歐紅萍，楊海涵，楊 敏，陳 淼

（1.成都農(nóng)業(yè)科技職業(yè)學院，四川 溫江 611130；2.四川乾坤生物技術研究中心，四川 溫江 611130）

人工誘導家兔實驗性乳房炎模型的建立

歐紅萍1，楊海涵2，楊 敏1，陳 淼1

（1.成都農(nóng)業(yè)科技職業(yè)學院，四川 溫江 611130；2.四川乾坤生物技術研究中心，四川 溫江 611130）

將48只分娩后7d的健康新西蘭泌乳家兔隨機分成空白對照組 （T1組）、金黃色葡萄球菌組（T2組）和大腸桿菌組（T3組），分別按每個乳腺0.5mL量向家兔乳頭管內(nèi)灌注無菌肉湯、金黃色葡萄球菌菌液和大腸桿菌菌液，并于灌注前2h和灌注后6h、12h、24h、48h、72h、5d、7d，采集家兔耳緣靜脈血和乳腺組織，測定全血中WBC、LYM和GRA總數(shù)以及血清中CRP含量。結(jié)果顯示：家兔血液中WBC、LYM和GRA總數(shù)出現(xiàn)了相應的變化，T2組和T3組血清中的CRP含量有相應程度的升高，表明機體出現(xiàn)炎癥反應。

家兔乳房炎模型；急性期蛋白；鈣粒結(jié)合蛋白-C

乳房炎是奶牛業(yè)生產(chǎn)中危害最大的疾病之一。目前，通過動物模型進行乳房炎的研究是解決細菌性奶牛乳房炎發(fā)病的重要手段。利用奶牛、奶山羊和大鼠等動物建立乳房炎模型有一定的局限性，家兔和奶牛同屬于哺乳動物，應用泌乳家兔建立奶牛乳房炎模型，可能會以較低的成本獲得更多的試驗材料。因此，本研究通過在家兔乳頭管灌注金黃色葡萄球菌和大腸桿菌，觀察灌注后家兔的臨床病理變化，以確定是否能建立家兔乳房炎模型。

1 試驗材料

1.1 試驗動物 初產(chǎn)，健康，體重3.5kg左右，懷孕15d左右的新西蘭母兔48只（購于四川省名山縣某大型兔場），常規(guī)飼養(yǎng)。

1.2 主要儀器和試劑 Abacus junior血球分析儀（奧巴克斯公司，奧地利）；全自動生化分析儀（AMS公司，意大利）；C-反應蛋白測定試劑盒（邁克生物有限公司）。

2 試驗方法

2.1 菌液配制及灌注方法 金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均從患病奶牛乳汁中分離純化，然后配成菌液，甘油冷凍保存，使用前解凍進行細菌計數(shù)，細菌濃度為3×105CFU/mL。將48只母兔隨機分成3組，每組16只，分別為空白對照組（T1組）、金黃色葡萄球菌組（T2組）和大腸桿菌組（T3組），大腸桿菌組和金黃色葡萄球菌組分別注入0.5mL計數(shù)過的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌菌液，空白對照組注入滅菌肉湯[1]。

母兔分娩后自然哺乳，7d后接種菌液。接種方法：先將母兔保定，用75%酒精對第三對乳腺區(qū)域消毒，然后用1mL注射器輕輕刺破皮膚沿乳頭管插入，注入0.5mL含菌數(shù)為1.5×105CFU的菌液。

2.2 血樣采集 采血的時間點為灌注菌液前2h，灌注后6h、12h、24h、48h、72h、5d、7d，采集母兔耳緣靜脈血，將全血分兩份，一份全血用EDTA抗凝劑抗凝，用于血常規(guī)測定；一份于3000r/min離心15min分離血清，-20℃保存，用于血清CRP測定。

2.3 測定指標及方法

2.3.1 WBC、LYM、GRA數(shù)量測定 采用Abacus junior血球分析儀測定全血白細胞（WBC）、淋巴細胞（LYM）及中性粒細胞（GRA）總數(shù)[2]。

2.3.2 C反應蛋白（CRP）含量測定 按C反應蛋白測定試劑盒說明操作，以標準品220、64.8、20.7、6.1、0.0mg/L為橫坐標，OD值為縱坐標，在坐標紙上畫出標準曲線，并求出回歸方程，從而計算出樣品中的CRP含量[3]。

2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 應用Excel（2003）軟件整理數(shù)據(jù)，用Spss13.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行一維方差分析和t檢驗。所有數(shù)據(jù)均用平均數(shù)±標準差（±SD）表示。

3 結(jié)果與分析

3.1 生理指標時相的變化 母兔血液白細胞（WBC）總數(shù)的動態(tài)變化：白細胞總數(shù)在接種金黃色葡萄球菌后開始緩慢下降，48h時開始顯著下降（P＜0.05）；在接種大腸桿菌后6h時開始顯著下降（P＜0.05），之后緩慢回升，72h時恢復到接種前水平；空白對照組變化不明顯。金黃色葡萄球菌組與空白對照組在48h、5 d和7 d時差異顯著（P＜0.05），與大腸桿菌在6 h、12 h、5d和7 d時差異顯著（P＜0.05），大腸桿菌組與空白對照組在6～48h差異顯著（P＜0.05）。血液淋巴細胞總數(shù)的變化：淋巴細胞在接種金黃色葡萄球菌后顯著下降（P＜0.05），6h時下降到最低點，之后緩慢回升，72h時恢復到接種前水平，之后又顯著升高（P＜0.05）；在接種大腸桿菌后顯著下降（P＜0.05），之后緩慢回升，24h時恢復到接種前水平，之后又緩慢下降，5～7d時顯著下降（P＜0.05）；空白對照組變化不明顯。金黃色葡萄球菌組與大腸桿菌組在12～48h、5d和7d時差異顯著（P＜0.05），與對照組在6～24h、5d和7d時差異顯著（P＜0.05），大腸桿菌組與對照組在6 h、24 h、5d和7d時差異顯著（P＜0.05）。血液中性粒細胞總數(shù)的變化：中性粒細胞數(shù)在接種金黃色葡萄球菌后開始緩慢升高，24 h時升高較接種前顯著（P＜0.05），之后緩慢下降，72h后顯著下降（P＜0.05）；在接種大腸桿菌后6h時開始顯著下降（P＜0.05），24h時下降到最低點，之后恢復到接種前水平；空白對照組變化不明顯。金黃色葡萄球菌組與空白對照組在48h時差異顯著（P＜0.05），與大腸桿菌在6～24h、5d和7d時差異顯著（P＜0.05），大腸桿菌組與空白對照組在6～48h差異顯著（P＜0.05）。

以上血液中炎性細胞的動態(tài)變化反映了家兔乳房炎癥的發(fā)展過程（表1）。

3.2 血清中CRP含量的動態(tài)變化 血清中CRP含量在接種金黃色葡萄球菌后開始慢慢上升，24 h和48h時升高較顯著（P＜0.05），之后緩慢下降到接種前水平；在接種大腸桿菌后48h時顯著升高（P＜0.05），之后緩慢下降到接種前水平；空白對照組在接種無菌肉湯后持續(xù)升高，72h時開始顯著升高（P＜0.05）。金黃色葡萄球菌組與空白對照組在24～48h和5～7d時差異顯著（P＜0.05），與大腸桿菌組差異不顯著（P＞0.05），大腸桿菌組與空白對照組在24～48h和5～7d時差異顯著（P＜0.05）（表2）。

表1 灌注金黃色葡萄球菌和大腸桿菌前后家兔血液中WBC、LYM和GRA總數(shù)的動態(tài)變化

表2 灌注金黃色葡萄球菌和大腸桿菌前后家兔血清中CRP含量的動態(tài)變化

4 討論

乳房炎常發(fā)生于奶牛[4]或奶山羊，研究乳房炎的發(fā)病機理、篩選敏感的奶牛乳房炎防治藥物等，都需要一種典型、廉價、易于建立的乳房炎動物模型。本試驗通過血液中炎性細胞計數(shù)來反映炎癥的發(fā)展進度，通過CRP含量測定來顯示機體炎癥的發(fā)生情況，根據(jù)這些指標和家兔臨床表現(xiàn)的結(jié)合，可推導出1.5×105CFU/0.5mL金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均可引起家兔乳房炎癥。

在絕大多數(shù)情況下白細胞的增多或減少，主要受中性粒細胞和淋巴細胞的影響，在急性感染，特別是化膿性球菌（如金黃色葡萄球菌、溶血性鏈球菌）感染時，白細胞、中性粒細胞數(shù)增多[5]。金黃色葡萄球菌組白細胞的減少是淋巴細胞參與體液免疫消耗減少所致，在革蘭氏陰性細菌感染時，白細胞總數(shù)和中性粒細胞數(shù)減少[6]，這和大腸桿菌組的結(jié)果一致。

CRP不具有特異性，但卻是在急性時相反應中變化較敏感的急性時相蛋白質(zhì)[7]。對于已感染金黃色葡萄球菌乳房炎的奶牛，在感染期間CRP含量會增高，并與畜群的健康狀況有一定的相關性。本試驗通過測定血清中CRP含量變化來分析家兔乳房炎炎癥的發(fā)展程度，結(jié)果表明，在機體出現(xiàn)炎癥時，血清中CRP含量相應升高，但T1組72h時顯著升高（P＜0.05），升高幅度是T2和T3組的2～6倍，這與已有報道不符[8]?？赡芘c測定方法有關，也可能與試驗材料選取有關，因為活菌和單一毒素存在很大差別，因而造成機體內(nèi)蛋白反應不同。本試驗同時證明了血清CRP含量受很多因素的影響。

5 結(jié)論

通過乳頭管灌注1.5×105CFU/0.5 mL金黃色葡萄球菌和大腸桿菌誘導家兔乳房炎模型建立成功，且主要是局部乳房炎癥。

[1]鐘凱，王艷玲，鄒思湘，等.乳頭管灌注內(nèi)毒素誘發(fā)大鼠實驗性乳房炎模型的建立[J].農(nóng)業(yè)生物技術學報，2005，13（5）：654-658.

[2]苗晉鋒，馬海田，鄒思湘，等.內(nèi)毒素對山羊乳腺組織中與乳腺炎相關的酶和細胞因子的影響[J].福建農(nóng)林大學學報（自然科學版），2007，36（6）：608-613.

[3]劉滌潔，馮淇輝，陳杖榴.恩諾沙星在健康及實驗性感染乳房炎奶山羊間的比較藥動學[J].中國農(nóng)業(yè)科學，2003，36（9）：1100-1104.

[4]楊德英.奶牛乳房炎對乳酶活性、急性期蛋白含量的影響及其作為隱性乳房炎診斷指標的研究[D].雅安：四川農(nóng)業(yè)大學，2009：39-46.

[5]楊永新，趙興緒，張勇，等.臨床型乳房炎與正常奶牛血漿的差異蛋白質(zhì)組研究[J].中國農(nóng)業(yè)科學，2008，41（7）：2162-2167.

[6]楊永新，張勇，周雷，等.奶牛乳房炎乳腺膜蛋白的比較蛋白質(zhì)學研究[J].中國農(nóng)業(yè)科學，2010，43（18）：3 862-3868.

[7] Leung W，Chan C P，Rainer T H，et al.Infect Check CRP barcode-style lateral flow assay for semi-quantitative detection of C-reactive protein in distinguishing between bacterial and viral infections [J].JournalofImmunologicalMethods，2008，336（1）：30-36.

[8] Donaszi I A，Scharek P，F(xiàn)alus A，et al.Hepatic acute-phasereaction in histamine-deficient gene targeted mice[J].Inflammopharmacology，2004，12（1）：47-55.

S858.291.26

：B

：1001-8964（2017）01-0028-03

2016-11-28

歐紅萍（1980-），男，重慶墊江人，研究生，講師，主要從事草食動物的疾病防治及繁殖障礙研究。