石仝雨, 繆偉偉, 王志雄,3*

1.上海理工大學醫(yī)療器械與食品學院, 上海 200093; 2.日本國立大阪大學, 大阪 565-087, 日本; 3.上海健康醫(yī)學院藥學院, 上海 200093

超臨界二氧化碳法萃取桑葉中總黃酮工藝研究

石仝雨1, 繆偉偉2,3, 王志雄1,3*

1.上海理工大學醫(yī)療器械與食品學院, 上海 200093; 2.日本國立大阪大學, 大阪 565-087, 日本; 3.上海健康醫(yī)學院藥學院, 上海 200093

為了探索超臨界二氧化碳法萃取桑葉中總黃酮提取的最佳方案，利用超臨界二氧化碳萃取技術(shù)，依次用響應(yīng)面法考查萃取壓強、萃取溫度、萃取時間以及夾帶劑無水乙醇的流速對桑葉中總黃酮得率的影響，優(yōu)選出桑葉黃酮類化合物在使用超臨界萃取裝置時提取的最佳工藝。結(jié)果顯示：響應(yīng)面法的最佳萃取條件為：壓力26 MPa，溫度50℃,時間3 h，流速2.5 mL/min,最佳條件下總黃酮得率為6.21%±0.05%。

桑葉;超臨界萃取技術(shù);總黃酮得率;曲面相應(yīng)法

桑葉是我國傳統(tǒng)中藥之一，為桑屬(Morus)植物桑樹(MorusalbaL.)的葉子，載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，中醫(yī)又稱“神仙草”、“鐵扇子”。 桑葉性味苦甘、寒，甘可以益血，寒可以涼血。甘寒相合，故下氣而益陰，又能止咳，有補益之功。主治風熱感冒、肺熱燥咳、頭暈頭疼、目赤暈花等癥[1,2]，因此桑葉作為一種治療藥，其化學成分以及藥理作用成為當今研究者討論的重點[3]。桑葉中主要的活性物質(zhì)是桑葉黃酮，許多學者圍繞桑葉黃酮的開發(fā)和利用做了大量工作，當前萃取桑葉中總黃酮的方法主要有水浸法、回流提取法、超聲提取法和索氏提取法等[4～6]。相對于其他萃取方法而言，超臨界二氧化碳流體(supercritical CO2fluid extraction，SFE-CO2)萃取方法是一種新興技術(shù)，目前在國際上應(yīng)屬于最先進的物理萃取分離技術(shù)；該方法主要利用高滲透性和高溶解能力來提取分離成分，其用到的溶劑是二氧化碳，以二氧化碳作為溶劑，與一般的萃取方法相比，超臨界二氧化碳萃取在速度上和范圍上更占優(yōu)勢。目前已有多種中藥材中的黃酮類物質(zhì)采用超臨界CO2萃取的相關(guān)報道[7]，但目前尚無采用相應(yīng)曲面方法優(yōu)化桑葉黃酮提取工藝的報道。本文運用響應(yīng)面法分析超臨界萃取中桑葉總黃酮提取的關(guān)鍵因素，并獲得其最佳提取條件，以期為進一步開發(fā)和利用桑葉中的總黃酮成分提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料、藥品與耗材 桑葉干粉(日本野姬和株式會社)；蘆丁標準品(上海金穗生物公司)，含量不低于98%；無水乙醇、九水硝酸鋁(上海金穗生物)、氫氧化鈉、亞硝酸鈉(上海金穗生物)均為分析純；二氧化碳(純度99.999%)；0.45 μm過濾器；石英比色杯。

1.1.2 儀器 紫外可見光分光光度計(756P上海光譜儀器有限公司制造)；超臨界二氧化碳流體萃取設(shè)備(美國Waters公司)；恒溫水浴箱(CV-420，上海恒一精密儀器有限公司)；超純水系統(tǒng)(RE-100，上海本昂科學儀器有限公司)；電子天平(FA2104，上海舜宇恒平)。

1.2 工藝線路

稱重干燥后的桑葉粉2 g，裝入超臨界萃取裝置的萃取釜中，以無水乙醇作為夾帶劑。在本試驗中通過改變相關(guān)的萃取參數(shù)，完成相關(guān)萃取，獲得總黃酮提取液，并且計算得總黃酮提取率。具體步驟：桑葉→干燥→稱重→超臨界萃取→總黃酮提取液→測定總黃酮提取率。

1.3 標準曲線的繪制

精確稱取干燥恒重的蘆丁標準品5.0 mg 置于50 mL 容量瓶中，用無水乙醇超聲溶解，搖勻，定容至50 mL，使之成為濃度為100 μg/mL 的蘆丁標準品溶液，作為貯備液備用。精密量取上述溶液0、1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL，置于10 mL 容量瓶。加5%亞硝酸鈉水溶液0.3 mL，放置6 min，加10%硝酸鋁0.3 mL，混勻后放置6 min，加入1%氫氧化鈉溶液4 mL，混勻，放置15 min后，加無水乙醇定容至10 mL，靜置15 min，等待顯色后用紫外可見分光光度計，根據(jù)相關(guān)文獻在510 nm波長處測吸光度，試劑空白為參比，蘆丁標準品的濃度為橫坐標，510 nm 處的吸光度為縱坐標作圖,繪制標準曲線[8,9](圖1)。

圖1 蘆丁標準溶液曲線Fig.1 Rutin standard solution curve.

利用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，算出回歸方程為：y=0.0123x，R2=0.9994。

1.4 總黃酮提取率計算

量取1 mL桑葉提取液于10 mL容量瓶，按繪制蘆丁標準曲線時的步驟顯色，直接于510 nm 波長處測定吸光度，根據(jù)相關(guān)公式，計算總黃酮提取率。

C:提取液總黃酮的濃度(mg/mL)；V:提取液定容后的體積(mL)；m:稱取得樣品桑葉干粉的質(zhì)量(mg)。

1.5 單因素實驗

根據(jù)相關(guān)文獻[10～12]和美國Waters公司二氧化碳萃取儀器的使用說明，得到影響調(diào)整總黃酮得率的主要因素有萃取溫度、壓強、萃取時間和夾帶劑流速。在本研究采用這4個因素水平進行單因素試驗，分別考察各因素對桑葉黃酮得率的影響，具體各因素水平設(shè)置如表1所示。

表1 單因素試驗因素及水平

1.6 響應(yīng)曲面實驗設(shè)計

按照最佳單因素條件，根據(jù)中心組合(Box-Behnken)實驗設(shè)計原理采用4因素3水平的響應(yīng)曲面法對各個因素的顯著性和交互作用進行分析，優(yōu)化總黃酮得率結(jié)果，對桑葉提取總黃酮工藝條件進行分析和優(yōu)化。具體因素編碼及因素水平見表2。

表2 響應(yīng)面實驗因素編碼及因素水平

1.7 實驗數(shù)據(jù)分析

通過SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析處理，通過Design expert 8.0.6軟件進行響應(yīng)面試驗的設(shè)計和統(tǒng)計分析，采用Sigmaplot 10.0和Excel 2007作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果分析

根據(jù)表1中的單因素試驗因素及水平所得結(jié)果見圖2。萃取溫度45℃、提取時間2.5 h、萃取壓強為35 MPa和夾帶劑流速為2.5 mL/min為各單因素的最大響應(yīng)值。故在下文中以此為基礎(chǔ)條件，設(shè)計因素水平，進行提取工藝的優(yōu)化。

2.2 響應(yīng)曲面實驗結(jié)果

2.2.1 黃酮得率條件擬合 根據(jù)前期實驗分析,選取萃取時間、萃取壓強、夾帶劑流速、萃取溫度4 個因素,運用Design-Expert 8.0.6.0 軟件設(shè)計兩水平因子實驗,篩選顯著因素;接著通過爬坡實驗逼近最大響應(yīng)區(qū);然后運用Design-Expert 8.0.0.6軟件設(shè)計中心組合實驗,建立提取模型,預(yù)測最佳提取條件和黃酮得率[13～15]。因素編碼及因素水平見表3。

圖2 單因素試驗結(jié)果Fig.2 Results of single factor experiment.A:萃取壓力對總黃酮提取率的影響; B:萃取溫度對總黃酮提取率的影響; C:夾帶劑流速對總黃酮提取率的影響; D:萃取時間對總黃酮提取率的影響

實驗號A萃取壓力B萃取溫度C萃取時間D夾帶劑流速總黃酮得率(mg/mL)110106．162-10-105．733-10015．77401106．1850-1106．13610015．87701-105．89801015．949-10106．0010-1-1005．791111006．021200116．101300005．931400005．9615010-15．911610-105．8817-100-15．71180-1015．891900-115．8320100-15．8921-11005．83220-10-15．9323001-16．062400-1-15．83250-1-105．84261-1005．90

由表4 可知,萃取時間和萃取壓力對黃酮得率影響極顯著(P<0.01)，溫度、流速對黃酮得率影響不顯著(P>0. 05)。比較各因素的P值，可知各單因素對黃酮得率的影響程度大小依次為：萃取時間>萃取壓力>萃取溫度>夾帶劑流速。

2.2.2 擬合模型的建立 從圖3A和圖3B可知，實驗?zāi)Ｐ偷母鳉埐罨痉植冀Y(jié)果表明，經(jīng)方法分析對總黃酮得率建立的實驗?zāi)Ｐ蜆O在同一條直線上，與失擬分析相一致，圖3B的殘差預(yù)測也極顯著(P<0.01)。從模型分析顯著性可以明確看到該實驗?zāi)Ｐ偷谋憩F(xiàn)各殘差點在零點直線兩側(cè)不均勻分布，通過兩個的建立是具有可靠性的。失擬項P=0.479 4>0.05，不顯著；失擬項圖對比可知，純誤差值為0.000 45，數(shù)值比較小，通過相關(guān)數(shù)據(jù)的分析可知該實驗?zāi)Ｐ偷臄M合程度較好，試驗誤差較小，從分析值來看，分析本模型具有重要的作用。

模型方程回歸系數(shù)及其顯著性檢驗見表4，結(jié)果表明：模型一次項A、C顯著，B、D 不顯著；二次項A2、C2、D2顯著；其余各項不顯著。因此各個具體試驗因素與響應(yīng)值都不是線性關(guān)系。

通過軟件對于實驗?zāi)Ｐ瓦M行分析，并且采用Y作為因變量，采用R1為總黃酮提取量，A、B、C、D分別代表萃取壓力、萃取溫度、萃取時間、流速。得到回歸方如下：

表4 4因素3水平實驗方差分析表

圖3 總黃酮提取率殘差分布(A)與預(yù)測分布(B)示意圖Fig.3 Residual(A) and predict distribution(B) diagram of flavonoids extraction yield.A.殘差分布示意圖;B.預(yù)測分布示意圖

R1= 5.95+0.066A+0.019B+0.14C+5.833E-003D-5.000E-0.03AB+2.500E-0.03 AC-0.020AD+0.018BC+5.000E-0.03BD+2.500E-0.03CD+0.088A2+0.014 B2+0.072 C2-0.043 D2

2.2.3 響應(yīng)曲面結(jié)果分析 通過模型方程所作的響應(yīng)曲面圖及其等高線，結(jié)果見圖4。采樣時間比對總黃酮得率的影響最顯著，其次是萃取壓力，并且各個因素之間的交互作用并不顯著。

圖4 各因素影響桑葉黃酮得率的響應(yīng)曲面Fig.4 Response surface of each factor on flavonoids yield in mulberry leaves.A:提取率=f(A,B)的響應(yīng)面; B:提取率=f(A,C)的響應(yīng)面; C:提取率=f(A,D)的響應(yīng)面; D:提取率=f(B,C)的響應(yīng)面; E:提取率=f(C,D)的響應(yīng)面; F:提取率=f(B,D)的響應(yīng)面

2.3 最優(yōu)提取條件的選擇

根據(jù)Design-Expert 8.0.5 軟件可以優(yōu)化最佳方案，最佳的提取率方案為壓力26 MPa，溫度50℃，時間3 h，流速2.5 mL/min,預(yù)期的總黃酮得率6.22%。

為了驗證該模型的準確性，在不同的提取條件下進行了6組驗證實驗(均選擇在實驗的范圍之內(nèi)，3組實驗按照得到的最優(yōu)條件進行，另外3組隨機選擇)。驗證實驗的實驗值與預(yù)測值的相關(guān)系數(shù)都大于0.98，并且差異不顯著(P>0.05)，證明該模型能較好地用于桑葉提取總黃酮物質(zhì)的的預(yù)測及評價。最優(yōu)實驗條件下得到的總黃酮提取率結(jié)果為6.21%±0.05%，實驗結(jié)果與Design-Expert 8.0.5軟件的優(yōu)化理論預(yù)測值比較誤差為4.6%，可以證明采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化得到的提取條件參數(shù)基本準確可靠，具有一定的實用價值。

3 討論

本試驗采用響應(yīng)面法通過構(gòu)建二次回歸模型,建立了總黃酮提取率和相關(guān)的萃取因素之間的方程，根據(jù)響應(yīng)曲面對總黃酮的提取影響因素分析得到，即萃取時間>萃取壓強>萃取溫度>夾帶劑流速，最后采用方程確定最佳提取工藝最優(yōu)工藝為萃取壓強為26 MPa，萃取溫度為50℃，萃取時間為3 h，流速為2.5 mL/h，此條件下，總黃酮提取率可達6.21%。

現(xiàn)在對于桑葉中的總黃酮提取方法主要有回流提取法、超聲提取法、微波提取法和索氏提取法[13～15]等。其中回流提取法操作方法相對復(fù)雜，并且由于不同種類的桑葉總黃酮含量和具體成分不同，需要不斷改變萃取劑和液料比得到最佳的實驗條件，工藝流程相對復(fù)雜。超聲提取法、微波提取法加劇了體系中分子的碰撞頻率，使黃酮類分子容易從桑葉內(nèi)部擴散到萃取溶劑中，但是會使桑葉中的細胞膜和細胞壁破裂，使提取溶劑進入細胞，溶解并釋放出細胞內(nèi)物質(zhì)，導(dǎo)致植物細胞內(nèi)部分黃酮類物質(zhì)產(chǎn)生化學反應(yīng)分解，降低總黃酮提取率。超聲提取法會產(chǎn)生比較明顯的超聲-熱效應(yīng)，但是如果超過了最適合的值之后，則有可能導(dǎo)致一些熱敏感的黃酮物質(zhì)在提取過程中分解或產(chǎn)生異構(gòu)化反應(yīng)，從而降低了總黃酮得率。索氏提取法需要消耗比較多的時間，同時由于桑葉中的黃酮類物質(zhì)極性較大，故采用索氏提取法提取桑葉總的總黃酮，其總黃酮得率普遍較低。

相對而言，超臨界CO2萃取方法具有能夠在較低溫度條件下實現(xiàn)桑葉中總黃酮物質(zhì)的高效提取、萃取液中保留了多種具有生理活性的總黃酮成分、萃取物無有機溶劑殘留、流程簡單、操作相對簡單、可保護桑葉總黃酮中熱敏性物質(zhì)不受破壞等特點。而本方法具有準確、可靠、可重復(fù)性強等特點，為提高桑葉中總黃酮的提取率提供了參考價值。

實驗結(jié)果分析，采用CO2超臨界技術(shù)萃取桑葉中的黃酮類物質(zhì)，提取溫度和壓力是需要考慮的重要因素之一[13～16]。這是因為提高萃取溫度和壓強雖然有利于生物活性物質(zhì)從植物細胞中釋放出來，但是如果超過了最適合的值之后，則有可能導(dǎo)致一些壓敏、熱敏感的黃酮物質(zhì)在提取過程中分解或是產(chǎn)生異構(gòu)化反應(yīng)[17]。目前已經(jīng)有研究表明，在高溫高壓條件下總黃酮中的部分物質(zhì)的異構(gòu)化進程大大地加快[18]。萃取時間也是影響黃酮提取率的一個重要因素，在一定的萃取溫度、萃取壓力下，實驗得到的桑葉總黃酮提取率隨著萃取時間的增加而增加，但是增加萃取時間會增加夾帶劑的消耗，同時增加儀器的損耗，故設(shè)定萃取時間需要綜合考慮，以獲得更好的經(jīng)濟效應(yīng)。相比其他參數(shù)而言，夾帶劑流速對黃酮得率影響最不顯著(P=0.528 4)，故在實際的生產(chǎn)中，可以適當降低夾帶劑流速，降低生產(chǎn)成本。

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Study on Supercritical Carbon Dioxide Extraction of Total Flavonoids from Mulberry Leaves

SHI Tongyu1, MIAO Weiwei2,3, WANG Zhixiong1,3*

1.SchoolofMedicalInstrumentandFoodEngineering,UniversityofShanghaiforScienceandTechnology,Shanghai200093,China; 2.OsakaUniversity,Osaka565-0871,Japan; 3.SchoolofPhamacy,ShanghaiUniversityofMedicineandHealthScience,Shanghai200093,China

To explore the optimal plan of extracting total flavone from mulberry leaves through the method of supercritical carbon dioxide, this research utilized supercritical carbon dioxide extraction technology and applies response surface method to examine the influence of extraction pressure, extraction temperature, extraction time and flow velocity of entrainer absolute ethyl alcohol on yield of total flavone in mulberry leaves, and selected the optimal technology that mulberry leaves flavonoids extract using supercritical fluid extraction device. The results indicated that, the optimal extraction condition of response surface method was as follows: pressure in optimal extraction plan was 26 MPa, temperature was 50℃, time was 3 hours, and flow velocity was 2.5 mL/min. The predicted total flavone yield under optimal condition was 6.21%±0.05%.

mulberry; supercritical carbon dioxide extraction; flavonoid yield; corresponding method of curved surface

2016-10-18; 接受日期：2016-12-01

國家自然科學基金項目(81402030)資助。

石仝雨，碩士研究生,研究方向為生物醫(yī)學工程。E-mail:styshlg@126.com。*通信作者：王志雄,高級工程師,研究方向為生物醫(yī)學工程。E-mail:wangzx@sumhs.edu.cn

10.3969/j.issn.2095-2341.2017.01.13