刁 碩,王紅旗,吳梟雄,趙一村 (北京師范大學水科學研究院,北京 100875)

基于響應面法優(yōu)化一株低溫耐鹽芘降解菌共代謝條件的研究

刁 碩,王紅旗*,吳梟雄,趙一村 (北京師范大學水科學研究院,北京 100875)

為了提高低溫耐鹽芘降解菌DYC-1的共代謝降解率,在已獲悉菌株降解最優(yōu)pH值、初始濃度、搖床轉(zhuǎn)速和接菌量的情況下,利用Plackett-Burman實驗設計篩選出影響菌株DYC-1降解PAHs芘的3個外加碳源顯著影響因子為葡萄糖、水楊酸和菲,用最陡爬坡實驗逼近3個因子的最大響應區(qū)域,采用Box-Behnken實驗設計及響應面法分析,確定其最優(yōu)共代謝條件為:葡萄糖225.83mg/L,水楊酸112.10mg/L,菲198.06mg/L;在此條件下培養(yǎng)10d,芘降解率可達到50.69%,相對于不加共代謝底物時提升了23.14%.表明響應面法對菌株共代謝條件的優(yōu)化合理可行.

響應面法；共代謝；優(yōu)化；降解菌

多環(huán)芳烴(PAHs)是一類普遍存在于環(huán)境中的具毒有機污染物[1],在土壤中具有較高的穩(wěn)定性,生物可降解性隨著苯環(huán)數(shù)和苯環(huán)密集程度增加而降低,尤其四環(huán)以上的高分子量 PAHs,通常以共代謝的方式降解[2-3].芘作為典型的穩(wěn)定性PAHs,對其共代謝條件的研究勢在必行.

近年來,已有諸多學者進行關于芘降解條件優(yōu)化的實驗.孫凱等[4]從長期受 PAHs污染的植物體內(nèi)分離篩選出了兩株能以芘為唯一碳源和能源的內(nèi)生細菌BJ03和BJ05,并驗證了添加C、N源能夠有效的提高兩株菌的生長速率,加速對芘的降解;段燕青等[5]通過實驗證明了米曲霉以芘為單基質(zhì)代謝時,降解率為33%.一些學者對菌株的選擇更地域化,Patel等[6]驗證了海洋微藻集胞藻對芘的降解率可達到36%;Obayori等[7]則首次從撒哈拉以南非洲地區(qū)環(huán)境中篩選出了 3株高芘降解率的假單胞菌.

共代謝作為一種獨特的代謝方式,可能使某些難降解有機污染物被徹底降解[8].共代謝過程中為保證微生物的生長,需從一級基質(zhì)獲得碳源和能源,同時為保證較高的共代謝降解率,需要控制一級基質(zhì)與二級基質(zhì)的濃度比.已有研究[9]得出共代謝底物葡萄糖與目標污染物丁基黃藥的質(zhì)量比為4:1時能達到較好的降解效果.因此,選取促進微生物降解的共代謝基質(zhì)并探索最佳降解條件的優(yōu)化工作就顯得尤為重要.

響應面方法RSM是一種尋找多因素系統(tǒng)中最佳條件的數(shù)學統(tǒng)計方法,是數(shù)學方法和統(tǒng)計方法結合的產(chǎn)物,已被廣泛應用到微生物培養(yǎng)基優(yōu)化中,但以響應曲面法來優(yōu)化芘共代謝降解條件的研究比較少.王欣等[10]利用響應面法對乙酰甲胺磷UV-TiO_2/類Fenton光催化降解過程進行了優(yōu)化,驗證值達到了 99%.尹亮[11]在混合菌群共培養(yǎng)對偶氮染料的協(xié)同脫色及降解的研究中,運用響應面設計法對共代謝脫色中的 3個主要因素葡萄糖、氯化銨、染料濃度進行了優(yōu)化,尹亮的研究中雖然其使用了響應面法進行了優(yōu)化,但較少的外源研究對象使得實驗結果具有局限性.當共代謝降解目標污染物時,選取的共代謝底物不同、濃度不同都將對共代謝效果產(chǎn)生不同影響,因此選用響應面優(yōu)化分析多種共代謝底物對降解率的影響,可有效提高微生物對難降解有機物的降解率,為治理 PAHs污染土壤提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 菌株來源

本研究從天津濱海濕地石油污染地區(qū)采集土壤樣品,采用定時定量轉(zhuǎn)接、間歇式逐步提高PAHs濃度的方法,通過”土壤菌懸液制備-初篩-保存混合菌及分離純化-復篩-保存菌株”的步驟,獲得了一株可以在低溫高鹽條件下降解 PAHs芘的單菌株 DYC-1.經(jīng)鑒定為紅球菌.現(xiàn)保存于中國科學院微生物保藏中心.

1.2 藥品與試劑

所使用的主要藥品試劑:芘、菲(分析純,日本TCL公司);芴、鄰苯二甲酸、鄰苯二酚(分析純,美國Sigma公司);水楊酸、葡萄糖、聯(lián)苯、醋酸鈉(分析純,國藥集團化學試劑北京有限公司);酵母粉(分析純,OXOID公司);正己烷、乙腈、丙酮(分析純,美國J.T.Baker公司).

1.3 實驗方法

1.3.1 單因子實驗 在濃度為 20mg/L的芘無機鹽液體培養(yǎng)基中分別加入 100mg/L葡萄糖、芴和菲,50mg/L鄰苯二甲酸、水楊酸、鄰苯二酚、聯(lián)苯、醋酸鈉和酵母膏[12-19],然后接入5%菌懸液,同時設置不接菌對照和不添加共代謝底物對照,10℃恒溫搖床上110r/min培養(yǎng) 10d,每個處理做3個重復,采用高效液相色譜法測芘降解率.

1.3.2 響應面優(yōu)化

(1) Plackett-Burman(PB)實驗設計

PB實驗法能夠從眾多的自變量中快速、有效地篩選出最為重要的影響因子[20].因此,在單因素實驗基礎上對共代謝條件下降解芘的培養(yǎng)基中5種共代謝基質(zhì)進行全面考察,這5種共代謝基質(zhì)分別是:葡萄糖、水楊酸、鄰苯二甲酸、鄰苯二酚和菲.選用N=11的PB實驗設計,并余留5個空項作誤差分析,確定眾因子相對于響應變量芘的降解率的顯著性.

采用 Design expert 8.0 軟件來設計PB實驗,PB實驗設計表如表1所示.

按照 PB實驗表配置各組培養(yǎng)基,共 12組,每組設置3個平行重復.同時配置不接菌及不添加共代謝底物作為對照組.每瓶培養(yǎng)基接入 5%菌懸液,10 ℃,110r/min 搖床培養(yǎng)10d,采用高效液相色譜法測芘降解率.將響應值輸入系統(tǒng)中,查看各因子的 P值,進行顯著性評價.當整體 P＜0.05說明實驗結果可信,實驗成功,P值最小的3個即為最顯著的 3個因子,同時要求這 3個因子P＜0.05.取這3個最顯著因子做下一步實驗.

表1 PB實驗因素及水平Table 1 Experimential factors and levels of Plackett-Burman

(2)最陡爬坡實驗

PB實驗中獲得了對響應值影響最為顯著的3個因子,對這3個因子做爬坡實驗,設置5個梯度,按照實驗要求配置培養(yǎng)基,每個梯度3個平行重復,同時配置不接菌及不添加共代謝底物作為對照組.每瓶培養(yǎng)基接入 5%菌懸液,10 ℃, 110r/min搖床培養(yǎng) 10d,采用高效液相色譜法測芘降解率,最終確定后續(xù)響應面實驗中3因子的濃度范圍,確定中心組合法的中心點.

(3)響應面實驗

確定本研究的3個主要影響因素:葡萄糖、水楊酸、菲.選用響應面分析法的 Box-Behnken實驗,采用3因素3水平的響應面分析,設計了共17組實驗,每個梯度3個平行重復,同時配置不接菌及不添加共代謝底物作為對照組.每瓶培養(yǎng)基接入 5%菌懸液,10℃ ,110r/min 搖床培養(yǎng)10d,采用高效液相色譜法測芘降解率.

1.3.3 優(yōu)化驗證實驗 為考察優(yōu)化共代謝培養(yǎng)基后,目標污染物的降解率及菌株生物量之間的關系,分別對投加最佳共代謝底物配方前后的菌株DYC-1生物量和菌株DYC-1對芘的降解率進行測定.將菌株DYC-1(接菌量為5%)分別接種于含有 20mg/L芘的基礎無機鹽培養(yǎng)基和投加了最佳共代謝底物配方的無機鹽培養(yǎng)基中,10℃恒溫搖床上 110r/min培養(yǎng) 10d.菌株生物量測定采用光密度法,每24h取發(fā)酵液進行分析,以MSM培養(yǎng)基作為空白對照,于600mm下用紫外分光光度計測定發(fā)酵液的吸光值來表征菌株生物量.菌株對芘的降解率的測定方法同1.3.1.

2 結果與討論

2.1 單因子實驗

本實驗室先前的研究已獲取了紅球菌DYC-1在降解芘的最優(yōu) pH值(8)、初始濃度(20mg/L)、搖床轉(zhuǎn)速(110r/min)及接菌量(5%),即菌株在低溫 10 ,℃鹽度為 2%的條件下能達到較高的降解率.為了進一步提高降解率,現(xiàn)考察葡萄糖、水楊酸、鄰苯二酚、鄰苯二甲酸、醋酸鈉、酵母、聯(lián)苯以及菲、芴作為外加碳源對芘降解率的影響.其中,CK1為不接菌且不加共代謝底物的對照,CK2為接菌但不加共代謝底物的對照.

圖1 不同共代謝底物對芘降解率的影響Fig.1 Effect of different cometabolizing substrates on pyrene degradation rate

結果表明,在不同共代謝底物存在時菌株DYC-1的降解率不同.葡萄糖、菲、鄰苯二甲酸、水楊酸、鄰苯二酚5種共代謝物質(zhì)都可以促進芘的微生物降解,其中水楊酸對降解的促進作用最好,究其原因,可能是水楊酸是芘的中間代謝產(chǎn)物之一,能誘導相關酶的表達,從而促進芘的降解,鞏宗強等[21]、鐘鳴等[17]、周樂等[22]也有類似報道;同樣,鄰苯二酚和鄰苯二甲酸也是芘的中間代謝產(chǎn)物,同樣促進降解;葡萄糖作為速效碳源,是微生物生長所需的營養(yǎng)物質(zhì),它的存在可以促進菌株的生長繁殖,加強菌體生命活動,從而促進芘的降解,胡鳳釵等[19]向分枝桿菌 N12分別投加了0～5000mg/L的葡萄糖作為共代謝物質(zhì),發(fā)現(xiàn)均促進了菌株 N12對芘的降解,王蕾等[18]的研究也獲得了相似結論,但這與鐘鳴等[17]的研究相反,這可能是葡萄糖會抑制鐘鳴研究的寡養(yǎng)單孢菌屬對芘的優(yōu)先利用或相關降解酶的活性表達;實驗中選擇在結構上與芘相似,且較易降解的PAHs化合物菲作共代謝底物也取得了很好的效果,降解率為32.78%,何晶晶[23]也有類似報道,且根系土壤內(nèi)芘的降解在有菲的存在下得到了促進.而聯(lián)苯、醋酸鈉以及酵母粉對菌株降解芘的促進效果不明顯,甚至加入共代謝底物芴會抑制芘的微生物降解,對照CK1芘的降解率僅為0.72%,可以忽略不計.

可見不同的共代謝產(chǎn)物,對體系中芘降解率會產(chǎn)生一定程度的影響,共代謝底物的選擇是應用共代謝作用降解芘的關鍵問題之一[24].

2.2 響應面優(yōu)化

2.2.1 PB實驗結果 通過單因子實驗確定5種共代謝底物——葡萄糖、水楊酸、鄰苯二甲酸、鄰苯二酚及菲,設計PB實驗確定對響應值降解率影響顯著的因子,對每一個影響因素分別取高低兩個水平進行實驗設計,實驗設計及結果見表2.

表2 PB實驗表Table 2 Experimental table of Plackett-Burman

帕累托圖(Pareto Chart)分析如圖2,確定三個最顯著的因子分別為:葡萄糖 0.0004、水楊酸0.0122以及菲0.0012.PB.實驗整體P＜0.05,且葡萄糖、水楊酸及菲三因子P＜0.05,說明實驗結果可靠,實驗成功,因此通過PB實驗確定對芘降解率影響顯著的三個因子分別為葡萄糖、水楊酸及菲.

圖2 顯著因子對應帕累托圖Fig.2 Pareto Chart of each significant factor

由PB實驗結果分析得到一次回歸方程:

式中:Y代表降解率,A、B、C、D、E分別代表葡萄糖、水楊酸、鄰苯二甲酸、鄰苯二酚、菲濃度.該方程決定系數(shù)R2=0.9419,表示方程回歸良好.

2.2.2 最陡爬坡實驗 根據(jù) PB實驗中各因子的變量系數(shù)來決定最陡爬坡實驗的爬坡方向,回歸方程中葡萄糖、水楊酸及菲這3個因子的系數(shù)都為正,即都呈現(xiàn)正效應,所以在最陡爬坡實驗中,3個因子的濃度都應增加,最陡爬坡實驗設計及結果如表3所示.

表3 最陡爬坡實驗設計及實驗結果Table 3 Design and results of steepest ascent experiment

由表3可知,實驗4中響應值芘降解率最高,且隨著步長增加,降解率降低,因此最優(yōu)點在此附近,因此共代謝培養(yǎng)基以葡萄糖(200mg/L)、水楊酸(100mg/L)、菲(200mg/L)作為Box-Behnken實驗的中心點進行響應面實驗對共代謝培養(yǎng)基進一步優(yōu)化.

2.2.3 響應面實驗 鄰苯二甲酸、鄰苯二酚保持在最高水平不變,根據(jù)最陡爬坡實驗得到的中心點對葡萄糖、水楊酸、菲進行中心組合實驗(5個中心點),一共17組實驗,實驗結果以PAHs芘的降解率作為表征參數(shù),實際結果和預測結果見表4.

由表4可以看出,實際觀測值與預測值的擬合程度較好.由表5可以看出,模型整體P＜0.0001,表明此回歸模型顯著.同時模型回歸系數(shù)R2=0.9999,調(diào)整回歸系數(shù) R2adj.= 0.9997,預測回歸系數(shù) R2pred.=0.9981,表明菌株對芘的降解率的實測值與預測值之間具有較好的擬合度,這從表4也可以看出,因此所選取模型的擬合度較好,可用于分析和預測響應值芘降解率的變化,指導實驗優(yōu)化.同時模型的F值為6172.75,失擬項僅為21.42,較高的F值對應不顯著的失擬值,表示模型的擬合度較好.同時,在選取的自變量范圍內(nèi),模型對實驗數(shù)據(jù)的擬合程度較好,可以用于對各響應值之間變化以及相互關系的分析.

表4 Box-Behnken實驗設計結果Table 4 Experimental design and results of Box-Behnken optimization experiments

實驗結果的方差分析見表 5.從表 5的分析結果可以看出,葡萄糖(A)、水楊酸(B)和菲(C)的P值都小于0.0001,它們對模型的影響極其顯著,這表明葡萄糖、水楊酸、菲是菌株DYC-1降解芘過程中的重要影響因素;其交互項系數(shù)AB和AC的P值分別為0.0042和小于0.0001,均小于0.05,這表明在菌株對芘的降解過程中,葡萄糖與水楊酸、葡萄糖與菲之間的交互作用明顯;根據(jù)回歸分析所得到的反映模型的二階響應曲面擬合方程如下所示:

響應面實驗3D圖與等高線圖如圖3所示,從圖中可明顯看出,模型開口向下,表明試驗結果有最大值.由等高線圖可知,最大值落在實驗范圍內(nèi).

表5 Box-Behnken實驗設計結果分析Table 5 Results of regression analysis of the Box-Behnken design for optimization of pyrene degradation

圖3 -a 葡萄糖和水楊酸對芘降解率影響的響應面和等高線Fig.3 -a Response surface and contour plots of the effect of glucose and salicylic acid on degradation of pyrene

圖3 -b 葡萄糖和菲對芘降解率影響的響應面和等高線Fig.3 -b Response surface and contour plots of the effect of glucose and phenanthrene on degradation of pyrene

通過響應面模型的擬合分析,得到降解率的最佳共代謝培養(yǎng)基配方為:葡萄糖 225.83mg/L,水楊酸 112.10mg/L,菲 198.06mg/L,此時降解率可達到 50.69%,相對于不加共代謝底物的27.55%提升了23.14%.

2.3 優(yōu)化驗證實驗結果

圖4 菌株DYC-1的生長曲線Fig.4 Growth curve of sp. DYC-1

菌株DYC-1分別在基礎培養(yǎng)基和最佳培養(yǎng)基中的菌株生物量和芘降解率測定結果如圖4、圖5所示,菌株DYC-1的生長同步于對芘的降解,投加最佳共代謝培養(yǎng)基配方之后,菌株的生物量有所提高,進入對數(shù)生長期的時間也有所提前,與此同時,菌株對芘的降解率大幅提升.因此,通過響應面法獲得的最佳共代謝培養(yǎng)基在降解目標污染物芘時,具有極大的優(yōu)勢.

圖5 菌株DYC-1對芘的降解率Fig.5 Pyrene degradation rate of sp. DYC-1

3 結論

3.1 在單因子實驗的基礎上,將響應面法應用于優(yōu)化低溫耐鹽芘降解菌的共代謝條件.單因子實驗考察了9種物質(zhì)作為外加碳源對芘降解率的影響,選取能夠促進芘降解的共代謝底物進行下一步實驗,通過 Plackett-Burman實驗設計篩選出影響紅球菌DYC-1降解PAHs芘的3個顯著影響因子為葡萄糖、水楊酸和菲.三者都是菌株 DYC-1降解芘過程中的重要影響因素,且葡萄糖與水楊酸、葡萄糖與菲的相互作用對芘的降解影響顯著.

3.2 應用響應面法分析優(yōu)化設計芘的最佳共代謝培養(yǎng)基條件為:葡萄糖 225.83mg/L,水楊酸112.10mg/L,菲198.06mg/L,在此條件下培養(yǎng)10d,芘降解率可達到50.69%,相對于不加共代謝底物時27.55%的降解率提升了23.14%.

3.3 回歸分析和擬合驗證實驗表明回歸模型顯著,方法可行.

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Optimization for pyrene bacteria cometabolism degradation under the low temperature and high salt environment through response surface.

DIAO Shuo, WANG Hong-qi*, WU Xiao-xiong, ZHAO Yi-cun
(College of Water Sciences, Beijing Normal University, Beijing 100875, China). China Environmental Science, 2017,37(1)：345～351

In order to enhance pyrene bacteria cometabolism degradation rate under low temperature and high salt environment, under the circumstances of learned optimal pH, initial concentration of pyrene, shaking rates of rocking bed, inoculating dosage, Plackett-Burman Design was conducted and glucose, salicylic acid and phenanthrene were identified as main factors. These factors were approached to optimal region by steepest ascent design. Then optimal degradation condition(glucose, 225.83mg/L; salicylic acid, 112.10mg/L; phenanthrene, 198.06mg/L) was established by Box-Behnken design and reponse surface analysis. Degradation rate under the optimal consition was 50.69% after 10days, enhanced 23.14% compare to the condition of without cometabolism degradation substrate. Experimental results also showed that the method of optimization for bacteria cometabolism degradation is reasonable and feadible.

response surface methodology(RSM)；cometabolism；optimization；degradation bacteria

X172

A

1000-6923(2017)01-0345-07

刁 碩(1992-),女,山東荷澤人,北京師范大學水科學研究院碩士研究生,從事污染土壤修復與治理研究.

2016-03-21

國家自然科學基金面上項目(41372232);國家“863”項目(2013AA06A205);中國博士后科學基金第54批面上資助項目

* 責任作者, 教授, whongqi310@sohu.com