胚胎線粒體ATP含量均無明顯相關(guān)性(P均>0.05)。

3 討論

卵母細(xì)胞和胚胎著床以前的發(fā)育有賴于能量的產(chǎn)生，線粒體內(nèi)氧化磷酸化作用產(chǎn)生的ATP可反映卵母細(xì)胞和胚胎耗氧量，是整體代謝活性的評判指標(biāo)。Tejera等[3]測定IVF治療患者的卵母細(xì)胞耗氧率發(fā)現(xiàn)，能正常受精的卵母細(xì)胞較不受精或異常受精者具有更高的耗氧率，形成胚胎并成功著床的卵母細(xì)胞亦高于未著床者，提示在受精前單個卵母細(xì)胞的耗氧率可作為無創(chuàng)評估卵母細(xì)胞質(zhì)量及其發(fā)育潛能的良好指標(biāo)[4]。線粒體活性與數(shù)目較低的卵母細(xì)胞往往容易發(fā)生成熟障礙，受精失敗以及胚胎發(fā)育能力低下[4～7]。本研究結(jié)果顯示，MⅡ卵ATP含量二至天癸組>空白組>HCG組，二至天癸組明顯高于HCG組；胚胎數(shù)二至天癸組>空白組>HCG組，但空白組和HCG組之間比較無明顯統(tǒng)計學(xué)差異；優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)二至天癸組>空白組>HCG組，且組間比較均具有明顯統(tǒng)計學(xué)差異；優(yōu)質(zhì)胚胎率和胚胎線粒體ATP含量二至天癸組>空白組>HCG組，但二至天癸組與空白組比較無明顯統(tǒng)計學(xué)差異?？梢姸撂旃镱w粒可以提高卵和胚胎的活性，從而提高卵細(xì)胞和胚胎質(zhì)量，以利于受精和胚胎發(fā)育。

FasL/Fas-FADD-Caspase8-Caspase3為經(jīng)典的凋亡通路，可介導(dǎo)多個器官內(nèi)多種組織細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果表明，二至天癸組Fas和Caspase3 mRNA及其蛋白表達(dá)均明顯低于HCG組，與空白組比較無統(tǒng)計學(xué)差異；FasL mRNA及其蛋白表達(dá)三組間比較均無統(tǒng)計學(xué)差異；二至天癸組Caspase8 mRNA表達(dá)與HCG組比較無統(tǒng)計學(xué)差異，但Caspase8蛋白表達(dá)明顯低于HCG組。四個關(guān)鍵蛋白和mRNA的表達(dá)在三組的表達(dá)大致趨勢是一致的，二至天癸組的表達(dá)低于HCG組，與空白組的表達(dá)水平大致相當(dāng)。其組內(nèi)的表達(dá)差異一是考慮個體差異，二是在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的復(fù)雜通路中，蛋白可能受到上游下游多個蛋白的共同調(diào)控。說明某一蛋白表達(dá)上調(diào)或下調(diào)只能從一個側(cè)面反映機體狀況或藥物作用，如需深入研究則應(yīng)構(gòu)建整個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)。這與中醫(yī)整體觀念的思路是一致的。

Caspase3是一種細(xì)胞內(nèi)蛋白酶家族，在哺乳動物細(xì)胞的凋亡過程中起關(guān)鍵作用。目前己經(jīng)發(fā)現(xiàn)了14種不同的Caspase分子，其中Caspase3是最為重要的最終效應(yīng)Caspase分子[8]。在正常情況下體內(nèi)的Caspase3蛋白酶以未活化的形式，即酶原形式存在[9,10]。Caspase3活化涉及到一系列上游Caspase級聯(lián)反應(yīng)，并受到多種細(xì)胞內(nèi)小分子的調(diào)控，如凋亡抑制蛋白、Bcl-2家族蛋白、鈣蛋白酶等。只有在上游Caspase作用下，Caspase3大、小亞基之間天冬氨酸殘基發(fā)生水解，使兩者的位置發(fā)生交換，形成異源四聚體的活化形式，才能執(zhí)行細(xì)胞凋亡的發(fā)生[11～14]。本研究二至天癸組顆粒細(xì)胞Caspase3蛋白表達(dá)明顯低于HCG組；顆粒細(xì)胞Caspase3表達(dá)與MⅡ卵和胚胎線粒體ATP含量具有相關(guān)性。推測Caspase3可能為最終效應(yīng)分子，與卵細(xì)胞和胚胎質(zhì)量的相關(guān)性關(guān)系密切。綜上所述，二至天癸顆粒可提高卵細(xì)胞和胚胎質(zhì)量。其機制可能與下調(diào)顆粒細(xì)胞Fas通路Fas、Caspase3表達(dá)有關(guān)。顆粒細(xì)胞Caspase3表達(dá)作為卵細(xì)胞質(zhì)量評估和胚胎選擇的客觀指標(biāo)之一。

[1] Ferraretti AP, GoossensV, de Mouzon J, et al. Assisted reproductive technology in Europe,2008: results generated from European registers by ESHRE[J].Hum Reprod, 2012,27(9):2571-2584.

[2] 苗明三.實驗動物和動物實驗技術(shù)[M].北京:中國中醫(yī)藥出版社,2003:143-144.

[3] Tejera A, Herrero J, de Los Santos MJ, et al. Oxygen consumption is a quality marker for human oocyte competence conditioned by ovarian stimulation regimens[J]. Fertil Steril, 2011,96(3):618-623.

[4] 黃穎,于洋,喬杰.卵母細(xì)胞質(zhì)量評估研究進(jìn)展[J].國際生殖健康/計劃生育雜志,2014,33(4):301-305.

[5] VanBlerkom J. Mitochondria in human oogenesis and preimplantationembryogenesis: engines of metabolism,ionic regulation and developmental competence[J]. Reproduction, 2004,128(3):269-280.

[6] Dumollard R, Ward Z, Carroll J, et al. Regulation of redox metabolism in the mouse oocyte and embryo[J]. Development, 2007,134(3):455-465.

[7] 羊海濤,覃愛平,靳玉甫,等.體外受精-胚胎移植婦女體內(nèi)顆粒細(xì)胞線粒體活性和左旋肉堿水平的關(guān)系[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志,2014,24(28):31-34.

[8] Fan T, Han LH, Cong RS, et al. Caspase family proteases and apoptosis[J]. ActaBiochimBiophys Sin (Shanghai), 2005,37(11):719-727.

[9] Shi Y. Caspase activation, inhibition, and reactivation: a mechanistic view[J]. Protein Science, 2004,13(8):1979-1987.

[10] Fadeel B, Orrenius S. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in human disease[J]. J Intern Med, 2005,258(6):479-517.

[11] Hengartner MO. The biochemistry of apoptosis[J]. Nature, 2000,407(6805):770-776.

[12] Riedl SJ,Shi Y. Molecular mechanisms of caspase regulation during apoptosis[J]. Nat Rev Mol Cell Biol, 2004,5(11):897-907.

[13] 岳原亦,張揚,張一奇.Caspase家族與細(xì)胞凋亡[J].中國醫(yī)療前沿,2011,6(6):25-26.

[14] 柴繼杰,施一公.凋亡小體與炎癥小體:Caspase蛋白酶的激活平臺[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展,2014,41(10):1056-1062.

國家自然科學(xué)基金資助項目(81473720)。

連方(E-mail： f_lian@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.04.011

R321.1

A

1002-266X(2017)04-0037-03

2016-03-20)