高兵兵，吳月奎，馬建華，易波，戴宜武

(安徽醫(yī)科大學(xué)北京軍區(qū)總醫(yī)院，北京100700)

大麻二酚對(duì)急性腦出血小鼠的神經(jīng)保護(hù)作用及其機(jī)制

高兵兵，吳月奎，馬建華，易波，戴宜武

(安徽醫(yī)科大學(xué)北京軍區(qū)總醫(yī)院，北京100700)

目的 探討大麻二酚對(duì)急性腦出血小鼠的神經(jīng)保護(hù)作用及其機(jī)制。方法 將72只C57BL/6小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和大麻二酚組，每組24只。模型組和大麻二酚組采用Ⅶ型膠原酶注入紋狀體的方法制備急性腦出血模型，假手術(shù)組注入等量生理鹽水。大麻二酚組術(shù)后2、12、24、48 h腹腔注射大麻二酚20 mg/kg。術(shù)后2、72 h采用神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分評(píng)價(jià)各組神經(jīng)功能；術(shù)后72 h檢測(cè)腦組織含水量，采用ELISA法檢測(cè)腦組織IL-1β、IL-6表達(dá)，TUNEL染色后計(jì)數(shù)神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)量。結(jié)果 模型組、大麻二酚組和假手術(shù)組術(shù)后2、72 h神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分均依次降低，兩兩比較P均<0.05。模型組、大麻二酚組和假手術(shù)組腦組織含水量、神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)量和腦組織IL-1β、IL-6表達(dá)均依次降低，兩兩比較P均<0.05。結(jié)論 大麻二酚對(duì)急性腦出血小鼠具有神經(jīng)保護(hù)作用；抑制IL-1β、IL-6表達(dá)可能為其作用機(jī)制。

急性腦出血；大麻二酚；腦水腫；炎癥；神經(jīng)細(xì)胞凋亡；小鼠

腦出血是一種急性腦卒中，患者多合并嚴(yán)重的神經(jīng)損傷[1，2]。研究表明，繼發(fā)性腦水腫、神經(jīng)炎癥反應(yīng)和神經(jīng)元凋亡均可造成腦出血患者的神經(jīng)損傷[3，4]。大麻二酚提取于天然植物大麻，無(wú)精神效應(yīng)，對(duì)焦慮、抑郁、驚厥和腫瘤等均具有治療作用[5]。但目前關(guān)于大麻二酚對(duì)腦出血后神經(jīng)損傷的治療作用鮮見(jiàn)報(bào)道。2015年5～12月，我們觀察了大麻二酚對(duì)急性腦出血小鼠的神經(jīng)保護(hù)作用，現(xiàn)分析結(jié)果并探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：雄性C57BL/6小鼠72只，10周齡，體質(zhì)量20～25 g，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。主要試劑及儀器：大麻二酚溶液購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司，Ⅶ型膠原酶購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，ELISA試劑盒購(gòu)于美國(guó)Minneapolis公司，TUNEL試劑盒購(gòu)于德國(guó)Roche公司；立體定向儀購(gòu)于美國(guó)Stoelting公司。

1.2 急性腦出血模型制備 將72只小鼠隨機(jī)分為大麻二酚組、模型組和假手術(shù)組各24只。大麻二酚組及模型組制備腦出血模型：3.6%水合氯醛(0.1 mL/10 g)腹腔注射麻醉，小鼠固定于立體定向儀。剪開頭皮，充分暴露前囟，以前囟為原點(diǎn)定位鉆孔(右1.8 mm、前0.8 mm、硬膜下3.0 mm)，將150 mL膠原酶生理鹽水混合液(含0.05 U Ⅶ型膠原酶)注入紋狀體，停針10 min后緩慢拔針，縫合頭皮；假手術(shù)組注入150 mL生理鹽水，其余處理同大麻二酚組、模型組。各組術(shù)后2 h通過(guò)Grid Test行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分， 0分為運(yùn)動(dòng)功能正常；1分為提起尾部后小鼠雙側(cè)前肢和軀干屈曲；2分為小鼠向腦出血側(cè)旋轉(zhuǎn)，但休息時(shí)姿勢(shì)正常；3分為小鼠向腦出血側(cè)旋轉(zhuǎn)，休息時(shí)向腦出血側(cè)依靠；4分小鼠為向腦出血側(cè)滾動(dòng)；5分為小鼠休息時(shí)向腦出血側(cè)依靠(無(wú)自主活動(dòng))。結(jié)果顯示，大麻二酚組、模型組神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分均為(5.0±0.0)分，均明顯高于假手術(shù)組0分(P均<0.05)；證實(shí)急性腦出血模型制備成功。

1.3 分組處理 三組分別于術(shù)后2、12、24、48 h腹腔注射0.5 mL/20 g混合液(2%吐溫80+生理鹽水)，大麻二酚組同時(shí)腹腔注射20 mg/kg大麻二酚(0.4 mg/0.5 mL)。

1.4 相關(guān)指標(biāo)觀察

1.4.1 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分 各組術(shù)后72 h隨機(jī)選取16只小鼠，參照1.2的方法行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分，以評(píng)價(jià)神經(jīng)功能。

1.4.2 腦組織含水量 各組術(shù)后72 h隨機(jī)選擇8只處死，迅速取出大腦，分離出血側(cè)腦組織。稱量大腦濕重，將其在100 ℃烘箱中持續(xù)烘干24 h，稱量大腦干重。腦組織含水量=(大腦濕重-大腦干重)/大腦濕重×100%。

1.4.3 腦組織IL-1β、IL-6表達(dá) 采用ELISA法。各組術(shù)后72 h另取8只處死，迅速取出大腦，分離出血側(cè)腦組織，-80 ℃冰箱保存。采用ELISA試劑盒檢測(cè)腦組織IL-1β、IL-6表達(dá)，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書操作。

1.4.4 神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況 采用TUNEL染色。各組均于術(shù)后72 h取剩余8只小鼠固定好的腦組織，采用15%和30% PBS蔗糖溶液進(jìn)行梯度脫水，15 μm厚度切片。4 ℃條件下，將腦組織切片在含0.1%Triton X-100、0.1%檸檬酸鈉的PBS溶液中孵育2 min，PBS溶液沖洗3次，每次5 min；每個(gè)切片上加50 μL TUNEL反應(yīng)混合液(TdT/熒光素標(biāo)記的dUTP=1/9)，37 ℃條件下暗濕盒中反應(yīng)1 h，PBS洗3次；加入50 μL converter-POD，37 ℃條件下暗濕盒中反應(yīng)1 h，PBS洗3次。加入50 μL DAB底物，室溫下反應(yīng)10 min，PBS漂洗3次，最后進(jìn)行蘇木素染色。200倍光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選取4個(gè)視野，計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù)量，取平均值。凋亡細(xì)胞核染色呈棕色，正常細(xì)胞核染色呈藍(lán)色。

2 結(jié)果

2.1 各組神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分 模型組術(shù)后72 h神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分為(3.4±0.5)分，大麻二酚組為(1.9±0.6)分，假手術(shù)組為0分；三組神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分依次降低，兩兩比較P均<0.05。

2.2 各組腦組織含水量比較 模型組術(shù)后72 h腦組織含水量為81.65%±0.39%，大麻二酚組為79.50%±0.08%，假手術(shù)組為78.91%±0.12%；三組腦組織含水量依次降低，兩兩比較P均<0.05。

2.3 各組腦組織IL-1β、IL-6表達(dá)比較 模型組、大麻二酚組和假手術(shù)組腦組織IL-1β、IL-6表達(dá)均依次降低，兩兩比較P均<0.05。見(jiàn)表1。

表1 各組腦組織IL-1β、IL-6表達(dá)比較

注：與模型組比較，*P<0.05；與大麻二酚組比較，#P<0.05。

2.4 各組神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)量比較 術(shù)后72 h模型組神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)量為(119.4±8.2)個(gè)，大麻二酚組為(73.4±4.9)個(gè)，假手術(shù)組為(17.0±3.7)個(gè)；三組神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)量依次降低，兩兩比較P均<0.05。

2.5 神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)量與其他指標(biāo)的關(guān)系 Spearman相關(guān)分析顯示，小鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)量與神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分、腦組織含水量、腦組織IL-1β表達(dá)、腦組織IL-6表達(dá)均呈正相關(guān)(r分別為0.512、0.525、0.379、0.370，P均<0.05)。

3 討論

腦水腫是腦出血后的繼發(fā)性損傷之一，可導(dǎo)致顱內(nèi)壓增高、腦組織損傷、腦疝等，從而危及患者生命[3,6]。腦水腫經(jīng)典的發(fā)生機(jī)制為血管源性水腫和細(xì)胞毒性水腫，腦出血后的一系列病理變化，包括靜水壓改變和血凝塊回縮等導(dǎo)致血清蛋白滲入到周圍組織中，激活凝血系統(tǒng)并產(chǎn)生凝血酶，促進(jìn)炎癥因子表達(dá)并破壞血腦屏障，進(jìn)而導(dǎo)致血管源性水腫；隨后紅細(xì)胞裂解釋放出血紅蛋白，介導(dǎo)細(xì)胞毒性[2,6～8]。本研究結(jié)果顯示，模型組、大麻二酚組和假手術(shù)組腦組織含水量依次降低，組間兩兩比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；說(shuō)明大麻二酚能減輕急性腦出血小鼠的腦水腫，但是其具體機(jī)制尚不明確。

在急性腦出血過(guò)程中，小膠質(zhì)細(xì)胞、星型膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元和內(nèi)膜細(xì)胞等均可分泌炎癥介質(zhì)，如IL-1、IL-6等，這些炎癥介質(zhì)刺激細(xì)胞黏附因子表達(dá)，從而促進(jìn)白細(xì)胞黏附、遷移到腦實(shí)質(zhì)中，參與腦損傷[9～12]。本研究結(jié)模型組、大麻二酚組和假手術(shù)組腦組織IL-1和IL-6表達(dá)依次降低，組間兩兩比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；說(shuō)明大麻二酚能抑制炎癥因子的表達(dá)，進(jìn)而抑制炎癥反應(yīng)；其機(jī)制可能與大麻二酚抑制星型膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的激活和聚集，從而抑制炎癥介質(zhì)的釋放有關(guān)[12，13]，仍需進(jìn)一步研究。

研究證實(shí)，腦出血所導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡主要存在于血腫周圍，遠(yuǎn)離血腫區(qū)域并無(wú)明顯的細(xì)胞凋亡[14]。炎癥反應(yīng)可導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡，包括神經(jīng)元、星型膠質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)膜細(xì)胞等，凋亡細(xì)胞可激活小膠質(zhì)細(xì)胞和星型膠質(zhì)細(xì)胞，并促進(jìn)其聚集，釋放炎癥介質(zhì)，加重炎癥反應(yīng)[14～16]。本研究模型組、大麻二酚組和假手術(shù)組神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分和神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)量均依次降低，組間兩兩比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，且神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分和神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)量呈正相關(guān)；說(shuō)明大麻二酚具有抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，保護(hù)神經(jīng)功能的作用。

綜上所述，大麻二酚對(duì)急性腦出血小鼠具有神經(jīng)保護(hù)作用；其機(jī)制可能與抑制IL-1、IL-6表達(dá)有關(guān)。

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國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81271391)。

戴宜武(E-mail: daiyiwuu@126.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.04.010

R743.34

A

1002-266X(2017)04-0034-03

2016-01-14)