趙亞麗，蘇超，甘世虎，任媛媛，高星杰，楊潔，何津巖

(天津醫(yī)科大學，天津300070)

·論著·

人Tudor-SN UTR片段熒光素酶報告基因表達質(zhì)粒的構(gòu)建及活性檢測

趙亞麗，蘇超，甘世虎，任媛媛，高星杰，楊潔，何津巖

(天津醫(yī)科大學，天津300070)

目的 為深入研究Tudor-SN蛋白本身在翻譯水平的調(diào)控機制奠定基礎(chǔ)。方法 以HeLa細胞全基因組DNA為模板，PCR擴增出目的基因，利用雙酶切的方法將目的片段連接到pGL3-Control載體上。再將構(gòu)建成功的pGL3-5′UTR、pGL3-3′UTR重組質(zhì)粒分別與內(nèi)參海腎熒光素酶質(zhì)粒瞬時共轉(zhuǎn)染HeLa細胞，培養(yǎng)48 h檢測熒光素酶的活性。結(jié)果 雙酶切和基因測序法鑒定重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒后可檢測到熒光素酶的活性；以pGL3-5′UTR質(zhì)粒熒光素酶活性最高。結(jié)論 成功構(gòu)建了人Tudor-SN基因5′UTR和3′UTR序列的重組質(zhì)粒，為研究Tudor-SN基因UTR區(qū)對翻譯調(diào)控的影響奠定了基礎(chǔ)。

人Tudor-SN蛋白；5′UTR；3′UTR；重組質(zhì)粒；熒光素酶

Tudor-SN蛋白又常被稱為SND1蛋白，該蛋白于1995年首次作為EB病毒細胞核抗原2(EBNA2)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控激活因子被發(fā)現(xiàn)[1]。通過疏水簇結(jié)構(gòu)域(HCA)分析可知，Tudor-SN蛋白由N端重復(fù)的4個葡萄球菌核酸酶類似物(SN)和C端的TSN片段組成[2]。近年研究發(fā)現(xiàn)，Tudor-SN多功能蛋白參與很多生物學行為，如細胞的應(yīng)激反應(yīng)[3]、脂代謝[4]，細胞周期調(diào)控[5]，pre-mRNA的剪切加工[6]和基因的表達調(diào)控[7]等。目前關(guān)于Tudor-SN蛋白自身表達調(diào)控的研究鮮見。2016年5～8月，本研究采用pGL3-Control質(zhì)粒載體構(gòu)建Tudor-SN UTR區(qū)域的熒光素酶重組質(zhì)粒，旨在為深入研究Tudor-SN蛋白在翻譯水平的調(diào)控機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 pGL3-Control螢火蟲熒光素酶基因表達載體、雙熒光素酶檢測試劑盒購自Promega公司；限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ、Nco Ⅰ、Xba Ⅰ、Hpa Ⅰ、T4 DNA Ligase購自Thermo公司；Lipofectamine? 2000購自Invitrogen公司；去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒、基因組DNA抽提試劑盒購自O(shè)mega公司，DNA快速膠回收提取試劑盒購自BIOMIGA公司；引物合成、基因測序由GENEWIZ公司完成；ONPG購自Sigma公司；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基購自Hyclone公司；HeLa細胞、內(nèi)參海腎熒光素酶質(zhì)粒為本課題組保存。1.2 Tudor-SN基因5′UTR、3′UTR序列引物設(shè)計 利用NCBI、UCSC網(wǎng)站明確人Tudor-SN基因的5′UTR、3′UTR序列，設(shè)計引物：5′UTR上游引物：5′-CAAGCTTACGCTTGCGCGGCGAGTAG-3′，下游引物：5′-GCCATGGGTGTGGAGATGCAAAGGCA-3′；3′UTR上游引物：5′-CTCTAGAGGAGGGGATCGGGTTTGGCC-3′，下游引物：5′-GGTTAACTTTTTTTTTTTTTTTGATCAA-3′(上、下游引物中，加粗部分分別代表引入的酶切位點的序列，5′UTR：Hind Ⅲ和Nco Ⅰ，3′UTR：Xba Ⅰ和Hpa Ⅰ)。以5′UTR、3′UTR序列片段構(gòu)建質(zhì)粒。為了更準確體現(xiàn)5′UTR和3′UTR序列的功能，我們模擬UTR在Tudor-SN基因中的位置，將5′UTR插入到Luc基因之前，3′UTR插入到Luc基因之后，相關(guān)模式圖見圖1。

圖1 Luciferase質(zhì)粒插入5′UTR和3′UTR片段的模式圖

1.3 基因組DNA提取及目的片段5′UTR和3′UTR擴增 用基因組DNA提取試劑盒提取HeLa細胞的DNA作為PCR擴增模板，采用25 μL體系，擴增參數(shù)為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min；33個循環(huán)，PCR循環(huán)完成后72 ℃再延伸5 min，4 ℃終止反應(yīng)。取 PCR產(chǎn)物10 μL行1%的瓊脂糖凝膠電泳，然后用DNA凝膠回收試劑盒回收純化PCR擴增產(chǎn)物。預(yù)測擴增的人Tudor-SN基因的5′UTR目的片段長度為226 bp，3′UTR目的片段的長度為560 bp。

1.4 線性pGL3-Control載體的獲取 用質(zhì)粒小提試劑盒提取pGL3-Control 質(zhì)粒DNA，分別用Hind Ⅲ和Nco Ⅰ、Xba Ⅰ和Hpa Ⅰ進行雙酶切，完整切下pGL3-Control 質(zhì)粒載體，瓊脂糖凝膠電泳。凝膠回收試劑盒回收得到約5 000 bp的線性pGL3-Control。1.5 重組質(zhì)粒pGL3-5′UTR和pGL3-3′UTR構(gòu)建、酶切鑒定及測序 需要構(gòu)建的重組質(zhì)粒pGL3-5′UTR是將5′UTR插入到pGL3-Control 質(zhì)粒載體的Luc基因之前，Hind Ⅲ和Nco Ⅰ酶切位點之間，pGL3-3′UTR是將3′UTR插入到pGL3-Control質(zhì)粒載體的Luc基因之后，Xba Ⅰ和Hpa Ⅰ酶切位點之間，所以我們用Hind Ⅲ和Nco Ⅰ、Xba Ⅰ和Hpa Ⅰ分別雙酶切pGL3-Control質(zhì)粒載體，其線性化后，切下目的條帶，用凝膠回收試劑盒回收純化酶切產(chǎn)物。將Tudor-SN的5′UTR、3′UTR目的片段與酶切的線性載體以3∶1的比例在T4 DNA連接酶的作用下室溫反應(yīng)60 min，取連接后的產(chǎn)物5 μL，加入到50 μL DH5α感受態(tài)細菌中彈勻，冰上靜置15 min，42 ℃熱激30 s，冰上冷激2 min，加入500 μL液體LB培基，37 ℃搖床孵育1.5 h，在含有氨芐霉素(25 μg/mL)的LB平板上涂布轉(zhuǎn)化后的菌液，待液體吸收后，倒置于37 ℃生化培養(yǎng)箱過夜。連接產(chǎn)物的平板上有菌落長出后，挑取3個單克隆菌落，分別接種于含氨芐霉素(25 μg/mL)的20 mL液體LB培養(yǎng)基中，37 ℃搖床過夜。第二天提取質(zhì)粒酶切鑒定，同時對菌液進行測序。

1.6 重組質(zhì)粒pGL3-5′UTR和pGL3-3′UTR熒光素酶活性鑒定

1.6.1 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將pGL3-5′UTR和pGL3-3′UTR分別與海腎熒光素酶表達質(zhì)粒(內(nèi)參)共轉(zhuǎn)入HeLa細胞中(以24孔板為例)。具體步驟：①HeLa細胞融合度為60%時轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前換成新鮮培基；②分別用25 μL無血清的opti-MEM培養(yǎng)液稀釋質(zhì)粒1 μg(內(nèi)參質(zhì)粒為250 ng)和轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine?2000 2 μL，輕彈混勻室溫靜置5 min；③將稀釋的質(zhì)粒和Lipofectamine?2000混勻，室溫靜置15 min；④ 混懸液緩慢均勻加入含500 μL培養(yǎng)基的細胞孔中，搖勻；⑤正常培養(yǎng)48 h后收集樣品，進行熒光素酶的活性檢測。

1.6.2 熒光素酶活性檢測 轉(zhuǎn)染48 h后，棄去培基，用冷的1×PBS洗3次，棄干凈；每孔加被動裂解液100 μL，室溫慢搖20 min；將裂解液轉(zhuǎn)移至離心管中，渦旋2次、每次10 s，10 000 r/min離心5 min，取上清至新的離心管中；取20 μL裂解液和100 μL LARII混勻，熒光發(fā)光計檢測螢火蟲熒光素酶的活性，然后向同一孔中加入等量的Stop & Glo?檢測海腎熒光素酶的活性，每個實驗做3個復(fù)孔。

2 結(jié)果

2.1 Tudor-SN的5′UTR和3′UTR PCR擴增結(jié)果 以HeLa細胞全基因組DNA為模板，用含酶切位點的引物進行PCR擴增，2%的瓊脂糖膠電泳結(jié)果顯示產(chǎn)物5′UTR(圖2A)、3′UTR(圖2B)在相應(yīng)的位置有明顯的條帶，說明擴增出的目的條帶與預(yù)期產(chǎn)物5′UTR 長度226 bp，3′UTR長度560 bp相符。

注：M為Trans2K DNA maker；1為5′UTR(226 bp)；2為3′UTR(560 bp)。

圖2 線性目的片段5′UTR和3′UTR的獲取

2.2 線性pGL3-Control載體的獲取結(jié)果 用Hind Ⅲ和Nco Ⅰ、Xba Ⅰ和Hpa Ⅰ分別雙酶切pGL3-Control質(zhì)粒載體后，1%的瓊脂糖凝膠電泳分析線性化質(zhì)粒載體，顯示條帶分別出現(xiàn)在約5 000 bp(圖3A、B)，回收純化該片段。

注：M為Trans2K Plus Ⅱ DNA maker；1為雙酶切前；2為雙酶切后。

圖3 線性pGL3-Control載體的獲取和鑒定

2.3 重組質(zhì)粒pGL3-5′UTR和pGL3-3′UTR的構(gòu)建、酶切鑒定及測序結(jié)果 在T4 DNA連接酶的作用下將純化的線性質(zhì)粒載體pGL3-Control和目的片段5′UTR、3′UTR分別進行連接，經(jīng)過轉(zhuǎn)化和擴增后再將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pGL3-5′UTR用Hind Ⅲ、Nco Ⅰ雙酶切，重組質(zhì)粒pGL3-3′UTR用Xba Ⅰ、Hpa Ⅰ雙酶切后鑒定。結(jié)果顯示，質(zhì)粒pGL3-5′UTR雙酶切后，在200 bp左右(目的片段)與5 kb左右(載體片段)各切出一條帶(圖4A)，pGL3-3′UTR雙酶切后，在500 bp左右(目的片段)與5 kb左右(載體片段)各切出一條帶(圖4B)，表明5′UTR、3′UTR已插入到pGL3-Control質(zhì)粒載體中。同時，依據(jù)堿基互補配對原則，用pGL3-Control的通用引物(5′-CTAGCAAATAGGCTGTCCC-3′和5′-CTTTATGTTTTTGGCG TCTTCCA-3′)以重組質(zhì)粒為模板，進行基因測序，測序結(jié)果證明目的片段成功插入到pGL3-Control載體中，說明螢火蟲熒光素酶報告基因重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

注：M為Trans2K Plus Ⅱ DNA Marker；1為雙酶切前；2為雙酶切后。

圖4 重組質(zhì)粒pGL3- 5′UTR 、pGL3-3′UTR 的雙酶切鑒定

2.4 熒光素酶活性測定結(jié)果 將pGL3-5′UTR、pGL3-3′UTR重組質(zhì)粒分別與內(nèi)參海腎熒光素酶質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入HeLa細胞中，轉(zhuǎn)染48 h后收樣品，檢測熒光素酶的相對活性分別為46.98±0.9和19.51±1.3。

3 討論

Tudor-SN多功能蛋白高度保守且廣泛存在于哺乳動物體內(nèi)，參與很多生物學調(diào)控。一方面Tudor-SN蛋白可作為STAT6、E2F-1、PPARγ等基因的轉(zhuǎn)錄共激活因子參與基因的表達調(diào)控[5,8,9]。另一方面，Tudor-SN蛋白作為RNP的組成成分，可通過對一些基因pre-mRNA的剪切加工來發(fā)揮其表達調(diào)控作用[10～12]。后來的研究也揭示Tudor-SN蛋白通過促進腫瘤的增殖、侵襲和遷移能力，參與很多腫瘤的發(fā)生，比如前列腺癌[12]、乳腺癌[13]、肝癌[14]、肺癌[15]等。關(guān)于Tudor-SN蛋白的功能研究很多，但Tudor-SN蛋白自身表達調(diào)控的研究卻不常見。Armengol等[16]課題組研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子NF-κB、Sp1和NF-Y可參與Tudor-SN基因轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控，而關(guān)于Tudor-SN蛋白翻譯水平的調(diào)控目前尚無相關(guān)報道。

真核生物中涉及分化和發(fā)育的基因主要受mRNA的選擇性翻譯而調(diào)控，參與這種調(diào)節(jié)的序列大多群集于轉(zhuǎn)錄本的UTR，包括5′UTR和3′UTR。mRNA的5′UTR在基因表達的多個方面都做出了貢獻，包括mRNA的加工、折疊，維持穩(wěn)定性，細胞內(nèi)的運輸和定位以及增強翻譯效率等。3′UTR的功能包括保護mRNA的穩(wěn)定性，保護5′帽結(jié)構(gòu)并控制mRNA的亞細胞定位。除了以上的正性調(diào)控以外，5′UTR和3′UTR對基因表達也存在負性調(diào)控，并且已知的許多與生長發(fā)育相關(guān)的基因都是通過UTR參與基因的翻譯抑制。其中5′UTR對基因表達的負調(diào)控主要包括以下方面：5′UTR的序列中存在自身堿基配對時，可形成發(fā)卡式或莖環(huán)式的二級結(jié)構(gòu)，當二級結(jié)構(gòu)自由能達到一定值時，會阻礙核糖體小亞基在mRNA上的遷移掃描，對翻譯起始具有阻止作用[17]；基因中5′UTR長度不同的轉(zhuǎn)錄本起始翻譯的能力不同；另外5′UTR區(qū)域含有uAUG和uORF，該結(jié)構(gòu)具有抑制翻譯的作用，主要通過以下幾種方式，如Ribosome掃描uORF合成短肽后過早的脫離mRNA、合成短肽后重新起始(re-initiation)ORF的翻譯、合成的短肽可能在延長或終止階段阻止翻譯的進行、uORF介導(dǎo)mRNA的降解等；除此之外，一些基因的5′UTR區(qū)含有RNA G-quadruplex motif結(jié)構(gòu)，這種特殊的二級結(jié)構(gòu)也能抑制翻譯[18]。3′UTR主要通過一系列調(diào)控元件來調(diào)控翻譯，如成熟miRNA可通過堿基互補配對的方式識別靶mRNA，并根據(jù)互補程度的不同指導(dǎo)沉默復(fù)合體降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻譯；3′UTR的一個顯著poly A尾的長度與翻譯效率密切相關(guān)，當<50 nt時，翻譯抑制；>200 nt時，高效翻譯；3′UTR區(qū)域含有多個AUUUA序列組成的ARE結(jié)構(gòu)，ARE與多種蛋白結(jié)合，一類蛋白結(jié)合了ARE后維持mRNA的穩(wěn)定性，促進翻譯，另一類蛋白可以介導(dǎo)mRNA的降解或抑制翻譯等。

基因的表達調(diào)控是一個復(fù)雜的過程，很多基因或蛋白在行使某些生物學功能時會受到不同程度的調(diào)控。目前，報告基因系統(tǒng)被廣泛用于真核細胞表達調(diào)控的研究。利用報告基因系統(tǒng)研究表達調(diào)控可避免下游表達產(chǎn)物的干擾，能比較真實地反映調(diào)控序列的作用。本研究采用的pGL3-Control熒光素酶報告基因質(zhì)粒特定的優(yōu)點是其本身帶有啟動子序列能夠自身啟動轉(zhuǎn)錄表達，含有增強子序列可在多種哺乳動物中增強基因的表達，能研究某些特定片段在基因表達中的作用。

本研究成功構(gòu)建了Tudor-SN的5′UTR、3′UTR熒光素酶報告基因質(zhì)粒，為尋找Tudor-SN基因UTR區(qū)調(diào)控Tudor-SN蛋白的表達機制提供了依據(jù)。

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Construction of human Tudor-SN UTR luciferase reporter gene expression plasmid and its activity detection

ZHAOYali,SUChao,GANShihu,RENYuanyuan,GAOXingjie,YANGJie,HEJinyan

(TianjinMedicalUniversity,Tianjin300070,China)

Objective To lay a foundation for further study on the mechanism of Tudor-SN protein in translation. Methods The human Tudor-SN UTR fragments were amplified by PCR from genomic DNA extracted from HeLa cells, and then were inserted into pGL3-Control expression vector. HeLa cells were co-transfected with the renilla luciferase plasmid and recombinant pGL3-5′UTR plasmid or pGL3-3′UTR plasmid. After 48 hours, luciferase activity was detected. Results Both double enzyme digestion and gene sequencing confirmed the construction of recombinant plasmid was successful. The luciferase activity was detected after transfection, and the luciferase activity of pGL3-5′UTR plasmid was the best. Conclusion The recombinant plasmids of pGL3-5′UTR-luciferase and pGL3-3′UTR-luciferase are successfully constructed, which lays a foundation for further study of regulatory mechanisms of Tudor-SN genetic UTR in translation.

human Tudor-SN protein; 5′UTR; 3′UTR; recombinant plasmid; luciferase

國家杰出青年基金資助項目(31125012)；教育部“創(chuàng)新團隊發(fā)展計劃”(IRT13085)；國家自然科學基金資助項目(31170830/31370749/31571380)；天津市應(yīng)用基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計劃(青年基金項目)(15JCQNJC09900)；天津醫(yī)科大學青年基金項目(2015KYZQ03)。

趙亞麗(1990-)，女，碩士研究生，研究方向為細胞生物學。E-mail： zhaoyalismile@126.com

何津巖(1972-)，女，碩士生導(dǎo)師，副教授，研究方向為細胞分子通路。E-mail： hejinyan@tijmu.edu.cn

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.04.006

Q591.2,Q784

A

1002-266X(2017)04-0001-04

2016-09-01)