詹 瓊，周鑫莉，黃若凡，林 浩，葛蒙晰，梁曉華（復旦大學附屬華山醫(yī)院腫瘤科，上海 200040）

·臨床藥學與研究·

β-欖香烯血藥濃度測定方法的建立及其藥動學研究Δ

詹 瓊＊，周鑫莉，黃若凡，林 浩，葛蒙晰，梁曉華#（復旦大學附屬華山醫(yī)院腫瘤科，上海 200040）

目的：建立測定人血漿中β-欖香烯濃度的方法，并用于藥動學研究。方法：血漿樣品經(jīng)液-液萃取后，以萘為內標，采用氣質聯(lián)用法測定。色譜柱為Rxi-5ms毛細管柱，柱溫為150℃，載氣為氦氣，流速為1.0 mL/min，分流比為0.5∶1，程序升溫，進樣量為1 μL；采用電子轟擊離子源，以單離子監(jiān)測方式進行正離子掃描，選擇監(jiān)測的離子為m/z 93（β-欖香烯）和m/z 128（內標）。選擇8例腫瘤患者，單次給予欖香烯注射液10 mg/kg后，采用該法測定給藥前后β-欖香烯的血藥濃度，采用WinNonlin 6.0軟件計算其藥動學參數(shù)。結果：β-欖香烯血藥濃度在0.163 8～40 μg/mL范圍內線性關系良好（r＝0.999 8，n＝5），定量下限為0.163 8 μg/mL；日內、日間RSD＜10%；平均加樣回收率為92.82%～97.75%，平均提取回收率為91.30%～93.31%。8例惡性腫瘤患者單次靜脈滴注欖香烯注射液10 mg/kg后，其平均藥-時曲線符合權重系數(shù)為1/c2的二室模型，cmax為（1.47±0.59）μg/mL，tmax為（2.43±0.78）h，AUC0-12h為（3.52±0.69）μg·h/mL，分布相半衰期為（0.36±0.04）h，消除相半衰期為（1.43±0.80）h，消除速率常數(shù)為（0.39±0.06）L－1，轉運速率常數(shù)（k12、k21）分別為（3.21±0.72）和（1.43±0.21）L－1。結論：該方法樣品前處理簡單，且準確度高、專屬性強，適用于β-欖香烯血藥濃度的測定及人體藥動學的研究。β-欖香烯在人體內吸收快、消除快。

β-欖香烯；氣質聯(lián)用法；血藥濃度；藥動學

β-欖香烯（β-Elemene）屬于萜烯類化合物，可從姜科植物溫郁金（Curcuma wenyujin Y.H.Chen et C.Ling）中提取得到[1]。欖香烯注射液是由我國自主研發(fā)的抗癌新藥，以β-欖香烯為主要成分[2-5]。該藥為非細胞毒性抗腫瘤藥，可抑制腫瘤細胞核酸合成或誘導腫瘤細胞凋亡、分化，從而有效抑制多種腫瘤細胞的生長增殖[6-9]。但目前關于β-欖香烯人體藥動學的報道較少。為了解其在人體內的藥動學特征，為臨床合理用藥提供理論依據(jù)，筆者采用氣質聯(lián)用（Gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法測定人血漿中β-欖香烯的濃度，并用于藥動學研究，現(xiàn)報道如下。

1 材料

1.1 儀器

GC-MS-QP2010型單四極桿氣質聯(lián)用儀，配有AOC-20i自動進樣器、電子轟擊離子源（Electron ionization，EI）和Compound Composer數(shù)據(jù)庫軟件（日本Shimadzu公司）；AB135-S型十萬分之一天平（瑞士Mettler Toledo公司）；XW-80A型渦旋混合器（上海滬西分析儀器廠）；TGL16M型冷凍離心機（長沙英泰儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

β-欖香烯對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100268-201402，純度：99.4%）；萘對照品（內標，國藥集團化學試劑有限公司，批號：40035562，純度：≥99.5%）；欖香烯注射液（大連華立金港藥業(yè)有限公司，批準文號：國藥準字H10960114，批號：1210301，規(guī)格：20 mL∶0.1 g）；氯化鈉注射液（江蘇通用藥業(yè)有限公司，批準文號：國藥準字H20043842，批號：10130916，規(guī)格：500 mL∶4.5 g）；正乙烷為色譜純，其余試劑均為分析純。空白血漿由復旦大學附屬華山醫(yī)院健康志愿者提供。

2 方法與結果

2.1 色譜與MS條件

色譜柱：Rxi-5ms毛細管柱（30.0 m×0.25 mm，0.25 μm）；進樣口溫度：200℃；接口溫度：150℃；柱溫：150℃；載氣：高純度氦氣（＞99%）；流速：1.0 mL/min；分流比：0.5∶1；程序升溫（初始150℃，保持3 min；以40℃/min的速度升溫至220℃，保持1 min）；進樣量：1 μL。

采用EI，以單離子監(jiān)測（Single ion monitoring，SIM）模式掃描，正離子方式檢測。電子轟擊能量：70 eV；離子源溫度：200℃；四極桿溫度：100℃；檢測器電壓：調諧電壓；掃描范圍：m/z 50～300，選擇監(jiān)測的離子為m/z 93（β-欖香烯）和m/z 128（內標）。

2.2 溶液的制備

精密稱取β-欖香烯對照品20 mg，置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容，搖勻，得質量濃度為2.0 mg/mL的β-欖香烯對照品貯備液，置于－40℃冰箱中保存，備用。

精密稱取內標對照品20 mg，置于10 mL量瓶中，用正己烷溶解并定容，搖勻，得質量濃度為2.0 mg/mL的內標貯備液，置于－40℃冰箱中保存。臨用前用正己烷稀釋，得質量濃度為20 μg/mL的內標溶液，備用。

2.3 血漿樣品的處理

取空白血漿適量，加入內標溶液（20 μg/mL）50 μL，渦旋混勻30 s，常溫下加入飽和氯化鈉溶液（濃度為6 mol/L）2滴，靜置15 min，加入萃取劑（正己烷）500 μL，渦旋振蕩10 min，4℃下高速離心（4 000×g）10 min，取上清液200 μL至加有內襯管的進樣瓶中，待測。

2.4 方法學考察

2.4.1 專屬性考察 在“2.1”項色譜與質譜條件下，β-欖香烯和內標的保留時間分別約為4.4和2.6 min，兩者分離良好，內源性物質無干擾。典型色譜圖見圖1。

圖1 典型色譜圖Fig 1 Typical chromatograms

2.4.2 標準曲線的繪制和定量下限的考察 取β-欖香烯對照品貯備液適量，用正己烷稀釋，得質量濃度分別為200、80、32、12.8、5.12、2.048、0.819 2 μg/mL的系列標準工作液；分別精密吸取上述標準工作液各50 μL，置于2 mL聚乙烯管中，精密加入空白血漿200 μL，渦旋混勻30 s，得相當于β-欖香烯質量濃度分別為40、16、6.4、2.56、1.024、0.409 6、0.163 8 μg/mL的系列標準血漿樣品，按“2.3”項下方法處理后，進樣分析，記錄色譜圖。以待測物質量濃度（x）為橫坐標、待測物與內標的峰面積比值（y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程為y＝0.030 778x+0.000 432（r＝0.999 8，n＝5）。結果顯示，β-欖香烯血藥濃度在0.163 8～40 μg/mL范圍內線性關系良好，定量下限為0.163 8 μg/mL（RSD＜20%）。

2.4.3 精密度試驗 分別配制β-欖香烯低、中、高質量濃度（0.409 6、2.56、32 μg/mL）的血漿樣品，按“2.3”項下方法處理后，進樣分析。各質量濃度血漿樣品平行測定5次，連續(xù)測定5 d，根據(jù)當日標準曲線計算各樣品中β-欖香烯的實測質量濃度，考察方法的精密度。結果顯示，日內、日間RSD＜10%，表明該方法精密度良好。精密度試驗結果見表1。

表1 精密度試驗結果（，n＝5）Tab 1 Results of precision test（，n＝5）

表1 精密度試驗結果（，n＝5）Tab 1 Results of precision test（，n＝5）

理論質量濃度，μg/mL 0.409 6 2.56 32日內精密度實測質量濃度，μg/mL 0.405±0.005 2.532±0.064 31.802±1.725 RSD，% 1.29 2.54 5.42日間精密度實測質量濃度，μg/mL 0.413±0.016 2.447±0.081 30.409±1.374 RSD，% 3.87 3.31 4.52

2.4.4 加樣回收率試驗 分別配制β-欖香烯低、中、高質量濃度（0.409 6、2.56、32 μg/mL）的血漿樣品各3份，分別精密加入相應質量濃度的對照品溶液，搖勻，按“2.3”項下方法處理后，得血漿樣品9份，進樣分析，根據(jù)當日標準曲線計算加樣回收率及RSD值。結果顯示，平均回收率為92.82%～97.75%，RSD＜5%。加樣回收率試驗結果見表2。

表2 加樣回收率試驗結果（n＝3）Tab 2 Results of sample recovery tests（n＝3）

2.4.5 提取回收率試驗 分別配制β-欖香烯低、中、高質量濃度（0.409 6、2.56、32 μg/mL）的血漿樣品，按“2.3”項下方法處理后，進樣分析，得β-欖香烯色譜峰面積（A1）和內標色譜峰面積（A2）。取對照品貯備液和內標溶液各適量，配制成與前者質量濃度相對應的β-欖香烯標準溶液，進樣分析，得β-欖香烯色譜峰面積（B1）和內標色譜峰面積（B2）。β-欖香烯的提取回收率＝A1/B1×100%，內標的提取回收率＝A2/B2×100%。結果顯示，各質量濃度血漿樣品β-欖香烯的平均提取回收率分別為93.31%、91.30%和92.65%，RSD分別為3.42%、2.85%和2.97%（n＝5）；內標的平均提取回收率分別為90.53%、91.26%和92.71%，RSD分別為2.66%、2.74%和3.81%（n＝5），符合生物樣品定量分析方法指導原則的有關規(guī)定[10]。

2.4.6 穩(wěn)定性試驗 分別配制β-欖香烯低、中、高質量濃度（0.409 6、2.56、32 μg/mL）的血漿樣品，按“2.3”項下方法處理后，室溫放置，分別于配制后0、2、4、6、8、12 h精密吸取1 μL，進樣分析。結果顯示，各質量濃度血漿樣品在12 h內穩(wěn)定性良好，β-欖香烯的RSD分別為4.56%、3.95%和2.63%（n＝6）。

2.5 藥動學研究

本研究為單中心、開放性的β-欖香烯藥動學臨床研究（臨床研究注冊號：NCT01679847），研究方案經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審查批準（審查號：2010-180），所有受試者均知情同意并簽署知情同意書。

2.5.1 納入與排除標準 納入標準：經(jīng)細胞學或組織病理檢查確診的腫瘤患者；預計生存期＞3個月；試驗前1個月未使用過欖香烯注射液治療；血常規(guī)、肝腎功能、心電圖均正常。排除嚴重心功能不全、肝腎功能障礙、神志不清、患有精神疾病、不能完成研究、近3個月內參加過其他臨床試驗的患者。本研究共納入2015年2－8月我院腫瘤科惡性腫瘤患者8例，年齡43～60歲，平均年齡（51.6±7.3）歲。其中，男性6例、女性2例，卡氏（KPS）評分均＞80分?；颊叩囊话闱闆r見表3。

表3 患者的一般情況Tab 3 General condition of subjects

2.5.2 試驗方案 所有患者于受試前1天清淡飲食后，禁食10 h，不禁水。予次日上午單次給予欖香烯注射液10 mg/kg（用氯化鈉注射液稀釋至500 mL），ivgtt，用輸液泵控制滴速，3 h內勻速滴注完畢。試驗期間避免劇烈運動，禁服茶、咖啡及其他含咖啡和醇類飲料。所有受試者均于前臂屈側埋置肝素化套管針，分別于給藥前及開始滴注后0.25、0.5、1、1.5、2、3、3.5、4、6、8、12 h靜脈采血3 mL，經(jīng)乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝后，以400×g離心10 min。取上清液于－80℃下保存。血漿樣品按“2.3”項下方法處理后，進樣分析，測定β-欖香烯的血藥濃度，繪制平均藥-時曲線（見圖3）。采用WinNonlin 6.0藥動學軟件進行房室模型擬合處理。結果顯示，β-欖香烯的平均藥-時曲線符合權重系數(shù)為1/c2的二室模型，其主要藥動學參數(shù)見表4。

圖3 β-欖香烯的平均藥-時曲線（n＝8）Fig 3 Average plasma concentration-time curve of β-elemene（n＝8）

表4 主要藥動學參數(shù)（s，n＝8）Tab 4 Main pharmacokinetic parameters（s，n＝8）

表4 主要藥動學參數(shù)（s，n＝8）Tab 4 Main pharmacokinetic parameters（s，n＝8）

藥動學參數(shù)AUC0-12h，μg·h/mL AUC0-∞，μg·h/mL cmax，μg/mL tmax，h分布相速率常數(shù)（α），L/min消除相速率常數(shù)（β），L/min清除率（CL），mL/h結果3.52±0.69 4.74±1.34 1.47±0.59 2.43±0.78 1.62±0.34 0.47±0.03 2.29±0.77藥動學參數(shù)分布相半衰期（t1/2α），h消除相半衰期（t1/2β），h滴注速率（k0），L/h消除速率常數(shù)（k10），L-1轉運速率常數(shù)（k12），L-1轉運速率常數(shù)（k21），L-1表觀分布容積（Vd），L/kg結果0.36±0.04 1.43±0.80 0.89±0.17 0.39±0.06 3.21±0.72 1.43±0.21 7.71±2.80

3 討論

惡性腫瘤通常稱為癌癥，是嚴重威脅人類健康的慢性疾病之一。目前，治療惡性腫瘤的方法主要有外科手術治療、藥物治療以及放射治療。藥物治療在腫瘤的綜合治療中具有極為重要的作用。隨著腫瘤醫(yī)學的不斷發(fā)展，臨床應用的抗腫瘤藥物也逐漸增多，特別是以天然抗癌活性成分為先導化合物的抗癌藥物的研發(fā)已有了較大的成果。欖香烯注射液由我國自主研發(fā)，主要成分為β-欖香烯，是從植物溫郁金中提取的天然抗癌活性成分，已廣泛應用于胸腹腔積液、肺癌、胃癌、骨轉移癌、胰腺癌等多種實體瘤的綜合治療[11-13]。研究表明，β-欖香烯能增強腫瘤細胞的免疫原性，抑制腫瘤轉移，改善和提高荷瘤機體的細胞免疫功能，具有高效、安全、副作用小和不易耐受等優(yōu)點[11-12]。

欖香烯屬于半萜類化合物，只可溶于有機溶劑，而血漿中含有多種有機酸類等物質，可能對β-欖香烯的測定產(chǎn)生干擾。本研究采用液-液萃取法，考察了乙醚、異丙醇、正己烷、氯仿等有機溶劑對血漿樣品中β-欖香烯和內標的萃取效果。結果顯示，乙醚易揮發(fā)，可致結果產(chǎn)生偏差；異丙醇處理后，內源性物質的干擾較大；氯仿則易產(chǎn)生乳化。故最終選擇正乙烷為提取和稀釋溶劑。試驗結果顯示，正己烷對β-欖香烯和內標的提取回收率較高，且萃取液中幾乎不含可影響測定的內源性干擾物。

GC-MS是分析化學中最成熟的一類聯(lián)用技術。該方法既具有GC法的高分離性能，又具有MS法準確鑒定化合物結構的特點，二者聯(lián)用，取長補短，可達到同時定性、定量檢測的目的。本研究所建立的GC-MS法樣品前處理簡單，日內、日間RSD＜10%，β-欖香烯的平均加樣回收率和提取回收率均＞90%，方法的準確度高、專屬性強，可適用于臨床血液樣品中β-欖香烯濃度的測定。

在藥動學研究中，為提高參數(shù)計算的準確性，取樣點的設計應兼顧到吸收、分布和消除相。經(jīng)過大量血漿樣品的分析試驗，將采血時間確定為給藥前及開始滴注后的0.25、0.5、1、1.5、2、3、3.5、4、6、8、12 h，不僅兼顧了吸收、分布和消除相，又在達峰時間附近設置了較為密集的采血點，得到了較為完整的試驗數(shù)據(jù)。本研究根據(jù)欖香烯注射液藥品說明書，將給藥劑量設定為10 mg/kg，采用前文建立的GC-MS法測定單次靜脈滴注欖香烯注射液后腫瘤患者體內β-欖香烯的血藥濃度，采用WinNonlin 6.0藥動學軟件處理數(shù)據(jù)，考察其藥動學特征。結果顯示，β-欖香烯的平均藥-時曲線符合權重系數(shù)為1/c2的二室模型，cmax為（1.47±0.59）μg/mL，tmax為（2.43±0.78）h，t1/2α為（0.36±0.04）h，t1/2β為（1.43±0.80）h，提示補液結束后血藥濃度迅速下降，表明β-欖香烯在人體內吸收快、消除快。體外研究顯示，1 μg/mL為β-欖香烯的最低有效血藥濃度[14]，故盡可能延長欖香烯注射液靜脈給藥時間或持續(xù)給藥，可能有助于延長β-欖香烯的作用時間，提高其臨床抗腫瘤療效。

本研究首次進行了欖香烯注射液的人體藥動學研究，由于僅檢測了單次、單劑量靜脈滴注欖香烯注射液后人體內β-欖香烯的血藥濃度，藥動學數(shù)據(jù)較為局限。為進一步驗證其結果的準確性，本研究將在后續(xù)試驗中進一步考察多次、多劑量給藥后β-欖香烯的體內藥動學特征，并加大樣本量，為臨床應用欖香烯注射液、提高抗腫瘤療效提供更準確的依據(jù)。

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Establishment of Determination Method for Plasma Concentration of β-Elemene and Its Pharmacokinetic Study in Human

ZHAN Qiong，ZHOU Xinli，HUANG Ruofan，LIN Hao，GE Mengxi，LIANG Xiaohua（Dept.of Oncology，Huashan Affiliated Hospital of Fudan University，Shanghai 200040，China）

OBJECTIVE：To establish a method for the concentration determination of β-elemene in human plasma，and to study its pharmacokinetics.METHODS：After liquid-liquid extraction，using naphtalin as internal standard，plasma sample was determined by GC-MS.The determination was performed on Rxi-5ms capillary column with column temperature of 150℃.The carrier gas was helium at flow rate of 1.0 mL/min with split ratio of 0.5∶1 by temperature programming，and sample size was 1 μL.EI and single ion monitoring pattern were used for positive ion scanning with m/z 93（β-elemene）and m/z 128（internal standard）.8 tumor patients were selected，and were given Elemene injection 10 mg/kg.Plasma concentration of β-elemene were determined before and after medication.The pharmacokinetic parameters were calculated by WinNonlin 6.3 software.RESULTS：The linear range of β-elemene were 0.163 8-40 μg/mL（r＝0.999 8，n＝5）with quantification limit of 0.163 8 μg/mL；RSDs of intra-day and inter-day were lower than 10%；average sample recoveries ranged 92.82%-97.75%；average extraction recoveries ranged 91.30%-93.31%.After 8 malignant tumor patients were given single intravenous dripping of Elemene injection 10 mg/kg，mean plasma concentration-time curves were in line with two-compartment model with weight coefficient of 1/c2.Pharmacokinetic parameters were as follows：cmaxwas（1.47±0.59）μg/mL，tmaxwas（2.43±0.78）h，AUC0-12hwas（3.52±0.69）μg·h/mL，distribution phase half-life was（0.36±0.04）h，and clearance phase half-life was（1.43±0.80）h，elimination rate constant was（0.39±0.06）h－1，and transport rate constant(k12，k21)were（3.21±0.72）and（1.43±0.21）h－1.CONCLUSIONS：The sample preparation method is simple，and the determination method is accurate and specific，and is suitable for plasma concentration and pharmacokinetic study of β-elemene.β-elemene is absorbed and eliminated fast in human.

β-elemene；GC-MS；Plasma concentration；Pharmacokinetics

R969.1

A

1001-0408（2017）02-0173-05

2016-05-16

2016-11-16）

（編輯：張元媛）

國家自然科學基金資助項目（No.81302010、81101551）；上海市科學技術委員會自然科學基金資助項目（No.13ZR1405000、16ZR1404300）

＊主治醫(yī)師，碩士。研究方向：惡性腫瘤的綜合治療。電話：021-66895120。E-mail：mdf7534@163.com

#通信作者：主任醫(yī)師，博士。研究方向：惡性腫瘤的綜合治療。電話：021-66895120。E-mail：Xhliang66@sina.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.02.08